專利名稱：分離核酸的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離核酸的方法及裝置。
背景技術(shù)：
核酸在如檢測(cè)或診斷等不同的領(lǐng)域有各種用途。在核酸水平檢測(cè)或診斷比例如在蛋白質(zhì)水平更敏感或更具體。如植物或動(dòng)物的組織粗提物、細(xì)胞裂解產(chǎn)物、或血液或尿液樣本等分析物包括除核酸以外的其他物質(zhì)(或雜質(zhì))，其他物質(zhì)的至少部分可能會(huì)抑制核酸檢測(cè)或屏蔽檢測(cè)結(jié)果，因此，通常有必要將核酸從雜質(zhì)中分離出。包含核酸的分析物，通常可獲得的量較少，因此，人們開發(fā)了如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等擴(kuò)增技術(shù)。有時(shí)，核酸分離的要求之一就是從分析物獲得足夠在隨后的擴(kuò)增程序使用的核酸的數(shù)量。現(xiàn)有各種不同隔離/分離/純化核酸的技術(shù)。例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2005/0112658號(hào)披露一種離心力下分離純化核酸的方法，美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2007/0221563號(hào)公開一種壓力下分離純化核酸的方法，以及國(guó)際專利申請(qǐng)公開第2007/104962號(hào)涉及允許液體樣品沿吸水膜流動(dòng)以使核酸沿著膜的長(zhǎng)度分布從而從液體樣品中分離核酸的方法。在如美國(guó)專利第7067287號(hào)等文獻(xiàn)有提及石英濾紙可作為離心力或壓力下回收核酸的方法中粘合核酸且包括粒子的固相。然而，目前還尚未發(fā)現(xiàn)石英纖維濾紙實(shí)際用于隔離/分離/凈化核酸，可能是由于其并不適合以顆粒形式使用，且其更多是在空氣采樣等與隔離/分離/凈化核酸大不相同的領(lǐng)域?yàn)槿怂熘部赡芤驗(yàn)槿藗冋J(rèn)為其結(jié)構(gòu)過于緊密從而不能吸著核酸。離心力和壓力需要產(chǎn)生力量和壓力的儀器以及特定的操作技能，因而對(duì)于如無法負(fù)擔(dān)得起昂貴的儀器和技術(shù)人員的地方是不理想的。此外，離心力和壓力可能會(huì)使核酸鏈斷裂分解，致使只能得到尺寸相對(duì)較小的核酸片段。沿膜分布以分離核酸有時(shí)可能引起對(duì)分離質(zhì)量和提純效果的擔(dān)憂，因?yàn)楹怂岷碗s質(zhì)同時(shí)都在膜上擴(kuò)散。因此，有必要開發(fā)新的分離核酸的方法及裝置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的分離核酸的方法及裝置。一方面，本發(fā)明涉及的方法包括:將含有核酸的樣品溶液與石英纖維濾紙的樣品接收部接觸以使樣品溶液吸著至樣品接收部；使洗滌液在遠(yuǎn)離樣品接收部方向的吸力作用下流過樣品接收部以在將大部分核酸保持在樣品接收部周圍的情況下洗滌樣品接收部。另一方面，本發(fā)明涉及的裝置包括:石英纖維濾紙，其包括:樣品接收部，其與含有核酸的樣品溶液接觸以吸著樣品溶液，并在洗滌液在遠(yuǎn)離樣品接收部的吸力作用下流過的時(shí)候?qū)⒋蟛糠趾怂岜３衷谥車?本發(fā)明所涉及的分離核酸的方法及裝置解決了現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)問題。


通過結(jié)合附圖對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行描述，可以更好地理解本發(fā)明，在附圖中:圖1是根據(jù)本發(fā)明的第一實(shí)施例所提供的裝置的示意圖。圖2是根據(jù)本發(fā)明的第二實(shí)施例所提供的裝置的示意圖。圖3是根據(jù)本發(fā)明的第三實(shí)施例所提供的裝置的示意圖。圖4是例I中獲得的電泳圖像。圖5為例2中截取用于電泳的小片的示意圖。圖6為例2和對(duì)比例I中獲得的電泳圖像。圖7為例5中洗滌步驟的示意圖。
具體實(shí)施例方式說明書中的近似用語用來修飾數(shù)量，表示本發(fā)明并不限定于該具體數(shù)量，還包括與該數(shù)量接近的可接受的而不會(huì)導(dǎo)致相關(guān)基本功能的改變的修正的部分。相應(yīng)的，用“大約”、“約”等修飾一個(gè)數(shù)值，意為本發(fā)明不限于該精確數(shù)值。在某些例子中，近似用語可能對(duì)應(yīng)于測(cè)量數(shù)值的儀器的精度。在以下的說明書和權(quán)利要求中，除非清楚地另外指出，單復(fù)數(shù)不加以限制。本申請(qǐng)所提及的“可”、“可能”和“可為”表示在一定環(huán)境下發(fā)生的可能性；具有指定的性質(zhì)，特征或者功能的可能性；和/或通過顯示一個(gè)或者多個(gè)能力、性能而適合于另一種動(dòng)作，或者與該適合的動(dòng)作相關(guān)的可能性。因此，用于“可”、“可能”和“可為”表示修飾的術(shù)語顯然適合、能夠或者適于所表示的能力，功能，或者用途，同時(shí)考慮在一些情況下，所修飾的術(shù)語可能有時(shí)不適合、不能或者不合適。例如，在一些情況下，事件或者能力可能是所期望的，而在其它情況下，該事件或者能力不能發(fā)生。這種區(qū)別通過術(shù)語“可”、“可能”和“可為”涵蓋。在下文中，將根據(jù)

