專利名稱：沙眼衣原體、解脲脲原體、細小脲原體和淋球菌的檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
:本發明涉及分子領域，具體是一種淋球菌、沙眼衣原體及解脲脲原體和細小脲原體檢測試劑盒。
背景技術：
: 淋球菌、沙眼衣原體、解脲脲原體和細小脲原體是一類由性接觸為主要傳播途徑的病原體，它們可分別引發淋病和非淋球菌性尿道炎。淋病是目前世界上發病較多的性病之一，每年以20% 30%速度遞增，由于濫用抗生素及反復感染，導致淋病的臨床表現缺乏特異性，尤其女性，感染初期的60% 70%呈現無癥狀過程，如不及時診斷治療，既可成為潛在傳染源，也有學者認為盆腔炎也是由此菌引物，從而損傷輸卵管及卵巢，引起宮外孕和不育癥等，故實驗室檢查對臨床確診及治療有重大意義沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis, CT)感染為美國最常見的性傳播疾病(STD)，每年有4 5百萬病例發生，每年花費可達40億美元。據世界衛生組織(WHO)估計，每年有9，200萬新的CT感染病例發生。在發展中國家其發生率也呈逐年上升趨勢。CT可引起沙眼、泌尿生殖道感染、尿道炎、附睪炎及不孕不育等。支原體感染男女泌尿生殖道的發病率成逐年上升趨勢，女性下生殖道是支原體感染好發的部位，上行還可以子宮腔和輸卵管腔從而引起炎癥和并發癥。吳志芬等對無錫市1600例男女生殖道感染者進行支原體檢測，其中解脲脲原體的感染率為42.3%，表明支原體的感染率高，已構成流行。近年來解脲支原體的致病機理和流行病學研究得到了充分的重視。最近的研究表明，解脲支原體應該分為兩個獨立的種，即細小脲原體(Ureaplasmaparvum.原解脲支原體生物一群)和解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum),生殖道分離到的解脲支原體以細小脲原體為主。解脲支原體(Ureaplasma urealyticum,簡稱UU)和沙眼衣原體是常見的性傳播疾病病原體，在臨床非淋菌性尿道炎(簡稱NGU)病人中，二者常常呈共同感染狀態；在性傳播疾病中解脲脲原體與非淋菌性尿道炎、附睪炎有關；與前列腺炎、女性尿道癥狀、腎盂腎炎、盆腔炎有明顯相關性或提示有病原學作用。淋病奈瑟菌的實驗室診斷主要依靠細菌培養，該法準確可靠，但往往需要2 3天才能得到結果，且常因標本采集方法和運送方式不正確，而使淋病奈瑟菌死亡造成培養失敗，使培養陽性率偏低。涂片法操作簡單，但缺乏特異性，而且受采集、涂片、染色、鏡檢等操作過程中的主觀因素影響造成漏檢。核酸檢測法快速、靈敏度和特異度高，是近年來發展的有效方法，但成本較高。衣原體的實驗室診斷主要有細胞培養技術、直接涂片鏡檢技術、抗原抗體免疫技術、聚合酶鏈反應、連接酶鏈反應和糖元試驗。直接涂片鏡檢、免疫膠體金法為臨床常用的方法；自動酶聯免疫法(VIDAS)，儀器昂貴，檢測成本較高；PCR通過方法學及試劑的改進，有望成為臨床首選使用方法；LCR為目前已知較理想的方法，但其僅器昂貴，難以在基層推廣；細胞培養技術為衣原體實驗室診斷的黃金標準，但在醫院由于費時等原因難以推廣。支原體的實驗室診斷包括分離培養法、免疫學方法和分子生物學方法。在標本中分離培養出支原體對支原體感染的診斷有決定性的意義。但該法靈敏度低，時間長，不利于早期快速診斷。ELISA法敏感性和特異性高，重復性好，簡便、快速，可以測定抗體或抗原，有廣闊的應用前景。PCR法存在假陽性和假陰性，但此法快速、簡便、特異且敏感，眾多的優點使其在臨床上可能得到廣泛應用。采用多重不對稱PCR方法結合反向線點雜交技術可以大大提高雜交的效率，而且操作方便。因此，研制和開發一種可利用導流雜交技術快速、簡便、特異、敏感檢測淋球菌、沙眼衣原體、解脲脲原體和細小脲原體的產品具有重要的意義
發明內容
