專利名稱：卵巢癌易感基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種卵巢癌易感基因檢測(cè)試劑盒，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果從基因?qū)用嬖u(píng)估卵巢癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并作為預(yù)防和治療卵巢癌的方向指導(dǎo)。
背景技術(shù)：
卵巢癌是女性生殖器官常見(jiàn)的腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位。但因卵巢癌致死者，卻占各類婦科腫瘤的首位，對(duì)婦女生命造成嚴(yán)重威脅。卵巢癌之所以是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，是因?yàn)槠浒l(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速，70%-80%的卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，5年生存率僅為20% -30%，而早期卵巢癌患者的生存率可達(dá) 90%。因此提高卵巢癌的早期診斷水平、爭(zhēng)取有利的治療時(shí)機(jī)，對(duì)改善預(yù)后有重要意義。目前，卵巢癌易感基因檢測(cè)主要依據(jù)卵巢癌家族史和基因多態(tài)性診斷試驗(yàn)?；蚨鄳B(tài)性診斷實(shí)驗(yàn)主要圍繞MTHFR、GSTTl、CYPlBl基因進(jìn)行。MTHFR是葉酸代謝關(guān)鍵酶，催化5，10-亞甲基四氫葉酸不可逆的轉(zhuǎn)變成5_甲基四氫葉酸，后者作為葉酸在血漿和組織中存在的主要形式參與同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為S-腺苷甲硫氨酸的過(guò)程，而S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在機(jī)體代謝、DNA甲基化和核酸合成過(guò)程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因上C677T多態(tài)性位點(diǎn)突變可以導(dǎo)致酶的熱穩(wěn)定性和酶活性的下降，從而引起DNA甲基化出現(xiàn)異常，這種甲基化異常可能導(dǎo)致癌基因和抑癌基因表達(dá)異常，影響對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和功能的調(diào)控，促進(jìn)癌癥的發(fā)生。研究表明，MTHFR基因C677T 多態(tài)性與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTs)屬于II相代謝酶，能促進(jìn)各種親電子的化合物(包括環(huán)境致癌物及其中間代謝產(chǎn)物)與谷胱甘肽結(jié)合，形成易溶于水的化合物排除體外，是與毒物或致癌物的解毒代謝有關(guān)的酶類，已知人類GSTs家族中GSTMl和GSTTl與腫瘤發(fā)生的關(guān)系比較密切。GSTTl具有present和null兩個(gè)等位基因，其中present具有正常的酶活性，而null基因是指結(jié)構(gòu)基因缺失的純合子，又稱為空白基因型，缺乏GSTTl酶活性。正常的GSTTl酶活性可能通過(guò)促進(jìn)致癌劑的親電作用及從體內(nèi)的排除而保護(hù)易感組織，防止體細(xì)胞的DNA突變，而GSTTl基因的純和缺失可能會(huì)降低或喪失機(jī)體代謝及排出致癌物的功能，從而具有較大的腫瘤危險(xiǎn)性。因此可以將GSTTl基因的缺失基因型作為卵巢癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一。綜上所述，鑒于MTHFR、GSTTl、CYPlBl在卵巢癌變過(guò)程中有著不可忽視的作用，可以將上述基因作為遺傳易感因素來(lái)檢測(cè)出女性在卵巢癌發(fā)生相關(guān)的基因單核苷酸位點(diǎn)基因型，及時(shí)篩查出易患卵巢癌的女性高危人群，從而有針對(duì)性的預(yù)防和治療卵巢癌，這對(duì)于降低女性卵巢癌的發(fā)病率有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
基于MTHFR 基因上 C677T，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，CYPlBl 基因上Leu432Val的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型可作為評(píng)估卵巢癌發(fā)病的危險(xiǎn)因子的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種卵巢癌易感基因檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)MTHFR 基因上 C677T，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，CYPlBl 基因上 Leu432Val的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)及DNA測(cè)序引物；PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20等)；
PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；DNA測(cè)序反應(yīng)組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應(yīng)體系10 X PCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ；20uM特異性引物對(duì)(每條引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產(chǎn)物純化體系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ； ddH203. 875uL·測(cè)序反應(yīng)體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測(cè)序引物 Iul ； 125mMEDTA 溶液 Iul ； 100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1.檢測(cè)試劑盒的使用1、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細(xì)胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的PCR反應(yīng)組件，其中，含有下列引物對(duì)(1)MTHFR(C677T)正向引物5' CATCCCTCGCCTTGAACAG3‘ MTHFR(C677T)反向引物5 ‘ CAGACACTGTTGCTGGGTTTT3‘(WGSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3‘ GSTTl (Nu 11/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3‘(3) CYPlBl (Leu432Val)正向引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3 ‘ CYPlBl (Leu4 32Val)反向引物5 ‘ AGCCAGGATGGAGATGAAGAG3 ‘PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10 X PCR反應(yīng)緩沖液2. 5μ 1 ； 25mM的dNTP混合液0. 2 μ 1、 5U/ul Taq酶0. 125 μ 1、DNA模板 1 μ 1 (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 0. 25 μ 1、 ddH20 19. 175μ 1 ；
反應(yīng)條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C 1 分鐘延長(zhǎng)，循環(huán)28次，最后72°C延長(zhǎng)5分鐘以上。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化使用檢測(cè)試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應(yīng)體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物 20ul, lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37°C、15min，72°C、20min。4、DNA測(cè)序反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的測(cè)序反應(yīng)組件，其中，含有下列DNA測(cè)序引物(1)MTHFR(C677T)測(cè)序引物5' CATCCCTCGCCTTGAACAG3‘(2)GSTTl (Null/Present)測(cè)序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3‘(3)CYPlBl(Leu432Val)測(cè)序引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3‘反應(yīng)的體系為總體積5ul，包含PCR純化產(chǎn)物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 測(cè)序引物lul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98 °C 2min,進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ；在4°C，3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min，輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul， 3600rpm/min離心15min，輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入測(cè)