本發(fā)明的實(shí)施方式，將不會(huì)詳細(xì)描述眾所周知的功能和結(jié)構(gòu)，以避免因不必要的細(xì)節(jié)而使本發(fā)明變得令人費(fèi)解。請(qǐng)參圖1，根據(jù)本發(fā)明的第一實(shí)施例所提供的裝置I包括:石英纖維濾紙10，其包括:樣品接收部12，其與含核酸的樣品溶液(未圖示)接觸以吸著樣品溶液，并在洗滌液(未圖示)在遠(yuǎn)離樣品接收部12的吸力作用下流過以洗滌的時(shí)候?qū)⒋蟛糠趾怂岜３衷谥車Ｊ⒗w維濾紙10包括任何吸著樣品溶液且不抑制核酸的儲(chǔ)存或后續(xù)分析的多孔吸液材料。一些實(shí)施例中，石英纖維濾紙10由無粘結(jié)劑的純石英纖維制成。一些實(shí)施例中，石英纖維濾紙對(duì)顆粒大小不小于2.2微米的粒子阻止通過效率為約98%，基礎(chǔ)重量為約85g/m2，厚度范圍為約300微米到約600微米。可應(yīng)用于本發(fā)明的石英纖維濾紙的示例，包括但不限于可從美國(guó)新澤西州通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生物科學(xué)公司購(gòu)得的Whatman gradeQM-A石英超細(xì)纖維濾紙以及可從美國(guó)馬薩諸塞州比爾里卡Millipore公司購(gòu)得的AQFA石英纖維濾紙。 石英纖維濾紙10可為洗滌液能在其上移動(dòng)的長(zhǎng)形條。石英纖維濾紙10可由如聚酯(Mylar )或PET等塑料材料之類的背襯材料提供支持。本發(fā)明的裝置可為一個(gè)簡(jiǎn)單的核酸純化設(shè)備，也可為整個(gè)核酸分析設(shè)備/儀器組件的組成部分。樣品接收部12可為樣品溶液能吸著的任何形狀和構(gòu)造。樣品接收部12可為石英纖維濾紙10本身的一部分、也可為與石英纖維濾紙10液體接觸的吸液墊。一些實(shí)施例中，石英纖維濾紙10呈長(zhǎng)條形，包括樣品接收部12，與樣品接收部12間隔且供洗漆液添加于上的洗漆部14,第一尾部16,和第二尾部18。洗滌部14相對(duì)于第二尾部18更靠近第一尾部16。樣品接收部12比洗滌部14更接近第二個(gè)尾部18。在這樣的構(gòu)造中，當(dāng)洗滌液施加到洗滌部14時(shí)，大部分的洗滌液將從洗滌部14出發(fā)、流過樣品接收部12，且在遠(yuǎn)離樣品接收部12的吸力作用下流向第二尾部18。一些實(shí)施例中，洗滌部14為第一尾部16。本發(fā)明中“吸著”是指樣品溶液被吸收、吸附或摻入或摻到樣品接收部，使得不容易從樣品接收部移除，除非遭受到有意或不慎從樣品接收部移除吸著的組成的條件。本發(fā)明中“大部分核酸”指保持在樣品接收部周圍的核酸的量占樣品接收部吸著的樣品溶液中核酸的總量的至少約15%、或者至少約50%、或至少約90%。本發(fā)明中“分離”指的是從樣品溶液以方便如核酸擴(kuò)增分析等后續(xù)分析/使用的方式進(jìn)行的隔離或純化核酸的行為或行動(dòng)。本發(fā)明中“核酸”是指脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的任一個(gè)或兩個(gè)。分離得到的核酸可包括單一類型的核酸或2個(gè)以上不同類型的核酸。分離得到的核酸可為單鏈、雙鏈以及直鏈或環(huán)狀。分離得到的核酸的長(zhǎng)度也沒有限制，可在幾個(gè)堿基對(duì)(basepair,bp)到幾百萬bp的范圍內(nèi)。然而，為了便于操作，一般在幾個(gè)bp到數(shù)百kbp范圍內(nèi)。本發(fā)明的核酸分離/純化方法可以迅速回收比傳統(tǒng)的方法范圍更寬的核酸長(zhǎng)度。本發(fā)明分離核酸的長(zhǎng)度可在約Ibp到約1500kbp范圍內(nèi)，或者從Ikbp到約500kbp的范圍，或者從約20kbp到約200kbp的范圍。本發(fā)明的分析物沒有限制。分析物的示例包括人和動(dòng)物的生理/病理體液(如分泌物、排泄物、滲出物和漏出物)或細(xì)胞懸浮液(如血液、淋巴液、滑液、精液、含有口腔細(xì)胞的唾液、皮屑、發(fā)根細(xì)胞等)；植物的生理/病理液體或細(xì)胞懸浮液；細(xì)菌、真菌、質(zhì)粒，病毒等的液態(tài)產(chǎn)物、提取物或懸浮液；包括蠕蟲、原生動(dòng)物、螺旋體等寄生物的液態(tài)產(chǎn)物、提取物或懸浮液；人或動(dòng)物軀體組織(例如，骨，肝，腎等)的液體提取物或勻漿；來自DNA或RNA合成的媒介；用化學(xué)法或生物學(xué)法合成的DNA或RNA的混合物；以及其他任何DNA和/或RNA的可能來源。