本發明涉及一種脫細胞羊膜粉的制備方法。
背景技術：
：羊膜是胎盤的最內層，包裹著羊水的光滑的、無血管、神經及淋巴、具有彈性一層生物半透膜；羊膜中存在ⅰ、ⅲ、ⅳ、ⅴ、ⅶ型膠原和纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等多種蛋白成分及一些生長因子，如表皮細胞生長因子(egf)、成纖維細胞生長因子(fgf)、轉化生長因子(tgf)等，這些生長因子能促進上皮細胞的增殖、遷移、分化，增強上皮細胞的粘附性，促上皮化，減輕瘢痕；羊膜可促進結膜干細胞分化為結膜上皮細胞、促進結膜上皮向角膜上皮轉化，促進角膜緣干細胞增殖及提供一個有助于其生長的微環境，促進角膜上皮細胞移行、促進角膜基質膠原纖維增生、抑制結膜下纖維組織增生、抑制新生血管增生，具有抗炎、抗菌等功能；羊膜上皮細胞不表達hla-a、b、c、dr抗原或β2微球蛋白，表達ib抗原、限制ia抗原，這些特點使羊膜表達低抗原性；羊膜中含有多種膠原及蛋白成分，可以為創面愈合提供豐富的營養支持；羊膜的生物學特性和醫學研究均證明羊膜作為敷料應用于創面時相比其他很多人工合成敷料具有明顯的優勢；人羊膜上皮細胞不表達hla-a、b、c、dr抗原或β2微球蛋白，表達ib抗原、限制ia抗原，這些特點使羊膜表達低抗原性；羊膜的結構與羊膜中的膠原和多種活性物質不僅可以使羊膜發揮較好的屏障作用，而且還具有抗菌消炎、促愈合、減輕攣縮等作用；羊膜內的膠原、蛋白成分和活性因子，在作為敷料應用于傷口時營養成份的利用和活性因子的釋放率可以加快創面愈合速度和提高創面愈合質量。但新鮮生物羊膜為單層結構，厚度薄，易卷曲折疊，滑動脫落，有效作用時間短，在應用創面時會有一定局限性；人們對新鮮羊膜做處理使其在保留天然優良性能的同時改良缺陷和不同，使其具有更大價值。專利cn103114073b公布了一種人羊膜的脫細胞方法，采用表面活性劑tritonx-100、胰脂酶、dna酶結合作用，屬于化學與生物方法相結合的較徹底的脫細胞方法，但這類方法形成會導致蛋白成分和生長因子的大量流失，可做為較理想的組織工程的支架材料，但作為敷料應用于創面時的作用會大大下降；專利cn200510046856.3公開了一種干燥活性羊膜的制備方法，可以將新鮮羊膜脫細胞后冷凍干燥，有延長了羊膜的保質期，隨取隨用的優點，但仍然是單層結構，厚度薄，質感脆，在不規則創面的應用上的適應性差。技術實現要素：本發明要解決的技術問題是克服現有的羊膜的脫細胞方法不夠溫和，同時具有抗原性和其他來源于供體的風險的缺陷，提供一種能適應不同創面的脫細胞羊膜粉的制備方法。為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案：1、一種脫細胞羊膜粉的制備方法,其特征在于，包括以下步驟：1)、將新鮮的羊膜清洗，去除表面血跡，剪成碎片；新鮮的羊膜清洗時使用無菌水、無菌鹽水或培養基；可將羊膜剪成面積為5×5cm的碎片，可以用無菌剪刀和鑷子，手術刀或切片機，也可以按用途更改尺寸；新鮮的羊膜取自新鮮的胎盤，可以是人源，也可以是動物源；2)、在4℃的振蕩器中用去離子水洗滌12～24小時,每4～6小時更換一次去離子水；3)、在4℃的振蕩器中用質量分數為0.1～2％的tritonx-100和氫氧化銨混合液洗滌1～3天，每天更換洗滌液；本步驟還可用細胞刮刀等器具輕刮羊膜表面后震蕩細胞等機械方法達到脫去羊膜上皮細胞的目的。4)、在4℃的振蕩器中用去離子水洗滌12～24小時,每4～6小時更換一次去離子水；然后用pbs洗滌12～24小時，每4～6小時更換pbs；5)、-80℃保存24小時后進行凍干，將泥漿狀支架置于一次性無菌平皿中，轉移至凍干機冷阱中預冷2～5小時，開啟真空凍干24～48小時，無菌收料；還可以采用將羊膜碎片放在無水乙醇或干冰中迅速冷凍，再放在冷凍干燥器中以-20℃凍干直至干燥的方法實現；6)、將羊膜碎片放入鋼桶中浸入液氮中預冷后，鋼桶放入冷凍研磨機中研磨頻率為40～80hz，研磨時間為20～60s，形成粒徑<250um的羊膜粉。7)、消毒后-80℃儲存備用。優選的，采用15～30kgy的γ射線輻照滅菌。進一步的，振蕩器的轉數為120～150rpm。進一步的，步驟3)中除tritonx-100和氫氧化銨的方法外，還可用細胞刮刀等器具輕刮羊膜表面后震蕩細胞等機械方法達到脫去羊膜表層上皮細胞的目的。進一步的，步驟5)中將冷凍后的羊膜碎片放入凍干機冷阱中預冷2-5小時，開啟真空凍干24～48小時。進一步的，步驟2)-7)中嚴格控制不高于4℃的低溫環境，凍干、研磨工藝過程中控制低溫環境以保護羊膜中的活性因子。