專利名稱：復合微生物發酵劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物飼料添加劑領域中的菌種及其混合菌發酵劑。
背景技術：
我國的秸稈資源十分豐富，年產量可達到5. 79億噸。其中，玉米、小麥、和稻草秸稈三大作物秸稈產量達到了 4. 39億噸，占整個秸稈產量的75. 88%。目前，隨著畜牧業的快速發展，加劇了畜牧業對糧食的依賴性，但秸稈用作飼料數量較少，即使用作飼料也因加工利用不當，使得秸稈的利用率及飼料報酬率低。農作物秸稈營養價值低、適口性差、消化率低。如果對其進行合理的加工調劑，可用于飼喂家畜。據報道，秸稈經青貯、氨化等方法調治后，每6kg青貯秸稈或4kg氨化秸稈相當于Ikg玉米飼料的營養價值。因此，采用科學的方法對秸稈進行加工調劑，廣泛用于畜牧業，具有良好的生態效益社會效益和經濟效益。近年來在我國推廣的氨化飼料，不僅成本高、能耗高，并且存在與農業爭肥、污染環境，有些方法對于牲畜還有毒副作用。而飼料清楚技術的研究與應用已有上百年的歷史， 目前關鍵的技術在于微生物優良菌株的選育、復合菌種的有效復配和發酵工藝的優化。在這些方面，國內外學者均進行了大量的研究工作，但對于綜合解決清楚飼料發酵過程中抑制腐敗菌、防治二次發酵，有效控制有機酸和降解木質纖維素，降低成本，便于使用等方面仍然存在問題。

發明內容
針對目前存在的問題，本發明的目的在于提供一種青儲飼料用微生物發酵劑。本發明生產用復合微生物發酵劑黑曲霉孢子、鼠李糖乳桿菌CGMCC4430和植物乳桿菌組成。復合微生物發酵劑中各菌種活細胞數量范圍如下鼠李糖乳桿菌為(0.1 60. 0) *109個/克，植物乳桿菌數量為(0. 01 6. 0) *109個/克，黑曲霉孢子數量為(1 50)*108 個 / 克。將發酵制得黑曲霉孢子、鼠李糖乳桿菌粉、植物乳桿菌粉以質量比例為 1 (0. 5-2) (0. 5-2)混合，以干重計。1)黑曲霉孢子的制備工藝為A.斜面培養方法試管，121°C，20min滅菌后，擺斜面，冷卻，接種。30°C培養到黑色孢子鋪滿斜面。B. K式培養瓶孢子取10° Brix麥芽汁加入2%瓊脂，裝入500mL K式培養瓶，12rC，20min滅菌后， 鋪斜面冷卻。接入孢子懸浮液lmL，保證懸浮液接種于整個培養基表面；側放入恒溫箱， 30°C培養到黑色孢子鋪滿斜面。C.固態放大培養將K式瓶孢子制成孢子懸浮液，孢子濃度大于1. OX IO8個/mL。取200kg固態培養基(麩皮140kg、10° Brix麥芽汁60L)，充分混勻后放入淺盤，在121°C下滅菌1小時。 待放涼后，接入孢子懸浮液。培養溫度控制在30°C，濕度80-90%，每隔10小時翻料一次， 培養時間3天；待培養料長滿孢子即可結束培養干燥粉碎發酵結束后，將淺盤放在流化床干燥，干燥溫度控制在60°C，待物料水分含量將低于10%以下時，用粉碎機將固體培養料進行粉碎，物料粉碎孔徑在100目以上。2)鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌菌粉的制備工藝為植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌粉狀菌粉生產步驟如下將斜面菌種轉接到液體培養基并逐級擴培到要求的體積；將擴培得到的菌液進行離心分離，收集沉淀菌體；向沉淀菌體中加入保護劑并進行稀釋；利用干燥設備制備粉狀菌劑，復合菌粉混合時可以加入淀粉和糊精實現各菌活菌數的合適比例。最終菌粉產品中各菌種活細胞數量范圍如下鼠李糖乳桿菌為(0. 1 60. 0) *109個/克，植物乳桿菌數量為(0.01- 6. 0) *109個/克，黑曲霉孢子數量為(1 50)*108個/克。鼠李糖乳桿菌所用培養基如下斜面培養基(g/L) 20葡萄糖，5酵母粉，10大豆蛋白胨，10 牛肉膏，5NaCl，10 乙酸鈉，2 檸檬酸銨，0. 2MgS04 · 7Η20，0· 05MnS04 · 7H20，15 瓊脂，pH 6.5。發酵培養基(g/L) :40葡萄糖，10酵母粉，10大豆蛋白胨，無機鹽(0. OlNaCl，0. 5 乙酸鈉，0. 2 檸檬酸銨，0. 2ΚΗ2Ρ04，0· 2MgS04 · 7Η20，0· 05MnS04 · 7H20)，pH 6. 