特別地，分析物包括如血液，血細(xì)胞和含抗凝劑的血液等生理或臨床樣品。一個(gè)從源頭取得分析物的方法示例是通過靜脈穿刺從人體或動(dòng)物源取得含有核酸的血液樣本。樣品溶液可以溶解、懸浮、混合或其他方式包含DNA和RNA中一個(gè)或兩個(gè)、或含有DNA和RNA中一個(gè)或兩個(gè)的細(xì)胞、細(xì)胞成分或細(xì)胞提取物。樣品溶液可從分析物制備而得。從分析物制備含有核酸的樣品溶液的一個(gè)示例方法包括以下步驟:把分析物樣品注入容器；把核酸溶解試劑加入容器，并混合分析物樣品和核酸溶解試劑；溫育混合而成的溶液；以及把水溶性有機(jī)溶劑加入經(jīng)溫育的混合溶液中。其中前述方法的后兩個(gè)步驟為可選步驟。核酸溶解試劑溶解需要溶解的細(xì)胞膜和核膜并溶解/擴(kuò)散核酸。核酸溶解試劑的示例包括含有離液鹽(chaotropic salt)、表面活性劑和蛋白酶中至少一個(gè)的溶液。但核酸溶解試劑也可以干燥形態(tài)應(yīng)用。在某些制備含有核酸的樣品溶液的方法中，也可能僅僅涉及將分析物溶于水。前述制備含有核酸的樣品溶液的方法可以借助例如超聲波處理、尖銳突出物處理、或高速攪拌或震蕩處理等技術(shù)手段。本發(fā)明可用的蛋白酶可為例如絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶等中的至少一個(gè)。關(guān)于絲氨酸蛋白酶，沒有特別限定，例如，蛋白酶K就可使用。對(duì)于半胱氨酸蛋白酶也沒有特別限制，例如，木瓜蛋白酶和組織蛋白酶即可使用。金屬蛋白酶也沒有特別限制，例如，羧肽酶可用。可用不含核酸酶的蛋白酶。包含如金屬離子等穩(wěn)定劑的蛋白酶，也可用。具體而言，氯化鎂或類似的形式存在的鎂離子為可用的穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑在整個(gè)反應(yīng)體系的總體積中的濃度可為約I毫摩爾/毫升到約1000毫摩爾/毫升、或約10毫摩爾/毫升到約100毫摩爾/毫升。蛋白酶的用量可以為添加后每毫升全部反應(yīng)體系的約0.001IU到約10IU、或者約0.0lIU 到約 IIUo蛋白酶可與離液鹽、表面活性劑或其他試劑一起應(yīng)用。另外，蛋白酶也可與如離液鹽和表面活性劑等其他試劑分開使用。在后一種情況下，分析物樣品首先與蛋白酶混合，產(chǎn)生的混合物再與含有離液鹽和/或表面活性劑的試劑混合。或者，分析物樣品可先與含有離液鹽和/或表面活性劑的試劑混合，再與蛋白酶混合。對(duì)混合分析物樣品和核酸溶解試劑的方法沒有特別限定。通過在較佳溫度以較佳反應(yīng)時(shí)間來溫育分析物樣品和核酸溶解試劑的混合物，可以提高分離和純化得到的核酸的產(chǎn)量。孵化溫度通常為約20°C至約70°C，而孵化時(shí)間通常是從約I分鐘到約90分鐘。溫育方法沒有特別限定，可以用浸入熱浴或放入加熱室的方式來進(jìn)行。 核酸溶解試劑溶液的pH值可為約5到約10、或者約6至約9、或者約6.5到約8。在核酸溶解試劑溶液中離液鹽的濃度可為約0.5摩爾/升或以上，也可為約0.5摩爾/升至約10摩爾/升，還可為約5摩爾/升至約8摩爾/升。鹽酸胍是優(yōu)先考慮的離液鹽，但也可用其他離液鹽(如三氟醋酸鈉，高氯酸鈉，鈉碘和異硫氰酸胍)。除了離液鹽，也可以用脲作為離液性物質(zhì)。這些離液性物質(zhì)可單獨(dú)使用，也可兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)合使用。核酸溶解試劑溶液可包含水溶性有機(jī)溶劑。醇類是優(yōu)先考慮的水溶性有機(jī)溶劑，其可為伯醇，仲醇及叔醇，如甲醇、乙醇、丙醇及其同分異構(gòu)體，和丁醇及其同分異構(gòu)體等。這些水溶性有機(jī)溶劑可單獨(dú)使用、也可兩個(gè)或以上組合使用。核酸溶解試劑溶液中水溶性有機(jī)溶劑的重量濃度，可為約1%到約20%。核酸溶解試劑溶液中表面活性劑的重量濃度可為約0.1%到約20%。核酸溶解試劑溶液中的表面活性劑的示例包括非離子表面活性劑，陽(yáng)離子表面活性劑，陰離子表面活性劑和兩性表面活性劑。聚氧亞乙基烷基苯基醚類表面活性劑、聚氧亞乙基烴基醚類表面活性劑和脂肪酸烷基酰胺可作為非離子表面活性劑使用，其中聚氧亞乙基辛基苯基醚(如Triton X-100)和聚氧亞乙基烴基醚類表面活性劑可優(yōu)先選用。聚氧亞乙基烴基醚類表面活性劑的示例包括POE癸醚、POE月桂基醚、POE十三烷基醚、POE亞烷基癸醚、POE失水山梨醇單月桂酸酯、POE脫水山梨糖醇單油酸酯、POE脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、四油酸聚氧乙烯山梨糖醇、POE烷基胺和POE炔二醇。陽(yáng)離子表面活性劑的示例包括溴化十六烷基三甲基銨、氯化十二烷基三甲基銨、氯化十四烷基三甲基銨和氯化十六烷基吡啶。這些表面活性劑可單獨(dú)應(yīng)用也可兩個(gè)或兩個(gè)以上組合運(yùn)用。若要回收RNA以外的其他核酸，如DNA，可在核酸溶解試劑溶液中添加RNA分解酶以降低RNA可能對(duì)回收的核酸帶來的干擾。RNA分解酶示例如核糖核酸酶H (RNase H)。也可加DNA分解酶抑制劑。另一方面，在回收除DNA以外的其他核酸，如RNA，的情況下，可添加DNA分解酶至核酸溶解試劑溶液。這樣，可減少DNA對(duì)回收的核酸的可能干擾。DNA分解酶的示例如DNase