進一步的，以步驟7)中的脫細胞羊膜粉末為中間產品，消化后制成可溶羊膜、進一步交聯后制成羊膜膠、噴霧、藥膏等其他形式添加到輔料、藥物中應用或直接應用于創面。進一步的，以步驟7)中的脫細胞羊膜粉末與膠原、透明質酸、殼聚糖等生物大分子聚合物及ppo、peo等合成聚合物或其他材料交聯應用于組織工程或其他領域。本發明與現有技術相比，具備如下優點：(1)本發明采用相對溫和的脫細胞方法對羊膜進行脫細胞并進行滅菌處理，避免了羊膜的免疫原性和其他來源于供體的風險，這使脫細胞后的羊膜在應用于人體時避免了免疫排斥的問題；(2)洗滌、脫細胞和研磨工藝過程中嚴格控制低溫環境，研磨時間短，減少過程中活性物質的損失，對羊膜中包括人表皮生長因子(egf)、人成纖維細胞生長因子(fgf)人肝細胞生長因子(hgf)、人血管內皮生長因子(vegf)、人神經生長因子(ngf)、胰島素樣生長因子(igf)等生長因子在內的各種活性物質進行有效的保護(如表一)，膠原蛋白等分子和生長因子等活性因子的保留比較充分，可以為創面愈合提供更有效的營養支持，其生長因子等活性物質可持續促上皮化，預防和減輕炎癥以及加速愈合；(3)與厚度薄，易卷曲與移動，在創面上作用時間短，且對不規則創面的應用上有一定的局限性的單層羊膜相比，所制得的冷凍羊膜粉及羊膜膠或噴霧，可以應用于不規則形狀和深度傷口的治療或添加到輔料、藥物中應用，適應性廣泛；(4)本發明制得的羊膜粉末粒徑小，更有利于創面利用膠原與蛋白小分子，為創面愈合提供更有效的營養支持，其生長因子等活性物質可持續促上皮化，加速創面愈合；抑制新生血管和纖維組織增生，減少瘢痕生成，增加愈合質量；(5)本發明制得的凍干羊膜可作為一種支架材料與膠原、透明質酸、殼聚糖等生物大分子聚合物及ppo、peo等合成聚合物或其他材料交聯應用于組織工程或其他領域。凍干脫細胞羊膜粉中含有豐富的膠原和各種生長因子，可作為制成護膚保養品的原材料使用。具體實施方式以下對本發明的優選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優選實施例僅用于說明和解釋本發明，并不用于限定本發明。一種脫細胞羊膜粉的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：1)、收集新鮮的人類胎盤，將羊膜從胎盤內側剝離，將新鮮的羊膜清洗，去除表面血跡，剪成碎片；新鮮的羊膜清洗時使用無菌水、無菌鹽水或培養基；可將羊膜剪成面積為5×5cm的碎片，可以用無菌剪刀和鑷子，手術刀或切片機，也可以按用途更改尺寸；新鮮的羊膜取自新鮮的胎盤，可以是人源，也可以是動物源；2)、在4℃的振蕩器中用去離子水洗滌12～24小時,每4～6小時更換一次去離子水；3)、在4℃的振蕩器中用質量分數為0.1～2％的tritonx-100和氫氧化銨混合液洗滌1～3天，每天更換洗滌液；本步驟還可以使用還可以采用輕刮羊膜表面配合震蕩羊膜等機械方法來實現脫細胞的目的；4)、在4℃的振蕩器中用去離子水洗滌12～24小時,每4～6小時更換一次去離子水；然后用pbs洗滌12～24小時，每4～6小時更換pbs；5)、-80℃保存24小時后凍干，將泥漿狀支架置于一次性無菌平皿中，轉移至凍干機冷阱中預冷2～5小時，開啟真空凍干24～48小時，無菌收料；此外，還可以采用將羊膜碎片放在無水乙醇或干冰中迅速冷凍，再放在冷凍干燥器中以-20℃凍干直至干燥的方法實現；6)、將羊膜碎片放入鋼桶中浸入液氮中預冷后，鋼桶放入冷凍研磨機中研磨頻率為40～80hz，研磨時間為20～60s，形成粒徑<250um的羊膜粉。7)、消毒后-80℃儲存備用。優選的，采用15～30kgy的γ射線或電子束輻照滅菌。脫細胞羊膜粉蛋白含量分析實驗：比色法來衡量總蛋白，膠原蛋白，彈性蛋白和糖胺聚糖含量；elisa試劑盒測定生長因子含量；包括：人表皮生長因子(egf)、人成纖維細胞生長因子(fgf)、人血管內皮生長因子(vegf)、人肝細胞生長因子(hgf)。結果如下表所示：表一、脫細胞羊膜粉的蛋白含量及細胞因子含量名稱含量(mg/g)名稱含量(ng/g)總蛋白163.6egf11.393彈性蛋白30.44fgf1.529膠原蛋白105.2vegf4.84糖胺聚糖0.82hgf26.791對本發明中蛋白含量和幾種生長因子的含量檢測結果顯示，按本發明的方法制作的羊膜粉末對膠原蛋白等分子和生長因子等活性因子的保留比較充分，可以為創面愈合提供更有效的營養支持，其生長因子等活性物質可持續促上皮化，加速創面的愈合。最后應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁12