專利名稱：玉米光合作用組織和非光合作用組織晝夜節律的鑒定及其在改良作物方面的用途的制作方法
技術領域：
本發明整體涉及分子生物學領域。
背景技術：
晝夜循環是控制植物日節律和季節節律的一個主要環境因素。晝夜明暗轉變帶動內部晝夜節律鐘，晝夜節律鐘產生在不變的光照條件下自行維持的(自由運轉的)節律。晝夜節律鐘的一個簡化模型由三個基本組元組成輸入途徑，其能感光；核心振蕩器，其是產生節律的轉錄機制；以及輸出途徑，其控制各種發育和代謝過程，引起對晝夜周期的適當的生理適應(Barak, et al.，(2000) Trends Plant Sci 5 :517-522 (Barak 等人，2000年，《植物科學趨勢》，第 5 卷，第 517-522 頁)；Harmer，(2009) Annu Rev Plant Biol 60:
357-377 (Harmer，2009年，《植物生物學年評》，第60卷，第357-377頁))。內部時鐘和外部明/暗循環的適當同步使植物更強壯、存活率更高、競爭優勢更明顯(Dodd，et al.，(2005)Science 309 :630-633 (Dodd等人，2005年，《科學》，第309卷，第630-633頁))并且長勢更佳(Ni，et al.，(2009) Nature 457 :327-331 (Ni 等人，2009 年，《自然》，第 457卷，第 327-331頁))。到目前為止，植物晝夜節律系統的基因結構在擬南芥中闡述得最多(Mas，(2008)Trends Cell Biol 18 :273-281 (Mas，2008 年，《細胞生物學趨勢》，第 18 卷，第 273-281頁))。輸入途徑由兩套光受體組成，即感受紅光/遠紅光的光敏色素(PHYA-E)和感受UV-A/藍光的隱花色素(CRY1和CRY2)，它們在日間感知光并向核心振蕩器發送信號(Nemhauser, (2008) Curr Opin Plant Biol 11 :4-8 (Nemhauser, 2OO8 年，《植物生物學新見》，第11卷，第4-8頁))。核心振蕩器基因形成連鎖的轉錄反饋環路(Harmer andMcClung, (2009) Science 323 :1440-1441 (Harmer 和 McClung，2009 年，《科學》，第 323 卷，第 1440-1441 頁))。晨間環路由 MYB 樣轉錄因子 CCAl (CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED)和LHY(LATE ELONGATED HYP0C0TYL)組成，它們參與兩個不同環路的調控。在晨間環路中，CCA1/LHY負調控偽應答調控因子TOClOlMING OF CAB EXPRESSION I)和TCP樣轉錄因子 CHE(CCA1 HIKING EXPEDITION)的轉錄。T0C1/CHE 形成正調控 CCA1/LHY 轉錄的復合物(Pruneda-Paz, et al. , (2009) Science 323 1481-1485 (Pruneda-Paz 等人，2009年，《科學》，第323卷，第1481-1485頁))。在日間環路中，CCA1/LHY正調控PRR7和PRR9 (PSEUDO-RESPONSE RE⑶LAT0RS)的轉錄，二者都負調控CCA1/LHY。在晚間環路中，T0C1/CHE充當GI(GIGANTIA)的負調控因子，后者本身是TOCl的正調控因子。晚間基因ZTL(ZEITLUPE,降解蛋白的F_box蛋白)參與TOCl和PRR3蛋白的降解，提供在蛋白水平上對核心時鐘組分的調控(Mas, et al.，(2003) Nature 426 :567-570 (Mas等人，2003年，《自然》，第426卷，第567-570頁))。多個連鎖的轉錄環路使遺傳機制既保持穩固又不乏靈活性(Harmer(2009))。晝夜節律鐘產生節律輸出，從而調控許多植物發育和生理過程，包括生長(Nozue, et al.，(2007) Nature 448 :358-361 (Nozue 等人，2007 年，《自然》，第 448 卷，第 358-361 頁)；Nozue and Maloof, (2006) Plant Cell Environ 29 :396-408 (Nozue 和Maloof，2006年，《植物、細胞與環境》，第29卷，第396-408頁))、開花時間、一年生植物的塊莖形成、多年生植物的生長停止和頂芽形成(Lagercrantz, (2009) J Exp Bot 60:2501-2515 (Lagercrantz，2009年，《實驗植物學雜志》，第60卷，第2501-2515頁))、光合作用(Sun, et al.，(2003) Plant Mol Biol 53 :467-478 (Sun 等人，2003 年，《植物分子生物學》，第 53 卷，第 467-478 頁))、氮吸收(Gutierrez, et al. , (2008)Proc Natl AcadSci USA 105 :4939-4944 (Gutierrez等人，2008年，《美國國家科學院院刊》，第105卷，第4939-4944 頁))以及激素信號傳導和應激反應(Covington and Harmer, (2007)PLoS Biol5 e222 (Covington和Harmer，2007年，《公共科學圖書館 生物學》，第5卷，第e222頁)。然而，目前只是初步了解將晝夜節律鐘和輸出途徑關聯起來的分子節點(molecular nodes)。迄今為止，理解最清楚的關聯點是擬南芥和水稻開花時間的光周期調控。擬南芥時鐘基因GI及其水稻同源基因OsGI促進轉錄因子CO(CONSTANS)和0sC0(Hdl，HEADINGl)的表達，這兩個轉錄因子控制擬南芥的下游開花激活因子FT(FL0WERING LOCUS T)及其水稻同源基因 Hd3a (HEADING 3a)的轉錄(Michaels，(2009) Curr Opin Plant Biol 12 :75-80 (Michaels,2009 年，《植物生物學新見》，第 12 卷，第 75-80 頁)，Tsuji and Komiya, (2008)Rice I 25-35 (Tsuji和Komiya，2008年，《水稻》，第I卷，第25-35頁))。光周期敏感性途徑確保了在有利的條件下開花。有幾篇論文鑒定了擬南芥核心振蕩器與多種植物生理過程之間的分子關聯。節律性下胚軸生長是由兩個堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子PIF4和PIF5 (PHYT0CHR0M-INERACTING FACTOR)的正作用促進的，它們的轉錄水平由CCAl調控(Nozue, et al. , (2007) Nature 448 :358-361 (Nozue 等人，2007 年，《自然》，第 448 卷，第