I。也可添加RNA分解酶抑制劑。 在一些實(shí)施例中，可在洗滌液洗滌石英纖維濾紙后添加特定降解DNA或RNA的酶到樣品接收部。含有核酸的樣品溶液可包含消泡劑。消泡劑的示例包括含硅消泡劑(如硅油、二甲基聚硅氧烷、有機(jī)硅乳液，改性聚硅氧烷和有機(jī)硅化合物)、醇類消泡劑(例如乙炔二醇、庚醇、辛醇，高碳醇和聚氧化亞烷基二醇)、醚類消泡劑(例如，庚基溶纖劑和壬基溶纖劑-3-庚基山梨糖醇)、脂肪和油類消泡劑(如動(dòng)物油和植物油)、脂肪酸類消泡劑(例如，硬脂酸，油酸和棕櫚酸)、金屬皂類消泡劑(例如，硬脂酸鋁和硬脂酸鈣)、脂肪酸酯類消泡劑(例如，天然蠟和磷酸三丁酯)、磷酸鹽類消泡劑(例如，辛基磷酸鈉)、胺類消泡劑(例如二戊基胺)、酰胺類消泡劑(例如，硬脂酸酰胺)和其他消泡劑(如硫酸鐵和釩土)。含硅消泡劑和醇類消泡劑可同時(shí)使用。
`
醇類可作為水溶性有機(jī)溶劑添加到溫育過的混合溶液。可用伯醇、仲醇及叔醇中任何一種。其中甲醇、乙醇、丙醇、丁醇及前述醇的異構(gòu)體都可用。水溶性有機(jī)溶劑在含有核酸的樣品溶液中的重量濃度可為從約5%至約90%。含有核酸的樣品溶液和洗滌液可用管子、移液管、自動(dòng)注入裝置、或任何其他適用的方法或工具添加到石英纖維濾紙上。洗滌液在沒有外力僅靠吸力作用的情況下在石英纖維濾紙上流動(dòng)或穿過、帶走在石英纖維濾紙上吸著能力比核酸低的雜質(zhì)，從而可在將大部分核酸保持在樣品接收部周圍的情況下洗滌樣品接收部。洗滌液可與含有核酸的樣品溶液在石英纖維濾紙的同一個(gè)位置添加，即都在樣品接收部添加。洗滌液也可從石英纖維濾紙上不同于樣品接收部的位置添加。在前一種情況下，樣品接收部和洗滌部是石英纖維濾紙的同一個(gè)位置。洗滌液可包括能分解雜質(zhì)(例如蛋白質(zhì))的酶。此外，它可根據(jù)需要包括脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶或類似物。包含脫氧核糖核酸酶的洗滌液的使用可有助于RNA的選擇性回收。同樣，包含核糖核酸酶的洗滌液可有助于選擇性的回收DNA。洗滌液可包括水溶性有機(jī)溶劑和/或水溶性鹽。洗滌液洗出樣品溶液中與核酸一起吸著在石英光纖濾紙上的雜質(zhì)。因此，它可含有將雜質(zhì)從石英纖維濾紙脫吸的同時(shí)讓核酸保持吸著的成分。核酸難溶的水溶性有機(jī)溶劑，如醇類，適合從石英纖維濾紙解吸核酸以外的其他成分。與此同時(shí)，水溶性鹽的納入可增強(qiáng)核酸的吸附，協(xié)助對(duì)不必要的雜質(zhì)的選擇性解吸。
洗滌液中的水溶性有機(jī)溶劑的示例包括甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇和丙酮，其中乙醇較為合適。水溶性有機(jī)溶劑在洗滌液中的重量濃度可為約20%至100%或約40% 到約 100%。另一方面，洗滌液中的水溶性鹽可為鹵化鹽或三(羥甲基)氨基甲烷。參照?qǐng)D2，根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施例的裝置2包括一個(gè)石英纖維濾紙20，包括上半部分24和下半部分26的塑料殼體22，以及吸液墊28。石英纖維濾紙20與第一實(shí)施例中的石英纖維濾紙10類似，包括樣品接收部202，洗滌部204，第一尾部206，和第二尾部208。洗滌部204相較于第二尾部208更接近第一尾部206。樣品接收部202比洗滌部204更接近第二尾部208。在這種構(gòu)造下，當(dāng)洗滌液加到洗滌部204時(shí)，更多的洗滌液就會(huì)在遠(yuǎn)離樣品接收部202的吸力作用下，從洗滌部204出發(fā)流過樣品接收部202、流 向第二尾部208。塑料殼體22包覆石英纖維濾紙20和吸液墊28。其上下兩半部分24，26可一體成型也可分別單獨(dú)成型。上半部分24包括與樣品接收部202和洗滌部204分別對(duì)應(yīng)的樣品通孔240和洗滌通孔242。加入含有核酸的樣品溶液后，樣品通孔240可在含有核酸的樣品溶液完全吸著前與樣品接收部202 —起容納含有核酸的樣品溶液。吸液墊28中的一個(gè)與洗滌部204相鄰和垂直對(duì)齊，而另一個(gè)與第二尾部208相鄰和垂直對(duì)齊，以協(xié)助增強(qiáng)使洗滌液從樣品接收部202遠(yuǎn)離的吸力。請(qǐng)參考圖3，根據(jù)本發(fā)明的第三實(shí)施例的裝置3包括石英纖維濾紙30，包括上半部分34和下半部分36的塑料殼體32，以及吸液墊38。石英纖維濾紙30與第一實(shí)施例中的石英纖維濾紙10類似，包括樣品接收部302，第一尾部306，和第二尾部308。樣品接收部302相較于第二尾部308更接近第一尾部306。塑料殼體32包覆石英纖維濾紙30和吸液墊38。其上下兩半部分34，36可一體成型也可分別單獨(dú)成型。