:本發明提供一種淋球菌、沙眼衣原體、解脲脲原體和細小脲原體的檢測方法和試劑盒，包括:(I) 一種特殊設計的引物，該引物使用MAP方法(正在申請中)設計，每條引物有PU P2和P3這樣3個功能區構成，這種設計方法保證了引物有較寬泛的退火溫度范圍，使多重PCR擴增條件不兼容的情況大幅改善，提高了成功率，本弓I物在試劑盒內以IOx混合物形式存在。(2)本試劑盒提供了可以特異的鑒別4個病原體的引物序列和探針。(3) 一種特殊的擴增策略，稱為多重不對稱PCR(MAP)，該擴增方法可以產生大量單鏈核酸序列。(4) 一個預制的低密度尼龍膜基因芯片，其上帶有氨基酸臂修飾的特異性探針序列，每種探針可以檢測特異的病原體。(5)固體形式存在的PCR反應物，其配方為:UNG酶、熱啟動聚合酶、Tris-Hcl、KCl、dNTPs (AGCU)、]\%(:12、甘油、01^0、海藻糖、粘合劑。(6)陽性模板參考品和陰性參考品。(7)本發明使用反向線點雜交(RLB)方法進行核酸檢測，優化了反向線點雜交的程序，節約了部分時間。試劑盒方法:I)引物設計:引物設計使用發表在NCBI上不同病原體核酸序列的保守區域設計P3段引物，然后設計P2段和Pl段引物，其中用字母n代替hypoxanthine堿基，hypoxanthine堿基可以和四種堿基配對；對于每種病原體的引物序列群，其內引物5’端標記有生物素。 引物序列表:
可檢測病原體引物名引物序列號引物序列
沙眼衣原體MOFlSEQ ID N0.1 GtcaannnnGgattcctgtaacaacaagtcagg
權利要求
1.一種沙眼衣原體、解脲脲原體、細小脲原體和淋球菌的檢測方法和試劑盒，其特征在于包括固體形式存在的IOx PCR反應物(由引物混合物、tris-cl、KcUMgCl2、熱啟動聚合酶、UNG酶和凍干保護劑組成)、陽性對照品和含有生物素標記探針的尼龍膜；其特殊之處在于: a:特殊的三段式引物，其三段式引物設計及后繼的擴增為獨創的MAP(多重單鏈PCR擴增)技術，其序列為 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2、SEQ IDN0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQID N0.8、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.1USEQID N0.12、SEQ ID N0.13、SEQ ID N0.14、SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.16 ； b:特殊的探針，所選取的4個探針具有良好的特異性和保守性，即可以區分不同的病原體，又可以檢出特定的病原體，分別為SEQ ID N0.17，SEQ IDN0.18，SEQ ID N0.19，SEQID N0.20 ； c:特殊的存儲條件:本試劑盒為PCR反應物提供了固體形式的存儲方式； d:反應條件通過優化，大致分為兩個階段，其中第一階段為富集階段，本階段使用濃度極低的3個引物和一個過量的正向引物，反應溫度一般為50°C左右，擴增階段低濃度引物將被消耗完，隨后第二階段僅有正向引物工作，隨著擴增的進行，將產生大量的單鏈目的核苷酸序列； e:對于每個位點，本試劑盒提供了 2對引物或2對以上引物進行靶序列富集，這樣使其特異性和敏感性大大增強； f:本試劑盒包括了預處理的標記探針的尼龍膜。
2.權利要求1所述試劑盒，其引物設計為三段式，由P1，P2和P3構成，其中Pl為模板特異性的或者人工合成非模板特異性寡聚核苷酸，P2為一段特殊堿基，P3為模板特異性序列。
3.權利要求2所述引物，其P1，P2，P3組合方式是可變的，一般為pl，p2，p3順序組合，也可以是p2，pi, p3組合，p2也可以鑲嵌于pi序列中。
4.權利要求1中的試劑盒，其凍干保護劑成分由海藻糖，甘油和粘合劑組成。
5.權利要求1中的試劑盒，標記生物素的探針預先固定在尼龍膜上。
6.權利要求1中的試劑盒，其PCR產物的檢測方法為反向線點雜交、page膠電泳、熒光per檢測、斑點雜交,反向斑點雜交、液相雜交平臺、毛細管電泳。
全文摘要
本發明提供了一種沙眼衣原體、解脲脲原體、細小脲原體和淋球菌的檢測方法和試劑盒，其特征在于使用了MAP方法設計引物，每條引物由3段構成，此設計能使引物的退火溫度變得寬泛；對于每個病原體設計了4個引物，擴增反應包括富集階段和擴增階段，擴增時僅有內引物標記生物素并且過量；提供了固體形式存在的PCR反應物，預制的生物素標記探針的尼龍膜和陽性對照品。
文檔編號C12Q1/04GK103184272SQ201110448520
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者劉濤, 吳大治, 夏懿 申請人:上海復星醫學科技發展有限公司, 上海復星醫藥(集團)股份有限公司