358-361頁))。下胚軸生長也由植物激素生長素的游離水平獨立調控，生長素由生長素生物合成基因YUCCA8產生，該基因由時鐘依賴性Myb樣轉錄因子RVEl (REVEILLE I)直接控制(Rawat, et al.，(2009) Proc Natl Acad Sci USA 106 :16883-16888 (Rawat 等人，2009年，《美國國家科學院院刊》，第106卷，第16883-16888頁))。這是晝夜節律振蕩器與調控擬南芥幼苗生長的生長素網絡之間的直接關聯。PPR9/7/5基因的輸出途徑與中間代謝(主要是線粒體中的)，特別是三羧酸(TCA)循環的維持相關(Fukushima, et al. , (2009)ProcNatl Acad Sci USA106 :7251-7256 (福島等人，2009年，《美國國家科學院院刊》，第106卷，第7251-7256頁))。TOCl也與脅迫相關ABA激素有關聯，其將晝夜節律鐘與植物對干旱的反應聯系起來(Legnaioli，et al.，(2009) The EMBO Journal 28 :3745-3757 (Legnaioli 等人，2009年，《歐洲分子生物學學會會刊》，第28卷，第3745-3757頁))。芯片技術的應用揭示了擬南芥中晝夜節律對基因轉錄的普遍影響。這些研究主要集中在感光組織上，例如擬南芥蓮座。在綠色組織中，多達35%的擬南芥基因受晝夜節律調控(Covington, et al. , (2008) Genome Biol9 :R130 (Covington 等人，2008 年，《基因組生物學》，第 9 卷，第 R130 頁)；Harmer, et al. , (2000) Science 290 :2110-2113 (Harmer等人，2000 年，《科學》，第 290 卷，第 2110-2113 頁)；Ptitsyn, (2008) BMC Bioinformatics9(9) S18(Ptitsyn,2008年，《BMC生物信息學》，第9卷第9期，第S18頁))。雖然動物模型表明幾乎每個組織的轉錄程序都有很大的晝夜節律組分，但尚未對多種植物組織系統地評估晝夜光周期對轉錄的相對貢獻(Ptitsyn, et al. , (2006) PLoS Comput Biol 2 el6 (Ptitsyn等人,2006年，《公共科學圖書館計算生物學》,第2卷，第el6頁))。在前基因組時代，在玉米葉光合作用和葉伸長速率中觀察到晝夜變化，它們在中午達到峰值(Kalt-Torres and Huber, (1987) Plant Physiol 83 :294-298 (Kalt-Torres 和 Huber, 1987年 ，《植物生理學》，第 83 卷，第 294-298 頁)，Kalt-Torres, et al.，(1987)Plant Physiol83 :283-288 (Kalt-Torres 等人，1987 年，《植物生理學》，第 83 卷，第 283-288 頁)，Usuda,et al.，(1987) Plant Physiol83 :289-293 (Usuda 等人，1987 年，《植物生理學》，第 83 卷，第289-293頁))。在非光合作用的籽粒中也發現了胚乳特異性轉錄因子02(0paqUe 2)的晝夜變化，并且有人提出02活性由晝夜代謝物流量控制(Ciceri, et al.，(1999)PlantPhysiol 121 1321-1328 (Ciceri 等人，1999 年，《植物生理學》，第 121 卷，第 1321-1328頁))。Gl(gigzl)和CO(Conzl)的玉米同源基因被證明有晝夜節律，它們是控制擬南芥開花時間的光周期途徑中的晝夜節律鐘的直接輸出(Miller，et al.，(2008)Planta 227 1377-1388 (Miller等人，2008年，《植物》，第227卷，第1377-1388頁))，盡管溫帶玉米是開花不受白天長度調控的日中性植物。本研究鑒定了兩個TOCl同源基因ZmTOCa和ZmTOCb，它們分別定位于5號和4號染色體。兩個基因的轉錄都在6pm達到峰值，這與擬南芥TOCl基因表達相符。TOCl是偽應答調控因子(PRR)家族的成員，該家族由擬南芥和水稻中進化上保守的五個PRR基因組成(Murakami, et al. , (2007)Biosci Biotechnol Biochem 71 :1107-1110(Murakami 等人，2007年，《生物科學、生物技術與生物化學》，第71卷，第1107-1110頁)；Murakami，etal.，(2003) Plant Cell Physiol 44 :1229-1236 (村上等人，2003 年，《植物細胞生理學》，第44卷，第1229-1236頁))。除了兩個ZmTOCl同源基因外，本研究還鑒定了 ZmPRR73、ZmPRR37和ZmPRR59，它們是基于序列相似性水平根據水稻PRR基因命名的(村上等人，(2003))。還鑒定了兩個 ZEITLUPE 同源基因(Kim, et al.，(2007) Nature 449 :356-360 (Kim等人，2007年，《自然》，第449卷，第356-360頁))ZmZTLa和ZmZTLb,它們定位于2號和4號染色體。GIGANTIA的兩個玉米直系同源基因gigzlA和gigzlB此前已有描述(Miller，et al.，(2008) Planta 227 1377-1388 (Miller 等人，2008 年，《植物》，第 227 卷，第1377-1388頁))，在此確認了它們在穗和葉中的振蕩。安捷倫(安捷倫科技有限公司生命科學與化學分析事業部，美國特拉華州威明頓市森特威爾路2850號，19808-1610 (AgilentTechnologies, Inc., Life Sciences and Chemical Analysis,2850 Centerville Road,Wilmington, DE 19808-1610，USA))和億明達(億明達股份有限公司，美國加利福利亞圣地亞哥市鎮中心大道 9885 號，92121 (Illumina, Inc. , 9885Towne Centre Drive, San Diego,CA 92121 USA))分析都說明大部分已知的核心組元循環往復。通過RT-PCR分析進一步確認了核心組分ZmCCA、ZmLHY, ZmTOCla和ZmTOClb的循環。與葉組織相比，發育期穗中的核心組元的振幅減弱，但仍然強健。這些數據表明大部分植物核心振蕩器系統在非光合作用組織例如穗中起作用，但振蕩器輸出顯然與影響下游晝夜表達改變的轉錄機器遠遠分離。核心時鐘機構以及源于此的鄰近信號機構的組分可以例如改變或擴展源和庫例如葉和穗之間關系達到正向影響作物表現這樣的方式改進。已證實來自不同種質源的晝夜模式的大規模遺傳互補能增強組合的晝夜模式和表觀適應性(Ni，(2009))。


圖I :在玉米中起作用的晝夜核心時鐘組元、染色體位置和達到峰值表達水平的時間。圖2 :用 qRT-PCR 驗證 ZmCCAl、ZmLHY、ZmTOCla 和 ZmTOClb 的晝夜表達。圖3 :穗中晝夜表達的基因、染色體位置和達峰值表達水平的時間。圖4 =ZmCCAl和ZmLHY基因的外顯子/內含子結構圖5 :依時間富集的基因功能項的晝夜模式

發明內容
目前還沒有對玉米的晝夜/生理節律轉錄模式進行過系統研究。開始本研究工作，是為了用現代全基因組圖譜分析技術考察玉米中晝夜循環在調控基因轉錄中作用的范圍。設計了在天然未受干擾條件下的田間實驗，并采集了光合作用組織(即葉)和非光合作用組織(即發育期穗)的樣品。鑒定了數千個在玉米葉中顯著地循環的轉錄物。然而在非光合作用的穗中只有少至45個的少部分基因明顯地進行晝夜循環。其中許多是擬南芥核心振蕩器基因的玉米同源基因，表明核心晝夜節律基因是保守在玉米中的，且在光合作用組織和非光合作用組織中晝夜表達。在分析中鑒定了多個玉米晝夜調控的基因。總共471個序列，包括來自未成熟穗的序列、在葉組織中有聞振幅/大幅度循環的序列以及與NUE和碳氣功能相關的多種序列。這些序列包含0RF、編碼的多肽和與其相關的啟動子。以下列表包括本發明的一些實施例I. 一種分離出的多核苷酸,所述分離的多核苷酸選自a.多核苷酸，如用GAP算法在默認參數下確定的，所述多核苷酸與選自SEQ IDNO :1、2、3、4、5、6、7、8、20、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468 和 470 的多核苷酸的全長序列具有至少90%的序列同一性；其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有晝夜活動調節劑的功能；b.多核苷酸，所述多核苷酸選自 SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、20、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468和470的多核苷酸的全長序列具有至少90%的序列同一性；c.與(a)或(b)的多核苷酸完全互補的多核苷酸；d.由(a)或(b)的多核苷酸編碼的多肽；和e.