專利名稱：宮頸癌易感基因無創檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種宮頸癌易感基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估宮頸癌發病的風險級別，并作為預防和治療宮頸癌的方向指導。
背景技術：
宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發病率在女性惡性腫瘤中居第二位，其死亡率逐漸上升至首位。據世界衛生組織(WHO)統計，每年估計有46. 6萬左右的宮頸癌新發病例，其中80%的病例發生在發展中國家。我國每年有新發病例約14萬，占世界宮頸癌新發病例總數的1/3，發病率是一些發達國家的6倍。宮頸癌的病因一直為國內外學者所重視并進行了大量的工作，發現病毒感染，如人乳頭瘤病毒(human papillomaviruses，HPVs)、單純皰疹病毒(HSV)感染等。其中HPV感染是宮頸癌的主要病因。近年來，人乳頭狀瘤病毒(HPV)E6蛋白對P53蛋白的降解、滅活與宮頸癌發生有關的觀點已被廣泛接受。最近的研究表明，P53基因第72位密碼子多態性導致HPV E6誘導 P53蛋白降解的易感性不同，含有精氨酸(Arg)的P53蛋白比含有脯氨酸(Pro)的P53蛋白更易與HPV E6蛋白結合而被降解，Arg/Arg基因型在宮頸癌中所占比例明顯高于正常宮頸組織，是雜合型的7倍，因此認為Arg/Arg基因型是發生宮頸癌的危險因素。除了 P53基因多態性與宮頸癌發生有相關性之外，代謝酶基因多態性與宮頸癌的關系也引起了各國學者的關注。谷胱甘肽硫轉移酶(GSTs)屬于II相代謝酶，能促進各種親電子的化合物(包括環境致癌物及其中間代謝產物)與谷胱甘肽結合，形成易溶于水的化合物排除體外，是與毒物或致癌物的解毒代謝有關的酶類，已知人類GSTs家族中GSTMl 和GSTTl與腫瘤發生的關系比較密切。GSTMl具有present和null兩個等位基因，其中 present具有正常的酶活性，而null基因是指結構基因缺失的純合子，又稱為空白基因型， 缺乏GSTMl酶活性。GSTTl基因多態現象與GSTMl類似，亦存在缺乏GSTTl酶活性的缺失型基因。正常的GSTMl和GSTTl酶活性可能通過促進致癌劑的親電作用及從體內的排除而保護易感組織，防止體細胞的DNA突變，而GSTMl或GSTTl基因的純和缺失可能會降低或喪失機體代謝及排出致癌物的功能，從而具有較大的腫瘤危險性。因此可以將GSTMl和GSTTl 基因的缺失基因型作為宮頸癌發生的危險因素之一。膳食中葉酸的缺乏及體內葉酸水平低也會增加宮頸癌的發病風險，持續服用葉酸制劑可以改善宮頸上皮異常。MTHFR在葉酸代謝過程中是葉酸活化的核心酶，研究發現 MTHFR基因上C677T多態性位點突變可以導致酶的熱穩定性和酶活性的下降，從而引起DNA 甲基化出現異常，這種甲基化異常可能導致癌基因和抑癌基因表達異常，影響對細胞生長和功能的調控，促進癌癥的發生。因而，MTHFR基因的多態性與宮頸癌的發生密切相關。綜上所述，鑒于P53、GSTMl、GSTTl和MTHFR在宮頸癌變過程中有著不可忽視的作用，可以將上述基因作為遺傳易感因素來檢測出女性在宮頸癌發生相關的基因單核苷酸位點基因型，及時篩查出易患宮頸癌的女性高危人群，從而有針對性的預防和治療宮頸癌，這對于降低女性宮頸癌的發病率有非常重要的意義。

發明內容
基于P53 基因上 Arg72Pro(rs 1042522)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)， GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR基因上C677T(rsl801133)的4個單核苷酸多態性位點基因型可作為評估宮頸癌發病的危險因子的基礎上，本發明提供一種宮頸癌易感基因檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測P53 基因上 Arg72Pro(rsl042522)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)， GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR基因上C677T(rsl801133)的4個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物； PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)；PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應體系10 X PCR 反應緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ；20uM特異性引物對(每條引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產物純化體系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ； ddH203. 875uL·測序反應體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測序引物 Iul ； 125mMEDTA 溶液 Iul ； 100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1.檢測試劑盒的使用1、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴增反應使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對(1) P53 (Arg72Pro)正向引物5 ‘ CGTTCTGGTAAGGACAAGGGTT3 ‘ P53 (Arg72Pro)反向引物5 ‘ AAGAAGCCCAGACGGAAACC3 ‘
(2)GSTM1 (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3‘ GSTMl (Nul Ι/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3‘C3)GSTT1 (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3‘ GSTTl (Nu 11/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3‘(4)MTHFR(C677T)正向引物5' CATCCCTCGCCTTGAACAG3‘ MTHFR(C677T)反向引物5 ‘ CAGACACTGTTGCTGGGTTTT3‘PCR擴增的反應體系為10 X PCR反應緩沖液2. 5μ 1 ； 25mM的dNTP混合液0. 2 μ 1、 5U/ul Taq 酶 0. 125 μ 1、DNA 模板 1 μ 1 (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0. 25μ 1、 ddH20 19. 175μ 1 ；反應條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C 1 分鐘延長，循環28次，最后72°C延長5分鐘以上。3、PCR擴增產物純化使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物 20ul, lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min，72°C、20min。4、DNA測序反應使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物(l)P53(Arg72Pro)測序引物5' CGTTCTGGTAAGGACAAGGGTT3‘(2)GSTMl (Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3‘(3)GSTTl (Null/Present)測序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3‘(4)MTHFR(C677T)測序引物5' CATCCCTCGCCTTGAACAG3‘反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 測序引物lul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98 °C 2min,進行25個循環的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ；在4°C，3600rpm/min的轉速離心30min，輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul， 3600rpm/min離心15min，輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入測