上半部分34包括與樣品接收部302對(duì)應(yīng)的樣品通孔340。加入含有核酸的樣品溶液后，樣品通孔340可在含有核酸的樣品溶液完全吸著前與樣品接收部302 一起容納含有核酸的樣品溶液。吸液墊38與石英纖維濾紙30相鄰和垂直對(duì)齊，以協(xié)助使洗滌液從樣品接收部302遠(yuǎn)離。采用這樣的構(gòu)造，含有核酸的樣品溶液和洗滌液都從樣品接收部302添加。把洗滌液添加至樣品接收部302時(shí)，洗滌液將受遠(yuǎn)離樣品接收部302的吸力作用流過樣品接收部302、流向第二尾部308和/或吸液墊38。吸液墊28，38由吸液材料制得，如纖維素、二氧化硅超細(xì)纖維濾紙、玻璃纖維和石英纖維濾紙。在一些實(shí)施例中,樣品接收部可位于殼體以外。本發(fā)明涉及的方法包括:將含有核酸的樣品溶液與石英纖維濾紙的樣品接收部接觸以使樣品溶液吸著至樣品接收部；使洗滌液在遠(yuǎn)離樣品接收部方向的吸力作用下流過樣品接收部以在將大部分核酸保持在樣品接收部周圍的情況下洗滌樣品接收部。本發(fā)明中石英纖維濾紙的多孔性所固有的吸力作為使洗滌液流動(dòng)和基于雜質(zhì)和核酸對(duì)多孔的石英纖維濾紙不同的吸著力帶走樣品溶液中除核酸外的雜質(zhì)的動(dòng)力，從而消除了對(duì)產(chǎn)生外部動(dòng)力(如離心力和壓力)的儀器和具有特定技能的人才的需求，使在偏遠(yuǎn)地區(qū)的現(xiàn)場(chǎng)分離成為可能。將洗滌液流經(jīng)樣品接收部以帶走雜質(zhì)并同時(shí)把核酸保持在樣品接收部周圍，核酸從樣品溶液中與雜質(zhì)充分分離，可用常規(guī)檢測(cè)核酸檢測(cè)方法(如PCR技術(shù))被檢測(cè)到。故而本發(fā)明具有純化效果。本發(fā)明涉及的方法可為任何分析中高成本效益和效率的簡(jiǎn)單的純化的步驟，特別是涉及核酸擴(kuò)增，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等石英纖維濾紙的存在沒有任何顯著的抑制作用的分析。石英纖維濾紙?jiān)诤泻怂岬臉悠啡芤汉拖礈煲合群筇砑雍笠馔獾膶⒋蟛糠趾怂岜Ａ粼跇悠方邮詹恐車Ｔ谑⒗w維濾紙上分離后，核酸可在石英纖維濾紙上受到進(jìn)一步的分析，或如有必要，可從石英纖維濾紙洗脫或以其他方式提取核酸，并對(duì)洗脫和提取產(chǎn)物進(jìn)行分析。洗滌液洗滌后，樣品接收部通常變回與含有核酸的樣品溶液加入前相同或接近的顏色。在一些實(shí)施例中，石英纖維濾紙?jiān)谙礈旌笫窃诘陀诩s90°C、或在37°C或40°C、或室溫等溫度進(jìn)行干燥。例如在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，石英纖維濾紙，或其樣品接收部周圍提取的一小片可用于進(jìn)一步的分析。例如，為了檢測(cè)石英纖維濾紙上特定核酸的存在，可將提取的一小片石英纖維濾紙浸到PCR混合物中。PCR混合物可包括如核苷酸，聚合酶和PCR引物等放大某一表征特定生物體的特定的核酸序列的試劑。PCR混合物可進(jìn)一步包括緩沖物、鎂鹽等。對(duì)石英纖維濾紙上的核酸進(jìn)行PCR分析獲得的Ct值相當(dāng)于使用傳統(tǒng)的復(fù)雜的純化和/或存儲(chǔ)方法獲得的核酸的PCR分析Ct值。這表明，本發(fā)明的方法和裝置有效地凈化核酸和去除污染物/抑制劑。本發(fā)明中所指的核苷酸包括弓I物(例如，PCR引物和逆轉(zhuǎn)錄-PCR引物)、用于LCR、DNA或RNA探針的寡核苷酸底物、用于遺傳序列分析的寡核苷酸、或靶序列穩(wěn)定劑。本發(fā)明中的“引物”是指一個(gè)寡核苷酸片段，其可與石英纖維濾紙上的互補(bǔ)的核酸序列退火并導(dǎo)向，引發(fā)DNA鏈(或RNA鏈)的合成，合成的鏈含有一段與另一寡核苷酸互補(bǔ)的序列。對(duì)于某些應(yīng)用，可能需要預(yù)先設(shè)定寡核苷酸的序列和它的互補(bǔ)序列。在其他的應(yīng)用中，該序列可為未知。許多簡(jiǎn)并引物或帶有預(yù)測(cè)能與互補(bǔ)序列相結(jié)合的序列的引物都可使用。引物對(duì)可用于擴(kuò)增一對(duì)互補(bǔ)序列以及在二種已知或未知大小的互補(bǔ)序列之間的序列。另外，引物可用于擴(kuò)增模板，該模板最初是雙鏈DNA或RNA，也可以是單鏈DNA或RNA。對(duì)于單鏈模板，與寡核苷酸之一互補(bǔ)的序列退火雜交到其互補(bǔ)序列上時(shí)，通過第一引物的延伸而合成。用于PCR或逆轉(zhuǎn)錄-PCR的引物，可以像通常一樣以弓I物對(duì)形勢(shì)存在，也可只有一種引物，正如在作基因組序列分析或用于逆轉(zhuǎn)錄-PCR的某些方案中可能的情況那樣。實(shí)驗(yàn)示例下述實(shí)驗(yàn)示例為本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明提供進(jìn)一步的指導(dǎo)。示例并不限定權(quán)利要求書中界定的本發(fā)明的范圍。在實(shí)驗(yàn)中不同的水的成分用離子濃度進(jìn)行表征。例I分離后的位置分析把包括抗凝血?jiǎng)?肝素鈉)的2.5 μ L人全血樣品、0.25 μ L蛋白酶K(20毫克/毫升)和2.5μ L包含66.87%鹽酸胍和4% 的Triton X-100的溶液加入到1.5ml微離心管。