多肽，如用GAP算法在默認參數下確定的，所述多肽與選自SEQ ID NO 185,187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、43 3、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、467、469 和471的多肽的全長序列具有至少90%的序列同一性。2. 一種重組表達盒，所述重組表達盒包含權利要求I所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸以有義或反義方向有效連接至啟動子。3. 一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求2所述的表達盒。4. 一種轉基因植物，所述轉基因植物包含權利要求2所述的重組表達盒。5.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述植物是單子葉植物。6.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述植物是雙子葉植物。7.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、稷、花生、甘蔗和可可。8. 一種轉基因種子，所述轉基因種子來自權利要求4所述的轉基因植物。9. 一種調整植物晝夜節律的方法，所述方法包括a.向植物細胞中引入重組表達盒，所述重組表達盒包含有效連接至啟動子的權利要求I所述的多核苷酸；和b.在植物細胞生長條件下培養所述植物；其中所述植物細胞中的晝夜節律被調制。10.根據權利要求9所述的方法，其中所述植物細胞來自選自以下的植物玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、稷、花生、甘蔗和可可。11. 一種調制植物中整株植物或晝夜節律的方法，所述方法包括a.向植物細胞中引入重組表達盒，所述重組表達盒包含有效連接至啟動子的權利要求I所述的多核苷酸；b.在植物細胞生長條件下培養所述植物細胞；和c.從所述植物細胞再生植物；其中所述植物中的晝夜節律被調制。12.根據權利要求11所述的方法，其中所述植物選自玉米、大豆、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、稷、花生和可可。13. 一種來源于對轉基因植物組織進行加工的方法的產品，所述轉基因植物組織表達編碼晝夜起作用的基因的分離多核苷酸，所述方法包括
a.用重組表達盒轉化植物細胞，所述重組表達盒包含多核苷酸，所述多核苷酸與選自 SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、20、40、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、3 24、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468和470的多核苷酸的全長序列具有至少90%的序列同一性；所述多核苷酸有效地連接至啟動子；和b.在植物細胞生長條件下培養所述轉化的植物細胞；其中所述轉化的植物細胞的生長被調制；c.在形成植物的條件下培養所述植物細胞，以在植物組織中表達所述多核苷酸；和d.對所述植物組織進行加工以獲得產品。14.根據權利要求13所述的轉基因植物，其中所述植物是單子葉植物。15.根據權利要求13所述的轉基因植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、甘蔗和稷。16.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述多核苷酸的過表達導致與未轉化的植物相比改善的植物生長。17.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述植物與未轉化的植物相比，表現出改善的源-庫關系。18.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述植物與未轉化的植物相比，具有
提聞的廣量。19. 一種調控多核苷酸分子，所述分子包含選自以下的序列(a) SEQ ID NO31-183 ;(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO :31-183之一的至少50-100個連續核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一個或多個晝夜調控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默認參數下確定的與SEQ ID NO :31-183之一的約500-1000個連續核苷酸至少90%的同一性。20. 一種嵌合多核苷酸分子，所述分子包含權利要求19所述的核酸片段。21.根據權利要求20所述的嵌合分子，所述分子包含所述晝夜調控元件和組織特異性表達元件。22.根據權利要求21所述的嵌合分子，其中所述組織特異性表達元件選自根特異性、維管束鞘細胞特異性、葉特異性和胚特異性表達元件。23.根據權利要求19所述的調控多核苷酸分子，其中所述調控多核苷酸分子是啟動子。24. 一種包含權利要求19所述的調控分子的構建體，所述調控分子有效連接至異源多核苷酸分子，其中所述異源分子賦予所關注的性狀。
25.根據權利要求24所述的構建體，其中所述所關注的性狀選自耐旱性、耐凍性、耐寒性、抗病性和昆蟲抗性。26.根據權利要求24所述的構建體，其中所述異源分子在源-庫代謝中起作用。27. 一種用權利要求19所述的調控分子轉化的轉基因植物。28.根 據權利要求27所述的轉基因植物，其是單子葉植物。29.根據權利要求27所述的轉基因植物，其選自玉米、大豆、卡諾拉油菜、棉花、向日葵、苜猜、甜菜、小麥、裸麥、水稻、甘鹿、燕麥、大麥、草坪草、高粱、稷、番爺、木豆、蔬菜、果樹和飼草。30. 一種增加植物產量的方法，所述方法包括在權利要求19所述的調控分子的控制下表達所關注的異源多核苷酸。31.根據權利要求30所述的方法，其中所述異源多核苷酸是晝夜調控的植物基因。32. 一種提高植物非生物脅迫耐性的方法，所述方法包括在權利要求19所述的調控分子的控制下在植物中表達一種或多種賦予非生物脅迫耐性的多核苷酸。33.根據權利要求32所述的方法，其中所述非生物脅迫耐性選自耐旱性、耐凍性和耐寒性。34.根據權利要求33所述的方法，其中所述賦予耐旱性的多核苷酸是在調控元件控制下表達的，其峰值表達發生于中午或傍晚左右。35.根據權利要求33所述的方法，其中所述賦予耐凍性或耐寒性的多核苷酸是在調控元件控制下表達的，其峰值表達發生于黎明或上午中間左右。36. 一種降低轉基因表達的產量抑制的方法，所述方法包括表達有效連接至調控多核苷酸分子的轉基因，所述調控多核苷酸分子包含選自以下的序列(a)SEQ ID NO31-183 ;(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO :31-183之一的至少50-100個連續核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一個或多個晝夜調控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默認參數下確定的與SEQ ID NO :31-183之一的約500-1000個連續核苷酸至少90%的同一性。37. 一種篩選涉及非生物脅迫耐性的候選基因的方法，所述方法包括(a)鑒定在組成性表達或組織特異性表達下表現產量抑制的一個或多個候選基因和(b)在引導晝夜表達模式的調控分子控制下表達所述候選基因。38.根據權利要求37所述的方法，其中所述調控分子包含選自以下的序列(a)SEQ ID NO :31-183 ;(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO :31-183之一的至少