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測(cè)序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)DNA測(cè)序圖譜確定所檢測(cè)的 SNP位點(diǎn)的基因型。實(shí)施例2.對(duì)人們進(jìn)行預(yù)防卵巢癌發(fā)病的基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)的服務(wù)1.采樣及抽提DNA由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)受檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用酚氯仿法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提2.基因型檢測(cè)使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)受檢者基因組DNA的MTHFR基因上C677T，GSTTl基因是否缺失(Null/Present) ,CYPlBl基因上Leu432Val的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別進(jìn)行DNA測(cè)序，確定這3個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型。3.卵巢癌發(fā)病高危人群風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估通過(guò)對(duì)受檢者SNPs基因型的分析，出具卵巢癌易感基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說(shuō)明了受檢者M(jìn)THFR基因上C677T，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，CYPlBl 基因上Leu432Val的3個(gè)基因上SNP位點(diǎn)基因檢測(cè)信息以及遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果。除此之外， 根據(jù)受檢者的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并由醫(yī)師向受檢者詳細(xì)說(shuō)明和解讀卵巢癌易感基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)報(bào)告
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)卵巢癌易感基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒，其特征在于檢測(cè)MTHFR基因上C677T， GSTTl基因是否缺失(Null/Present) ,CYPlBl基因上Leu432Val的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測(cè)序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、SAP酶、ExoI酶、 BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)MTHFR 基因上C677T，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，CYPlBl基因上Leu432Val的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，能特異性擴(kuò)增出包含這3個(gè)SNPs位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測(cè)序引物是針對(duì)MTHFR基因上C677T，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，CYPlBl基因上Leu432Val的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)特異性檢測(cè)出上述3個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的DNA 測(cè)序引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的3對(duì)特異性引物序列如下(1)MTHFR(C677T)正向引物5‘CATCCCTCGCCTTGAACAG3‘MTHFR(C677T)反向引物5, CAGACACTGTTGCTGGGTTTT3‘(2)GSTTl(Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3‘GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3‘(3)CYPlBl (Leu432Val)正向引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3‘CYPlBl (Leu432Val)反向引物5' AGCCAGGATGGAGATGAAGAG3 ‘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的3條DNA測(cè)序引物序列如下(1)MTHFR(C677T)測(cè)序引物5'CATCCCTCGCCTTGAACAG3‘(2)GSTTl(Null/Present)測(cè)序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3‘(3)CYPlBl (Leu432Val)測(cè)序引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3 ‘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括=(I)PCR反應(yīng)體系10XPCR反應(yīng)緩沖液2. 5ul，25mM dNTP混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA聚合酶 0. 125ul，20uM 特異性引物對(duì)，每條引物各 0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產(chǎn)物純化體系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測(cè)序反應(yīng)體系25%BigDyemixlul，3. 2uM DNA 測(cè)序引物 lul，125mMEDTA 溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ulo本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)卵巢癌易感基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)MTHFR基因上C677T，GSTT1基因是否缺失(Null/Present)，CYP1B1基因上Leu432Val的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測(cè)序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測(cè)序反應(yīng)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過(guò)檢測(cè)與卵巢癌發(fā)生密切相關(guān)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型來(lái)評(píng)估女性卵巢癌患病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并最終根據(jù)每一位受檢者的基因檢測(cè)結(jié)果從基因?qū)用嬷笇?dǎo)女性有針對(duì)性的預(yù)防卵巢癌的發(fā)生，降低卵巢癌的發(fā)病幾率。本發(fā)明采樣方法是口腔黏膜細(xì)胞采樣，無(wú)痛、無(wú)創(chuàng)、避免了交叉感染。測(cè)序檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可靠，不必購(gòu)置價(jià)格昂貴的進(jìn)口專用儀器，方法易普及推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102424853SQ20111044842
公開(kāi)日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者姜麗, 潘加奎 申請(qǐng)人:解碼(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司