晃動(dòng)微離心管約15秒，然后在室溫、間歇振蕩的情況下溫育約10分鐘以準(zhǔn)備樣品溶液。溫育結(jié)束，微離心管中混合物的顏色從紅色變?yōu)樯詈稚Ｖ苽浍@得的樣品溶液從微離心管通過如圖2所示構(gòu)造的裝置的殼體的樣品通孔加入以接觸石英纖維濾紙的樣品接收部。石英纖維濾紙是4毫米寬、6厘米長(zhǎng)的從美國(guó)新澤西州通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生物科學(xué)公司獲得Whatman grade QM-A石英微纖維濾紙。塑料殼體是從中國(guó)上海的上海杰一生物科技有限公司獲得的A-1O塑料殼體。洗滌部和第二尾部下面的吸液墊為美國(guó)新澤西州通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生物科學(xué)公司獲得的Whatman grade470特殊用途濾紙。5秒鐘后，觀察到樣品溶液吸著到石英纖維濾紙的樣品接收部，樣品接收部的顏色變?yōu)樽厣Ｍㄟ^殼體的洗滌通孔把洗滌液(150μ L，80%的乙醇溶液)加到洗滌部以使洗滌液從洗滌部流過樣品接收部從而洗滌樣品接收部。肉眼觀察樣品接收部周圍無可見雜質(zhì)且樣品接收部的顏色變成樣品溶液加入前的顏色時(shí)，把設(shè)備放入37°C烤箱干燥30分鐘。從樣品溶液加入到樣品接收部的顏色變回，只花了約5分鐘時(shí)間。干燥后，從殼體取出石英纖維濾紙，并沿長(zhǎng)度方向切成12小片，每小片寬度為4毫米、長(zhǎng)度為5毫米。每個(gè)小片被放置到一個(gè)單獨(dú)的0.8%瓊脂糖凝膠樣品匣以進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳。脈沖場(chǎng)凝膠電泳是在來自美國(guó)加州的Bio-Rad Laboratories, Inc.的
CHEF Mapper XA系統(tǒng)進(jìn)行，時(shí)間為45分鐘，電壓為120V。電泳后，用IX SYBRGREEN I溶
液染色瓊脂糖凝膠1.5小時(shí)，然后再使用來自美國(guó)新澤西州通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生物科學(xué)公司的TyphoonTM TrioTM可變模式成像儀掃描以獲得電泳圖像。得到的電泳圖像如圖4所示。圖4中泳道A-L分別代表石英纖維濾紙從第一尾部到第二尾部按順序切分的12小片的圖像，如泳道A-B代表石英纖維濾紙上對(duì)應(yīng)第一尾部和洗滌部的小片的圖像，泳道C-D代表樣品接收部的小片的圖像，而泳道M代表DNA標(biāo)記(DL15000, Takara)。圖像顯示，洗滌后，大多數(shù)核酸保持在樣品接收部周圍。例2分離后的尺寸分析使與例I中相同的石英纖維濾紙以與例I相同的方式接觸與例I相同的方法制備的相同數(shù)量的樣品溶液，然后用與例I同樣數(shù)量同樣成分的洗滌液用與例I相同的方式進(jìn)行洗漆。用和例I相同的方式干燥洗滌后的石英纖維濾紙后，將其從塑料殼體中取出，如圖5所示，在樣品接收部202周圍、虛線211之間截取I厘米長(zhǎng)的小片210。把小片210分為兩半，置于I %瓊脂糖凝膠樣品樣品匣以進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳。脈沖場(chǎng)凝膠電泳是在CHEF Mapper XA系統(tǒng)進(jìn)行，時(shí)間為24小時(shí)，電壓為6v/cm,溫度為10°c。電泳后，用I X SYBR GREEN I溶液染色瓊脂糖凝膠5小時(shí)，然后再使用來自美國(guó)新澤西州通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生物科學(xué)公司的TyphoonTM TrioTM可變模式成像儀掃描以獲得電泳圖像。得到的電泳圖像如圖6所示。對(duì)比例I參照Qiagen公 司的QIAamp血液迷你試劑盒產(chǎn)品手冊(cè)中建議的操作流程，從包括抗凝血?jiǎng)?肝素鈉)的2.5 μ L人全血中提取2.5 μ LDNA溶液，將該2.5 μ LDNA溶液與2.5μ L水混合后置于I %瓊脂糖凝膠樣品匣以與例2相同的條件進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳。參照Qiagen公司的QIAamp血液迷你試劑盒產(chǎn)品手冊(cè)中建議的操作流程，從包括抗凝血?jiǎng)?肝素鈉)的2.5 μ L人全血中提取2.5 μ LDNA溶液，將該2.5 μ LDNA溶液與