50-100個連續核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一個或多個晝夜調控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默認參數下確定的與SEQ ID NO :31-183之一的約500-1000個連續核苷酸至少90%的同一性。
具體實施例方式除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語均具有本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。除非另外提出，否則本文所采用或所考慮的技術是本領域普通技術人員所熟知的標準方法。材料、方法和實例僅為示例性的而不是限制性的。以下內容以舉例說明的方式給出，而非意在限制本發明的范圍。下文將參照附圖更完整地描述本發明，其中示出了本發明的一些但并非全部實施例。事實上，這些公開內容可以多種不同形式呈現，不應理解為受限于本文所述的實施例；相反，這些實施例提供的目的是使本發明滿足適用的法律要求。類似的編號在全文中是指類似的要素。借助前面的描述和隨附的附圖中給出的教導，這些公開內容所屬領域的技術人員將會想到本文所述公開內容的許多修改形式和其他實施例。因此，應當了解，這些公開內容不限于所公開的特定實施例，并旨在將修改形式和其他實施例包括在本文末尾所附權利要求的范圍內。雖然本文采用了特定術語，但它們僅以一般性和描述性含義使用而不出于限制目的。 除非另外指明，否則本發明的實施將采用植物學、微生物學、組織培養、分子生物學、化學、生物化學和重組DNA技術的常規技術，這些技術處于本領域技能范圍內。這類技術在文獻中有完整的解釋。參見例如Langenheim and Thimann, BOTANY PLANT BIOLOGYAND ITS RELATION TO HUMAN AFFAIRS, John Wiley (1982)(Langenheim 和 Thimann，《植物學植物生物學及其與人類事務的關系》，約翰威立出版社，1982年)；CELL⑶LTURE ANDSOMATIC CELL GENETICS OF PLANTS, vol. 1，Vasil, ed. (1984)(《植物細胞培養與體細胞遺傳學》，第 I 卷，Vasil 編輯，1984 年)；Stanier, et al.，THE MICROBIAL WORLD, 5th ed.，Prentice-Hall (1986) (Stanier等人，《微生物世界》，第5版，普倫蒂斯·霍爾出版社，1986 年)；Dhringra and Sinclair, BASIC PLANT PATHOLOGY METHODS, CRC Press (1985)(Dhringra和Sinclair,《植物病理學基本方法》,CRC出版社，1985年)；Maniatis, et al.，MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL(1982) (Maniatis 等人，《分子克隆實驗指南》，1982 年)；DNA CLONING, vols. I and II,Glover, ed. (1985)(《DNA 克隆》，第 I 卷和 II 卷，Glover 編輯，1985 年)；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS, Gait, ed. (1984)(《寡核苷酸合成》，Gait 編輯，1984 年)；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, Hames and Higgins, eds. (1984)(《核酸雜交》，Hames 和 Higgins 編輯，1984 年)和叢書 METHODS IN ENZYM0L0GY, Colowick andKaplan, eds, Academic Press, Inc. ，San Diego, CA (《酶學方法》，Colowick 和 Kaplan 編輯，學術出版社，加州圣地亞哥)。單位、前綴和符號可以它們SI接受的形式表示。除非另外指明，核酸以5’到3’的方向從左向右書寫；而氨基酸序列以氨基到羧基的方向從左向右書寫。數值范圍包括限定該范圍的數字。氨基酸在本文中可通過它們通常知道的三字母符號表示或通過IUPAC-IUB生化命名委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推薦的單字母符號表示。同樣，核苷酸可通過它們通常接受的單字母密碼表示。下面定義的術語通過參考本說明書整體進行更完整的定義。在描述本發明時，將采用下面的術語，并采用下文所示的定義。所謂“微生物”意指任何微生物(包括真核微生物和原核微生物)，如真菌、酵母、細菌、放線菌、藻類和原生動物以及其他單細胞結構。所謂“擴增”意指構建核酸序列的多個拷貝或與該核酸序列互補的多個拷貝，該構建是利用所述核酸序列中的至少一者作為模板進行。擴增系統包括聚合酶鏈式反應(PCR)系統、連接酶鏈反應(LCR)系統、基于核酸序列的擴增(NASBA，安大略省密西沙加加拿大基因公司(Cangene, Mississauga, Ontario))、Q-β復制酶系統、基于轉錄的擴增系統(TAS)和鏈置換擴增(SDA)。參見例如 DIAGNOSTIC MOLECULAR MICROBIOLOGY PRINCIPLES ANDAPPLICATIONS，Persing，et al. ,eds. ,American Society for Microbiology,Washington,DC(1993)(《診斷分子微生物學原理和應用》，Persing等人編輯，《美國微生物學會》，華盛頓，1993年)。擴增的產物稱為擴增子。術語“保守修飾的變體”同時適用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列而言，保守修飾的變體指編碼氨基酸序列的相同的或保守修飾的變體的那些核酸。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能上相同的核酸編碼任何給定蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU全部編碼丙氨酸這種氨基酸。因而，在每個由密碼子規定丙氨酸的位置，可將該密碼子變更為所描述的相應密碼子的任一種而不會改變所編碼的多肽。這種核酸變異為“沉默變異”，代表保守修飾變異的一種。編碼多肽的本文每種核酸序列還描述了該核酸的每種可能的沉默變異。普通技術人員將認識到，核酸中的每個密碼子(除了 AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密碼子；一個例外是紅色微球菌(Micrococcus rubens),對其而言GTG是甲硫氨酸密碼子(Ishizuka, et al. , (1993) J. Gen. Microbiol. 139 :425-32 (Ishizuka 等人，1993 年，《普通微生物學雜志》，第139卷，第425-432頁))都可以被修改以獲得功能相同的分子。因此，編碼本發明多肽的核酸的每種隱匿的變異均隱含在每種所描述的多肽序列中并以引用的方式并入本文。對于氨基酸序列，技術人員將認識到，對核酸、肽、多肽或蛋白序列作出的會改變、添加或缺失所編碼的序列中的單個氨基酸或一小部分氨基酸的各個置換、缺失或添加，在該變更導致氨基酸為化學類似的氨基酸所置換時，為“保守修飾的變體”。因而，還可變更選自I至15的整數的任何數目的氨基酸殘基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10個變更。保守修飾的變體通常提供與它們所源自的未經修飾的多肽序列類似的生物活性。例如，底物特異性、酶活性或配體/受體結合通常為天然蛋白對于其天然底物的至少30%、40%、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %，優選60-90 %。提供功能上相似的氨基酸的保守置換表是本領域所熟知的。下面的六個組各含有對彼此而言是保守置換的氨基酸I)丙氨酸(A)、絲氨酸⑶、蘇氨酸⑴；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸⑷；5)異亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、繳氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。另參見Creighton, PROTEINS, ff. H. Freeman and Co. (1984) (Creighton,《蛋白質》，ff. H.弗里曼公司，1984年)。如本文所用，“基本上由......組成”意指在如下情況下目標多核苷酸可包括額