5。本發明中各種菌種組成比例也是經過精心試驗研究得到，上述菌種的選擇和配比保障了產品的良好質量。復合菌粉混合時可以加入淀粉和糊精實現各菌活菌數的合適比例。復合菌粉中各菌種活細胞數量較好范圍如下鼠李糖乳桿菌為(1 60.0)*109個 /克，植物乳桿菌數量為(0. 1 6. 0) *109個/克，黑曲霉孢子數量為(1 30) *108個/克。鼠李糖乳桿菌菌粉的具體生產方法已有較多報道，報道文章有黃良昌的碩士學位論文“真空冷凍干燥法生產干酸奶發酵劑工藝的研究”(2002年)，劉宇峰等在中國乳品工業雜志發表的“直接使用型酸奶發酵劑的研制”發表于1995年第5期。本發明采用的菌種如下鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No. 4430菌株特點如下在顯微鏡下觀察，該菌株為桿狀，寬度小于1 μ m，2到3個桿菌易于連成連接在一起；在固體培養基上，該菌菌落為乳白色，表面光滑，濕潤，粘稠，邊緣較整齊。與原始菌相比，該誘變菌株在形態上明顯小于出發菌株。出發菌株鼠李糖乳桿菌CGMCC No. 1.2134購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發明鼠李糖乳桿菌采用下述流程進行選育原始出發菌種一試管活化一高溫馴化一硫酸二乙酯(DEQ誘變一高糖平板篩選一亞硝基胍(NTG)誘變篩選一高溫菌篩選一搖瓶復篩一傳代穩定性試驗一5L發酵罐試驗。將目的菌株CGMCC No. 4430做5L乳酸發酵罐實驗，結果表明與出發菌株相比，CGMCC No. 4430葡萄糖耐受濃度可以達到270g/L，與原始菌相比提高了 95% ；發酵結束后，乳酸含量為60g/L，與原始菌相比提高了 158%。鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No. 4430保藏單位是中國普通微生物菌種保藏管理中心。地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。
黑曲霉(Aspergillusniger) CGMCC No. 3. 5洸9、植物乳桿菌(Lactobacillus ρlantarum CGMCC. No. 1. 2158)購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。保藏日期2010年 12月8日。微生物青儲混合菌發酵劑制作青儲飼料的工藝3)原料準備精選無腐爛的稻草、玉米稈及豆科類桿原料或其混合物，鍘至2 5 cm 長。4)菌種活化將復合微生物發酵劑倒入1 2° Brix麥芽汁中，混合均勻，25°C 35°C下經2 3小時即活化好。原料(稻草、玉米稈及豆科類桿原料或其混合物)的水含量應控制在70% 80%，復合微生物發酵劑用量為青儲飼料原料的0. 1-5% ；5)接種裝料原料分層堆積，堆積20 30cm厚時，噴灑一遍菌液。堆積總高不應超過2米。6)好氧培養空氣中放置5 30天，春、秋兩季應適當延長時間為20 30天；夏天放置5 10天。7)厭氧培養用塑料薄膜密封，20 90天后可以供牲畜食用，春、秋兩季時間為 60 90天。夏天20 30天。復合微生物發酵劑用量為青儲飼料原料的0. 1-1% ；有益效果黑曲霉、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌組成高活性復合微生物發酵劑。復合微生物發酵劑使用時，將青儲飼料發酵分為好氧和厭氧兩個階段。這樣在好氧階段促進了菌體的快速生長，厭氧階段利于代謝物的快速積累，本發明有效的解決了青儲飼料發酵中的技術難題，使用簡單，便于農民大規模使用。