2.5 μ L水混合后滴至與例I中相同的石英纖維濾紙的樣品接收部上。干燥后，以如例2相同的方式截取I厘米長(zhǎng)的小片210。把小片210分為兩半，置于I %瓊脂糖凝膠樣品樣品匣以與例2相同的條件進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳。此例中的電泳圖像也示于圖6。圖6中泳道N表征MidRange II PFG標(biāo)記，泳道O為對(duì)比例I中2.5 μ LDNA溶液與2.5 μ L水混合物的電泳圖像，泳道P為對(duì)比例I中截取的小片的電泳圖像，而泳道Q為例2中截取的小片的電泳圖像。從圖6可以看出，對(duì)比例I中分離/純化的DNA的尺寸范圍與QIAamp血液迷你試劑盒產(chǎn)品手冊(cè)中介紹的相符，為200bp到50kbp，且比例2中分離/純化得到的DNA的尺寸
范圍窄很多。例3分離后的數(shù)量分析使與例I中相同的3張石英纖維濾紙以與例I相同的方法分別接觸與例I相同的方法制備的相同數(shù)量的3份樣品溶液，然后用與例I同樣數(shù)量同樣成分的3份洗滌液用與例I相同的方式分別進(jìn)行洗滌。用與例I相同的方式干燥后，在每張石英纖維濾紙的樣品接收部周圍用HarrisUn1-core 1.2mm打孔器截取直徑為1.2mm的圓形片。每個(gè)圓形片放入盛有25 μ Imaster-mix 的 25 μ I PCR 管進(jìn)行為 beta-actin 的 Taqman 實(shí)時(shí) PCR (包含 Ex Taq HS、300nM每 beta-actin 引物和 IOOnM beta-actin 探針的 I XPCR 緩沖物)。對(duì)比例2參照Qiagen公司的QIAamp血液迷你試劑盒產(chǎn)品手冊(cè)中建議的操作流程，從3個(gè)包括抗凝血?jiǎng)?肝素鈉)的2.5 μ L人全血樣本中各提取2.5 μ LDNA溶液，將該3份2.5 μ L的DNA溶液分別與2.5 μ L水混合后分別滴至與例I中相同的石英纖維濾紙的樣品接收部上。用與例I相同的方式干燥后，在每張石英纖維濾紙的樣品接收部周圍用與例3相同的方式截取直徑為1.2mm的圓形片。每個(gè)圓形片放入盛有25 μ lmaster-mix的25 μ IPCR 管進(jìn)行為 beta-actin 的 Taqman 實(shí)時(shí) PCR(包含 Ex TaqHS、300nM 每 beta-actin 引物和IOOnM beta-actin 探針的 I XPCR 緩沖物)。用Smart Cycler II thermocycler (Cepheid)進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR,循環(huán)條件為 95°C 30秒，然后40個(gè)2步循環(huán)(95°C 5秒和60°C 20秒)。用例3和對(duì)比例2中的圓形片均成功的得到了 beta-actin擴(kuò)增。得到的Ct值列于下表I。結(jié)果表明例3中純化得到的DNA的數(shù)量與對(duì)比例2中得到的數(shù)量相當(dāng)/更多。表I
Ct值
對(duì)比例2中的圓形片29.41,30.06,29.49
例3中的圓形片29.23,29.39,29.23
例4沒有塑料殼體的情況下進(jìn)行的分離把與例I相同的方法制備的相同數(shù)量的樣品溶液滴加到與例I中相同的石英纖維濾紙的樣品接觸部。約5秒鐘后，樣品溶液已被樣品接收部吸著，可見樣品接收部的顏色變?yōu)樽厣ｋS即，如圖7所示，把石英纖維濾紙80的第一尾部82插入盛于96-孔板的一個(gè)孔86的與例I中洗滌液相同的150 μ L洗滌液84中。樣品接收部88及其以下的部分81是暴露在洗滌液84的液面83以外的。約5分鐘后，樣品接收部88的顏色變回樣品溶液84添加前的顏色，從洗滌液84中抽出石英纖維濾紙80，在37°C烤箱干燥20分鐘。用與例3相同的方式截取直徑為1.2mm的圓形片進(jìn)行擴(kuò)增。重復(fù)實(shí)驗(yàn)I次。兩個(gè)圓形片都成功的得到了 beta-actin擴(kuò)增，得到的Ct值分別為 27.99 和 28.08。對(duì)比例3未經(jīng)干燥的分離使與例I中相同的石英纖維濾紙接觸與例I相同的方法制備的相同數(shù)量的樣品溶液，然后用與例I同樣數(shù)量同樣成分的洗滌液用與例I相同的方式進(jìn)行洗滌。沒有任何干燥步驟，用與例3相同的方式截取直徑為1.2mm的圓形片進(jìn)行擴(kuò)增。得到的圓形片未能成功的得到beta-actin擴(kuò)增。例5單一進(jìn)料口的分離使用如圖3所示構(gòu)造的設(shè)備。使與例I相同的方法制備的相同數(shù)量的樣品溶液通過塑料殼體的樣品通 孔與例I中相同的石英纖維濾紙接觸，然后用與例I同樣數(shù)量同樣成分的洗滌液進(jìn)行洗滌，但與例I不同的是，洗滌液也從樣品通孔通過加到石英纖維濾紙的樣品接收部上。用與例I相同的方式干燥后，用與例3相同的方式截取直徑為1.2mm的圓形片進(jìn)行擴(kuò)增。重復(fù)實(shí)驗(yàn)I次。兩個(gè)圓形片都成功的得到了 Beta-actin擴(kuò)增，得到的Ct值分別為 27.76 和 28.73。例6與不洗石英纖維濾紙的對(duì)比分析使與例I中相同的石英纖維濾紙以與例I相同的方式接觸與例I相同的方法制備的相同數(shù)量的樣品溶液，用與例I相同的方式干燥后，用與例3相同的方式截取直徑為