外的序列該額外的序列在嚴格雜交條件下不會選擇性地雜交至與該多核苷酸所雜交的cDNA相同的cDNA，且該雜交條件包括在0. IX SSC^PO. I %十二烷基硫酸鈉中在65°C下進行的洗滌步驟。就指定的核酸而言，所謂“編碼”意指包含翻譯成指定蛋白質的信息。編碼蛋白質的核酸可在該核酸的翻譯區內包含非翻譯序列(例如內含子)，或可缺少這種居間的非翻譯序列(例如，如在cDNA中)。據以編碼蛋白質的信息是通過使用密碼子來確定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遺傳密碼來編碼。然而，當用例如某些植物、動物和真菌線粒體、細菌山羊支原體(Mycoplasma capricolum) (Yamao, et al. , (1985) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82 :2306-9 (Yamao等人，1985年，《美國國家科學院院刊》，第82卷，第2306-2309頁))或纖毛蟲大核表達核酸時，可使用這些生物體中存在的通用密碼的變體。
當通過合成法制備或改變核酸時，可利用將在其中表達核酸的預期宿主的已知密碼子偏好性。例如，盡管本發明的核酸序列在單子葉植物物種和雙子葉植物物種中都可表達，但可對序列進行修飾以解決單子葉植物或雙子葉植物的特定密碼子偏好性和GC含量偏好性，因為這些偏好性已被證實不同(Murray, et al. , (1989)Nucleic Acids Res. 17 477-98 (Murray等人，《核酸研究》，第17卷，第477-498頁)，該文獻以引用方式并入本文)。因而，具體氨基酸的玉米優選密碼子可由來自玉米的已知基因序列得出。關于來自玉米植物的28種基因的玉米密碼子使用在Murray等人(出處同上)的表4中列出。如本文所用，針對核酸的“異源”為起源于外來物種的核酸，或者，如果起源于相同物種的話，則為通過蓄意的人為干預對其天然形式在組成和/或基因座方面進行實質性修飾的核酸。例如，有效連接至異源結構基因的啟動子是來自不同于衍生該結構基因的物種的物種，或者如果是來自相同的物種，則對一者或二者由其初始形式進行了實質性的修飾。異源蛋白質可起源于外來物種，或者，如果起源于相同物種，則通過蓄意的人為干預對其天然形式進行了實質修飾。所謂“宿主細胞”意指含有載體并且支持該表達載體的復制和/或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌，或真核細胞如酵母、昆蟲、植物、兩棲動物或哺乳動物細胞。優選地，宿主細胞是單子葉植物細胞或雙子葉植物細胞，包括但不限于玉米、高粱、向日葵、大豆、小麥、苜蓿、水稻、棉花、卡諾拉油菜、大麥、稷和番茄。特別優選的單子葉宿主細胞是玉米宿主細胞。術語“雜交復合體”包括指由兩條相互選擇性雜交的單鏈核酸序列形成的雙鏈核酸結構。在將核酸插入細胞的語境中，術語“引入”意指“轉染”或“轉化”或“轉導”，包括指將核酸并入真核或原核細胞中，其中該核酸可并入細胞的基因組(例如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)中，轉化成自主復制子或瞬時表達(例如，轉染的mRNA)。術語“分離的”指諸如核酸或蛋白質之類的物質，該物質實質上或基本上不含在其天然存在的環境中發現的通常與其相伴隨或與其相互作用的組分。分離的物質任選包含未發現在其天然環境中與其一起的物質。如本文所定義，“分離的”核酸也稱為“異源”核酸。除非另有規定，否則術語“晝夜核酸”意指包含編碼晝夜多肽的多核苷酸(“晝夜多核苷酸”)的核酸。如本文所用，“核酸”包括指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否則涵蓋在以下方面具有天然核苷酸的基本性質的已知類似物其以與天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式雜交至單鏈核酸。所謂“核酸文庫”意指分離的DNA或RNA分子的集合，其包含且基本上代表指定生物體的基因組的整個被轉錄的部分。示例性的核酸文庫如基因組文庫和cDNA文庫的構建在標準的分子生物學參考書有教導，如Berger and KimmeUUIDE TO MOLECULAR CLONINGTECHNIQUES (Berger 和 Kimmel，《分子克隆技術指南》)，選自叢書 METHODS IN ENZYM0L0GY,vol. 152,Academic Press, Inc. , San Diego,CA(1987)(《酶學方法》，第 152卷，學術出版社，加州圣地亞哥，1987年)；Sambrook，et al. ,MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, 2nded. ,vols. 1-3(1989) (Sambrook等人,《分子克隆實驗指南》,第二版,第1-3卷，1989年)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Ausubel,et al. ,eds,Current Protocols, ajoint venture between Greene Publishing Associates, Inc.and John Wiley & Sons,Inc. (1994 Supplement)(《最新分子生物學實驗方法匯編》,Ausubel等人編輯,選自《實驗室指南》，格林出版聯合公司與約翰威立父子出版公司的合資公司)。如本文所用，“有效連接”包括指第一序列(如啟動子)和第二序列之間的功能性連接，其中啟動子序列起始或介導對應第二序列的DNA的轉錄。一般來講，有效連接意指被連接的核酸序列是連續的，并且如果有必要連接兩個蛋白質編碼區的話，是連續的且在相同的閱讀框內。 如本文所用，術語“植物”包括指整個植株、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子和植物細胞和它們的子代。如本文所用，植物細胞包括但不限于種子懸浮培養物、胚、分生組織區、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉和小孢子。