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的 SNP位點的基因型。實施例2.對人們進行預防宮頸癌發病的基因無創檢測的服務1.采樣及抽提DNA由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提2.基因型檢測使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的P53基因上 Arg72Pro (rsl042522)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/!^resent)，MTHFR基因上C677T(rsl801133)的4個單核苷酸多態性位點分別進行DNA測序， 確定這4個SNPs位點的基因型。3.宮頸癌發病高危人群風險評估通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具宮頸癌易感基因風險評估分析報告單。 報告中詳細說明了受檢者P53基因上Arg72Pro(rsl042522)，GSTMl基因是否缺失(Null/ Present), GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)的 4個基因上SNP位點基因檢測信息以及遺傳風險評估結果。除此之外，根據受檢者的風險級別， 并由醫師向受檢者詳細說明和解讀宮頸癌易感基因無創檢測報告單。
權利要求
1.一種檢測宮頸癌易感基因無創檢測試劑盒，其特征在于檢測P53基因上 Arg72Pro (rsl042522)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/ I^resent)，MTHFR基因上C677T(rsl801133)的4個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA 溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對P53基因上 Arg72Pro(rsl042522)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失 (Null/Present), MTHFR基因上C677T (rsl801133)的4個單核苷酸多態性位點，能特異性擴增出包含這4個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是針對P53基因上 Arg72Pro (rsl042522)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/ Present)，MTHFR基因上C677T (rsl801133)的4個單核苷酸多態性位點而設計，能通過DNA 測序技術特異性檢測出上述4個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的4對特異性引物序列如下(1)P53 (Arg72Pro)正向引物5 ‘ CGTTCTGGTAAGGACAAGGGTT 3 ‘P53 (Arg72Pro)反向引物5 ‘ AAGAAGCCCAGACGGAAACC3 ‘(2)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3‘GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3‘(3)GSTTl(Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3‘GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3‘(4)MTHFR (C677T)正向引物5 ‘ CATCCCTCGCCTTGAACAG3 ‘MTHFR (C677T)反向引物5 ‘ CAGACACTGTTGCTGGGTTTT3 ‘。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的4條DNA測序引物序列如下(1)P53 (Arg72Pro)測序引物5 ‘ CGTTCTGGTAAGGACAAGGGTT3 ‘(2)GSTMl(Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3‘(3)GSTTl(Null/Present)測序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3‘(4)MTHFR(C677T)測序引物5'CATCCCTCGCCTTGAACAG3‘。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1)PCR反應體系10XPCR反應緩沖液2. 5ul，25mM dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產物純化體系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測序反應體系25%BigDyemixlul，3. 2uM DNA 測序引物 lul，125mMEDTA 溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ulo本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發明提供了一種檢測宮頸癌易感基因無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測P53基因上Arg72Pro(rs1042522)，GSTM1基因是否缺失(Null/Present)，GSTT1基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR基因上C677T(rs1801133)的4個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過檢測與宮頸癌發生密切相關的4個單核苷酸多態性位點的基因型來評估女性宮頸癌患病的風險級別，并最終根據每一位受檢者的基因檢測結果從基因層面指導女性有針對性的預防宮頸癌的發生，降低宮頸癌的發病幾率。本發明采樣方法是口腔黏膜細胞采樣，無痛、無創、避免了交叉感染。測序檢測結果準確，可靠，不必購置價格昂貴的進口專用儀器，方法易普及推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102517394SQ201110448388
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者姜麗, 潘加奎 申請人:解碼(上海)生物醫藥科技有限公司