具體實施例方式下面通過具體的實施方案敘述本發明中利用復合微生物發酵劑。 除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的培養劑組分、含量、培養條件進行的各種改變或改動也屬于本發明的保護范圍。1)黑曲霉孢子的制備工藝為A.斜面培養方法試管，12rC,20min滅菌后，擺斜面，冷卻，接種。30°C培養到黑色孢子鋪滿斜面。B. K式培養瓶孢子取10° Brix麥芽汁加入2%瓊脂，裝入500mL K式培養瓶，12rC，20min滅菌后， 鋪斜面冷卻。接入孢子懸浮液lmL，保證懸浮液接種于整個培養基表面；側放入恒溫箱， 30°C培養到黑色孢子鋪滿斜面。C.固態放大培養將K式瓶孢子制成孢子懸浮液，孢子濃度大于1. OX IO8個/mL。取200kg固態培養基(麩皮140kg、10° Brix麥芽汁60L)，充分混勻后放入淺盤，在121°C下滅菌1小時。 待放涼后，接入孢子懸浮液。培養溫度控制在30°C，濕度80-90%，每隔10小時翻料一次， 培養時間3天；待培養料長滿孢子即可結束培養干燥粉碎發酵結束后，將淺盤放在流化床干燥，干燥溫度控制在60°C，待物料水分含量將低于10%以下時，用粉碎機將固體培養料進行粉碎，物料粉碎孔徑在100目以上。鼠李糖乳桿菌 CGMCC4430 和植物乳桿菌(Lactobacillus ρlantarum CGMCC. No. 1. 2158)菌粉的制備工藝為植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌粉狀菌粉生產步驟如下將斜面菌種轉接到液體培養基并逐級擴培到要求的體積；將擴培得到的菌液進行離心分離，收集沉淀菌體；向沉淀菌體中加入保護劑并進行稀釋；利用干燥設備制備粉狀菌劑，上述方法制得鼠李糖乳桿菌菌粉中活細胞數為(0.1 6.0)*(101°)個/克，植物乳桿菌菌粉中活細胞數為(0. 1 6. 0) IO9個/克，復合菌粉混合時可以加入淀粉和糊精實現各菌活菌數的合適比例。最終菌粉產品中各菌種活細胞數量范圍如下鼠李糖乳桿菌為(0.1 60.0)*109個/克，植物乳桿菌數量為(0.01 6.0) *109個/克，黑曲霉孢子數量為(1 50)*108 個 / 克。鼠李糖乳桿菌所用培養基如下斜面培養基(g/L) 20葡萄糖，5酵母粉，10大豆蛋白胨，10 牛肉膏，5NaCl，10 乙酸鈉，2 檸檬酸銨，0. 2MgS04 · 7Η20，0· 05MnS04 · 7H20，15 瓊脂，pH 6.5。發酵培養基(g/L) :40葡萄糖，10酵母粉，10大豆蛋白胨，無機鹽(0. OlNaCl，0. 5 乙酸鈉，0. 2 檸檬酸銨，0. 2ΚΗ2Ρ04，0· 2MgS04 · 7Η20，0· 05MnS04 · 7H20)，pH 6. 5。實施例1 :將發酵制的IOOg黑曲霉孢子、IOOg鼠李糖乳桿菌和IOOg植物乳桿菌混合組成，鼠李糖乳桿菌為30. 0*109個/克，植物乳桿菌數量為5*109個/克，黑曲霉孢子數量為20*108
個/克。
權利要求
1.一種復合微生物發酵劑，所述復合微生物發酵劑由黑曲霉孢子、鼠李糖乳桿菌 CGMCC4430和植物乳桿菌組成。
2.如權1所述復合微生物發酵劑，其特征在于所述復合微生物發酵劑中各菌種活細胞數量范圍如下鼠李糖乳桿菌為(0.1 60.0) *109個/克，植物乳桿菌數量為(0.01 6.0)*109個/克，黑曲霉孢子數量為(1 50)*108個/克。
3.如權1-2所述一種復合微生物發酵劑，，其特征在于所述復合微生物發酵劑中鼠李糖乳桿菌為(1 60.0) *109個/克，植物乳桿菌數量為(0. 1 6.0)*109個/克，黑曲霉孢子數量為(1 30)*108個/克。
4.如權1-3所述一種復合微生物發酵劑，，其特征在于所述復合微生物發酵劑中鼠李糖乳桿菌為30. 0*109個/克，植物乳桿菌數量為5*109個/克，黑曲霉孢子數量為20*108 個/克。
全文摘要
本發明公開了一種復合微生物發酵劑，。所述復合微生物發酵劑由黑曲霉孢子、鼠李糖乳桿菌CGMCC4430和植物乳桿菌組成。通過向青儲原料中加入此發酵劑，在好氧、厭氧條件下，微生物快速生長，分泌大量的纖維素酶來分解纖維素，蛋白酶分解蛋白產生游離氨基酸，同時產生大量代謝產物乳酸等。處理后的青儲飼料pH值降低，基本無雜菌生長，是一種營養價值高、易消化的家畜用青儲飼料。
文檔編號C12N1/14GK102559546SQ20111042162
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月15日 優先權日2011年12月15日
發明者李政, 李績, 王玉, 蘇俊 申請人:李績