可用于本發明方法的植物種類通常與適用于轉化技術的高等植物種類一樣寬泛，包括單子葉植物和雙子葉植物，包括以下屬的種南瓜屬(Cucurbita)、薔薇屬(Rosa)、葡萄屬(Vitis)、胡桃屬(Juglans)、草莓屬(Fragaria)、百脈根屬(Lotus)、苜猜屬(Medicago)、驢食草屬(Onobrychis)、三葉草屬(Trifolium)、胡蘆巴屬(Trigonella)、紅豆屬(Vigna)、柑桔屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鶴草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(Daucus)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)、白芥屬(Sinapis)、顛爺屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼陀羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、番爺屬(Lycopersicon)、煙草屬(Nicotiana)、爺屬(Solanum)、碧冬爺屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、馬珠草屬(Majorana)、菊苣屬(Ciahorium)、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、萱草屬(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵屬(Pelargonium)、黍屬(Panieum)、狼尾草屬(Pennisetum)、毛茛屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、蛾蝶花屬(Salpiglossis)、黃瓜屬(Cucumis)、布洛華麗屬(Browaalia)、大豆屬(Glycine)、豌豆屬(Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、黑麥草屬(Lolium)、稻屬(Oryza)、燕麥屬(Avena)、大麥屬(Hordeum)、黑麥屬(Secale)、蔥屬(Allium)和小麥屬(Triticum)。特別優選的植物是玉米。如本文所用，“產量”包括指收獲時針對谷粒水分(通常是15% )進行了修正后的每英畝谷類作物的蒲式耳數。谷粒水分是在收獲時的谷粒中測量。谷粒的調整后測試重量被確定為對收獲時谷粒水分含量做了修正之后的每蒲式耳的磅重。如本文所用，改善的“源-庫”關系包括指與籽粒灌漿中同化物的供給(即源)和需求(即庫)間的比例改善相關的特性。如本文所用，“多核苷酸”包括指脫氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其類似物，所述類似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性質在嚴格雜交條件下其所雜交的核苷酸序列與天然存在的核苷酸所雜交的核苷酸序列基本上相同，和/或可翻譯成與天然存在的核苷酸所翻譯的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或異源結構基因或調控基因的全長序列或其亞序列。除非另外指明，否則該術語包括指代指定的序列及其互補序列。因而，為了穩定性或為了其他原因對主鏈進行了修飾的DNA或RNA是如該術語在本文所意指的“多核苷酸”。此外，包含稀有堿基(如次黃嘌呤核苷)或修飾堿基(如三苯甲基化的堿基)(僅舉兩個實例)的DNA或RNA是多核苷酸(如該術語在本文所用的)。應當理解，已對DNA和RNA進行了很多種修飾，這些修飾起到本領域技術人員已知的許多有用目的。本文所用的術語多核苷酸涵蓋多核苷酸的這類經化學修飾、酶修飾或代謝修飾的形式，以及病毒和細胞(包括特別是簡單細胞和復雜細胞)特征性的DNA和RNA的化學形式。術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。這些術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基為相應的天然存在的氨基酸的人工化學類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所用，“啟動子”包括指DNA的在轉錄起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋白質(例如轉錄因子)的識別和結合以起始轉錄的區域。“植物啟動子”是能夠引發在植物細胞中的轉錄的啟動子。示例性的植物啟動子包括但不限于從植物、植物病毒和包含在植物細胞中表達的基因的細菌獲得的那些啟動子，所述細菌如農桿菌(Agrobacterium)或根瘤菌(Rhizobium)。例子為優先起始在某些組織，例如葉、根、種子、纖維、木質部導管、管胞或厚壁組織中的轉錄的啟動子。這種啟動子被稱為“組織偏好的”。“細胞類型”特異性啟動子主要驅動在一個或多個器官中某些細胞類型中的表達，例如根或葉中的維管細胞。“誘導型”或“調控型”啟動子是處于環境控制下的啟動子。可實現通過誘導型啟動子進行的轉錄的環境條件的實例包括無氧條件或光的存在。另一類型的啟動子是發育調節啟動子，例如在花粉發育過程中驅動表達的啟動子。組織優選的、細胞類型特異性的、發育調節的和誘導型的啟動子構成了 “非組成型”啟動子類別。“組成型”啟動子是在大多數環境條件下活躍的啟動子。如本文所用，“調控元件”或“調控多核苷酸”指調整與所述調控元件相關的可轉錄多核苷酸的表達的核酸片段。這種關聯可能以順式出現。植物啟動子也可以用作調整有效連接至所述啟動子的特定基因的表達的調控元件。當有效連接至可轉錄多核苷酸分子時，調控元件影響所述可轉錄多核苷酸分子的轉錄模式。“順式元件”或“順式作用元件”指影響基因表達的順式作用的轉錄調控元件。順式元件可以具有結合調整轉錄的轉錄因子、反式作用蛋白質的功能。本文公開的晝夜啟動子可包含一個或多個提供晝夜基因表達模式的順式元件。本文公開的植物啟動子和調控元件可包括通過啟動子工程產生的核苷酸序列，SP組合已知啟動子和/或調控元件以產生人工的、合成的、嵌合的或雜交的啟動子。這些啟動子也可以組合來自一個或多個啟動子的順式元件,例如通過向包含晝夜表達調控元件的啟動子添加異源組織特異性調控元件。因此，設想了包含至少一個本文公開的啟動子的順式元件，用于調整有效連接的多核苷酸序列的表達的嵌合或雜交啟動子的設計、構建和使用。本文公開的啟動子序列(包括SEQ ID NO :31-183及其片段，包括例如其50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800,1900,2000和最多2500個連續核苷酸并與這些片段具有約80%或85%或90%或95%或99%同一性)預期用于調整一個或多個異源基因的表達模式。在此語境下的術語“異源”指所關注的核苷酸的表達由不是所述核苷酸自身啟動子的啟動子序列或其片段調整。根據本文提供的指導，本領域普通技術人員可以容易地制備本文公開的多個啟動子序列的缺失構建體。選擇位于公開的調控元件3’或5’端側翼的約25-50個連續核苷酸用于調整基因表達。也進行了突變分析以增強晝夜調控的特異性。術語“晝夜多肽”指一條或多條氨基酸序列。該術語還包括其片段、變體、同源物、等位基因或前體(例如原前蛋白或前蛋白)。“晝夜蛋白質”包括晝夜多肽。除非另有規定，否則術語“晝夜核酸”意指包含編碼晝夜多肽的多核苷酸(“晝夜多核苷酸”)的核酸。如本文所用，“重組的”包括指已通過引入異源核酸進行修飾的細胞或載體，或者源于經這樣修飾過的細胞的細胞。因而，例如，重組細胞表達不以天然(非重組)形式的細胞內的相同形式存在的基因，或因為蓄意人為干預而表達原本異常表達、表達不足或根本不表達的天然基因。如本文所用，術語“重組的”不涵蓋通過天然發生的事件(例如自發突變、天然轉化/轉導/轉座)進行的細胞或載體的變更，所述事件為例如在沒有蓄意人為干預的情況下發生的那些。