1.2mm的圓形片進(jìn)行擴(kuò)增。使與例I中相同的石英纖維濾紙以與例I相同的方式接觸與例I相同的方法制備的相同數(shù)量的樣品溶液，然后用與例I同樣數(shù)量同樣成分的洗滌液用與例I相同的方式進(jìn)行洗滌。用與例I相同的方式干燥后，用與例3相同的方式截取直徑為1.2mm的圓形片進(jìn)行擴(kuò)增。兩個(gè)圓形片都成功的得到了 Beta-actin擴(kuò)增，得到的Ct值列于下表2。結(jié)果顯示未經(jīng)洗滌步驟的圓形片的Ct值高于經(jīng)過洗滌步驟的圓形片的Ct值，也就是說，經(jīng)過洗滌步驟，擴(kuò)增的效率提高了。表權(quán)利要求
1.一種方法，其特征在于，包括: 將含有核酸的樣品溶液與石英纖維濾紙的樣品接收部接觸以使樣品溶液吸著至樣品接收部; 使洗滌液在遠(yuǎn)離樣品接收部方向的吸力作用下流過樣品接收部以在將大部分核酸保持在樣品接收部周圍的情況下洗滌樣品接收部。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，樣品溶液包含離液鹽，而洗滌液包括乙醇和異丙醇中至少一個(gè)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，石英纖維濾紙對(duì)顆粒大小不小于2.2微米的粒子阻止通過效率為約98%，基礎(chǔ)重量為約85g/m2，厚度范圍為約300微米到約600微米。
4.如權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，石英纖維濾紙呈長(zhǎng)條形，包括第一尾部，洗滌部，樣品接收部，和第二尾部，洗滌部相對(duì)于第二尾部更靠近第一尾部，樣品接收部比洗滌部更接近第二尾部。
5.如權(quán)利要求4所述的方法， 其特征在于，其進(jìn)一步包括:提供與洗滌部和第二尾部中至少一個(gè)相鄰且垂直對(duì)齊的吸液墊，吸液墊由纖維素、二氧化硅超細(xì)纖維濾紙、玻璃纖維、石英纖維濾紙中至少一個(gè)制得。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，洗滌部是第一尾部。
7.如權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，其進(jìn)一步包括:提供與石英纖維濾紙相鄰且垂直對(duì)齊的吸液墊，吸液墊由纖維素、二氧化硅超細(xì)纖維濾紙、玻璃纖維、石英纖維濾紙中至少一個(gè)制得，且洗滌液加至樣品接收部。
8.如權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，其進(jìn)一步包括:洗滌后干燥石英纖維濾紙。
9.一種裝置，其特征在于，其包括: 石英纖維濾紙，其包括: 樣品接收部，其與含有核酸的樣品溶液接觸以吸著樣品溶液，并在洗滌液在遠(yuǎn)離樣品接收部的吸力作用下流過的時(shí)候?qū)⒋蟛糠趾怂岜３衷谥車?br> 10.如權(quán)利要求9所述的裝置，其特征在于，石英纖維濾紙對(duì)顆粒大小不小于2.2微米的粒子阻止通過效率為約98%，基礎(chǔ)重量為約85g/m2，厚度范圍為約300微米到約600微米。
11.如權(quán)利要求9或10所述的方法所述的裝置，其特征在于，石英纖維濾紙呈長(zhǎng)條形，包括第一尾部，洗滌部，樣品接收部，和第二尾部，洗滌部相對(duì)于第二尾部更靠近第一尾部，樣品接收部比洗滌部更接近第二尾部。
12.如權(quán)利要求11所述的裝置，其特征在于，其進(jìn)一步包括:與洗滌部和第二尾部中至少一個(gè)相鄰且垂直對(duì)齊的吸液墊，吸液墊由纖維素、二氧化硅超細(xì)纖維濾紙、玻璃纖維、石英纖維濾紙中至少一個(gè)制得。
13.如權(quán)利要求11所述的裝置，其特征在于，洗滌部是第一尾部。
14.如權(quán)利要求9或10所述的裝置，其特征在于，其進(jìn)一步包括:與石英纖維濾紙相鄰且垂直對(duì)齊的吸液墊，吸液墊由纖維素、二氧化硅超細(xì)纖維濾紙、玻璃纖維、石英纖維濾紙中至少一個(gè)制得。
15.如權(quán)利要求9或10所述的裝置，其特征在于，其進(jìn)一步包括:包裝石英纖維濾紙的殼體，殼體包括將樣品接收部暴露的樣品通孔。
16.如權(quán)利要求9或10所述的裝置，其特征在于，樣品溶液包含離液鹽，而洗滌液包括乙醇和異丙醇中 至少一個(gè)。
全文摘要
一種方法包括將含有核酸的樣品溶液與石英纖維濾紙的樣品接收部接觸以使樣品溶液吸著至樣品接收部；使洗滌液在遠(yuǎn)離樣品接收部方向的吸力作用下流過樣品接收部以在將大部分核酸保持在樣品接收部周圍的情況下洗滌樣品接收部。本發(fā)明還涉及相關(guān)的裝置。
文檔編號(hào)C12N15/10GK103173432SQ20111043634
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者陳林, 張冰, 克勞斯.霍赫萊特納, 侯嶸, 王艷菊 申請(qǐng)人:通用電氣公司