如本文所用，“重組表達盒”是具有一系列規定核酸元件的通過重組法或合成法產生的核酸構建體，其允許特定核酸在靶細胞中轉錄。可將重組表達盒摻入到質粒、染色體、線粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了別的序列以外，表達載體的重組表達盒部分還包含待轉錄的核酸和啟動子。術語“殘基”或“氨基酸殘基”或“氨基酸”在本文中可互換使用，指并入蛋白質、多肽或肽(統稱“蛋白質”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另外進行限制，否則可涵蓋可以以與天然存在的氨基酸類似的方式發揮功能的天然氨基酸已知類似物。術語“選擇性雜交”包括指在嚴格雜交條件下核酸序列與指定的核酸靶序列雜交的程度比其與非靶序列雜交的程度可檢測地更高(例如，至少2倍于背景)，并且基本上排除非靶核酸。選擇性雜交的序列通常相互具有約至少40%的序列同一性，優選60-90%的序列同一'I"生，最優選ioo%的序列同一'丨生(即互補性)。術語“嚴格條件”或“嚴格雜交條件”包括指探針與其靶序列雜交的程度將比它與其他序列雜交的程度可檢測地更高(例如，至少2倍于背景)的條件。嚴格條件是序列依賴性的，在不同的環境中將會不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可鑒別與探針可最高達100%互補的靶序列(同源探測)。或者，可調節嚴格性條件以允許序列中有一些錯配，以使得檢測到較低程度的相似性(異源探測)。優選地，探針長為大約500個核苷酸，但長度可變化很大，從小于500個核苷酸到等于靶序列的整個長度。通常，嚴格條件將為其中鹽濃度低于約I. 5M鈉離子，通常為約O. 01至I. OM鈉離子濃度(或其他鹽)，pH為7. O至8. 3，對短探針(例如，10至50個核苷酸)而言溫度為至少30°C，對長探針(例如超過50個核苷酸)而言溫度為至少約60°C的那些條件。嚴格條件還可通過添加去穩定劑如甲酰胺或Denhardt’ s來實現。示例性的低嚴格性條件包括在37°C下用30至35%甲酰胺、IM NaCl、I % SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液雜交，并在50至55°C下在IX至2X SSC(20X SSC = 3. OM NaCl/0. 3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性的中等嚴格性條件包括37°C下在40至45%甲酰胺、IM NaClU % SDS中雜交，并在55至60°C下在O. 5X至IX SSC中洗滌。示例性的高嚴格條件包括在50%甲酰胺、IM NaClU%SDS中于37°C下雜交，并在O. IX SSC中于60_65°C下洗滌。特異性通常決定于雜交后的洗滌，關鍵因素為最終洗滌溶液的離子強度和溫度。對于DNA-DNA雜交體，Tm可由Meinkothand Wahl, (1984)Anal. Biochem. 138 :267-84(Meinkoth 和 Wahl, 1984 年，《分析生物化學》，第 138 卷，第 267-284 頁)的方程 T111 = 81. 5°C +16. 6 (log Μ) +0. 41(% GC) -O. 61(%form)-500/L估計；其中M為單價陽離子的摩爾濃度，％ GC為DNA中鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form為雜交溶液中甲酰胺的百分比，L為雜交體的長度(單位為堿基對)。TmS 50%的互補靶標序列與完美匹配的探針雜交時的溫度(在確定的離子強度和PH下)。每1%的錯配，Tm降低約1°C ;因此，可調節Tm、雜交和/或洗滌條件以雜交至所需同一性的序列。例如，如果尋求具有彡90%同一性的序列，則可將Tm降低10°C。通常，將嚴格條件選擇為比特定序列及其互補序列在確定的離子強度和PH下的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C。然而，極端嚴格條件可以采用比熱解鏈溫度(Tm)低1、2、3或4°C的雜交和/或洗滌；適度嚴格條件可以采用比熱解鏈溫度(Tm)低6、7、8、9或10°C的雜交和/或洗滌；低嚴格條件可以采用比熱解鏈溫度(Tm)低11、12、13、14、15或20°C的雜交和/或洗滌；利用該公式、雜交和洗滌組成以及所需的Tm，普通技術人員將認識到雜交和/或洗滌溶液的嚴格性的變化固有地得到了描述。如果所需的錯配程度導致^低于45°C (水溶液) 或32°C (甲酰胺溶液)，則優選增加SSC濃度以使得可使用較高的溫度。有關核酸雜交的詳盡指南可在如下文獻中找到Tijssen，LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY ANDMOLECULAR BI0L0GY—HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, part I, chapter 2，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probeassays, ^lsevierjNew York (1993) (Tijssen,《生物化學和分子生物學實驗技術-與核酸探針的雜交》，第I部分，第2章，“有關雜交原理和核酸探針分析策略的綜述”，愛思唯爾，紐約，1993 年)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, chapter 2，Ausubel，et al.，eds, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York(1995)(《最新分子生物學實驗方法匯編》，第2章,Ausubel等人編輯,格林出版社與Wiley-Interscience,紐約，1995年)。除非另有規定，否則在本專利申請中，高嚴格性定義為在4X SSC、5X Denhardt/ s (5gFicolI，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g牛血清白蛋白于500ml水中)、O. lmg/ml煮沸的鮭精DNA和25mM磷酸鈉中在65°C下雜交，和在O. IX SSC,O. 1% SDS中在65°C下洗滌。如本文所用，“轉基因植物”包括指在其基因組內包含異源多核苷酸的植物。一般來講，異源多核苷酸穩定地整合在基因組內使得該多核苷酸得以傳遞到連續世代。異源多核苷酸可單獨整合進基因組中，或者作為重組表達盒的一部分整合進基因組中。“轉基因”在本文中用來包括任何其基因型已因異源核酸的存在而被變更的細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初如此變更的轉基因以及那些通過從最初的轉基因進行有性雜交或無性繁殖而產生的轉基因在內。如本文所用，術語“轉基因”不涵蓋通過常規植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座或自發突變之類的自然發生事件導致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)的改變。如本文所用，“載體”包括指用于轉染宿主細胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。載體常常是復制子。表達載體允許插入其中的核酸轉錄。以下術語用于說明兩個或更多個核酸或多核苷酸或多肽之間的序列關系(a) “參考序列”、(b) “比較窗口”、(c) “序列同一性”、(d) “序列同一性百分數”和(e) “基本上全同”。如本文所用，“參考序列”是用作序列比較基準的確定的序列。參考序列可以是指定序列的子集或全部；例如全長cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。如本文所用，“比較窗口”意指包括指多核苷酸序列的連續和指定的片段，其中多核苷酸序列可與參考序列進行比較并且其中該比較窗口中的該多核苷酸序列部分相比于參考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便兩條序列的最佳比對。通常，比較窗口長度為至少20個連續的核苷酸，任選可為30、40、50、100個或更長。本領域技術人員認識到，為避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的與參考序列的高度相似性，通常引入空位罰分并從匹配數扣除空 位罰分。將核苷酸和氨基酸序列進行比對以作比較的各種方法是本領域公知的。局部同源性算法(BESTFIT)(Smith and Waterman, (1981)Adv. Appl. Math2 :482 (Smith 和Waterman, 1981年，《應用數學進展》，第2卷，第482頁))可以對用于比較的序列進行最佳比對；還可采用同源性對比算法(GAP) (Needleman and ffunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48 443-53 (Needleman和ffunsch, 1970年，《分子生物學雜志》，第48卷，第443-453頁))；相似性搜索方法(Tfasta 和 Fasta) (Pearson and Lipman, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :2444(Pearson和Lipman, 1988年，《美國國家科學院院刊》，第85卷，第2444頁))；這些算法的計算機化實施包括，但不限于Intelligenetics (加州山景城(Mountain View,California))的 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL、Wisconsin Genetics Software Package 第8版(可得自Genetics Computer Group ( GCG 程序(Accelrys公司(加州圣地亞哥(San Diego, CA)))中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA。CLUSTAL 程序由如下文獻詳細說明Higgins and Sharp, (1988)Gene 73 :237-44(Higgins 和 Sharp, 1988 年，《基因》，第 73 卷，第 237-244 頁)；Higgins and Sharp, (1989) CABIOS 5 :151-3 (Higgins 和Sharp, 1989年，《計算機在生物科學中的應用》,第5卷,第151-153頁)；Corpet, et al.,(1988) Nucleic Acids Res. 16 10881-90 (Corpet 等人，1988 年，《核酸研究》，第 16 卷，第10881-10890 頁)；Huang, et al. , (1992)Computer Applications in the Biosciences8 :155-65 (Huang等人，1992年，《計算機在生物科學中的應用》，第8卷，第155-165頁)和Pearson, et al. , (1994)Meth. Mol. Biol. 24 :307-31 (Pearson 等人，《分子生物學方法》，第24卷,第307-331頁)。用于多個序列的最佳全局比對的優選程序是PileUp (Feng andDoolittle, (1987) J. Mol. EvoI. ,25 :351-60 (Feng 和 Doolittle, 1987 年，《分子進化雜志》，第 25 卷，第 351-360 頁)，其類似于 Higgins and Sharp, (1989)CABIOS 5 151-53 (Higgins和Sharp，1989年，《計算機在生物科學中的應用》，第5卷，第151-153頁)描述的方法，并且據此以引用的方式并入本文)。可用于數據庫相似性搜索的BLAST家族程序包括BLASTN，用于核苷酸查詢序列針對核苷酸數據庫序列進行查詢；BLASTX，用于核苷酸查詢序列針對蛋白質數據庫序列進行查詢；BLASTP，用于蛋白質查詢序列針對蛋白質數據庫序列進行查詢JBLASTN，用于蛋白質查詢序列針對核苷酸數據庫序列進行查詢；以及TBLASTX，用于核苷酸查詢序列針對核苷酸數據庫序列進行查詢。參見⑶RRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY, Chapter 19, Ausubel, et al. , eds. , Greene Publishing andWiley-Interscience,New York(1995)(《最新分子生物學實驗方法匯編》,第19章,Ausubel等人編輯，格林出版社與Wiley-Interscience,紐約，1995年)。
GAP利用Needleman和Wunsch(出處同上)的算法來尋找兩個完整序列的比對，該比對使匹配數最大而使空位數最小。GAP會考慮所有可能的比對和空位位置，并產生具有最大數目的匹配堿基和最少的空位的比對。其允許提供以匹配堿基數為單位的空位產生罰分和空位延伸罰分。GAP對于其插入的每個空位，都必須利用匹配的空位產生罰分數。如果選擇大于零的空位延伸罰分，GAP對于每個插入的空位必須另外利用空位長度乘以空位延伸罰分。Wisconsin Genetics Software Package第10版中的默認空位產生罰分值和空位延伸罰分值分別為8和2。空位產生和空位延伸罰分可以以選自0-100的整數來表示。因而，例如，空位產生和空位延伸罰分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。GAP給出具有最好的比對的家族中的一個成員。這個家族可能存在許多成員，但其他成員沒有更好的品質。GAP顯示用于比對的四個優值因子品質、比率、同一性和相似性。品質是為了比對序列而被最大化的指標(metric)。比率是品質除以較短區段中的堿基數。同一性百分數是實際匹配的符號的百分數。相似性百分數是相似的符號的百分數。將對應 于空位的符號忽略。當一對符號的打分矩陣值大于或等于O. 50(相似性閾值)時，對相似性打分。Wisconsin Genetics Software .Package 第 10 版中所用的打分矩陣為 BL0SUM62 (參見 Henikoff and Henikoff, (1989)Proc.Natl. Acad. Sci. USA89 10915 (Henikoff 和Henikoff，1989年，《美國國家科學院院刊》，第89卷，第10915頁))。除非另外指明，否則本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2. O程序包，采用默認參數獲得的值(Altschul, et al. , (1997)Nucleic Acids Res. 25 3389-402 (Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402頁))。如本領域普通技術人員將會理解的，BLAST搜索假定蛋白質可以隨機序列建模。然而，許多真實蛋白質包含非隨機序列區，該非隨機序列可為同聚段、短周期重復或富含一種或多種氨基酸的區域。這種低復雜性區域可在不相關的蛋白質之間比對，盡管該蛋白質的其他區域完全不相似。可采用多種低復雜性過濾程序來減少這種低復雜性比對。例如，可單獨使用或聯合使用 SEG (Wooten and Federhen, (1993) Comput. Chem. 17 149-63 (Wooten和Federhen, 1993年，《計算化學雜志》,第17卷，第149-163頁))和XNU(Claverie andStates, (1993) Comput. Chem. 17 :191-201 (Claverie 和 States, 1993 年，《計算化學雜志》,第17卷，第191-201頁))低復雜性過濾程序。在兩條多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指當在指定的比較窗口上進行比對以獲得最大對應時兩個序列中相同的殘基。當序列同一性百分數針對蛋白質使用時，應認識到，不相同的殘基位置往往差別在于保守氨基酸置換，其中氨基酸殘基被其他具有相似的化學性質(例如電荷或疏水性)的氨基酸殘基置換，因此不會改變分子的功能性質。如果序列差別在于保守置換，則可上調百分比序列同一性以校正置換的保守性質。差別在于這種保守置換的序列被說成具有“序列相似性”或“相似性”。作出這個調節的方法是本領域技術人員所熟知的。通常，這涉及將保守置換打分為部分錯配而不是完全錯配，從而提高序列同一性百分數。因而，例如，如果相同的氨基酸給予I分，非保守置換給予O分，則保守置換給予O至I之間的分數。例如，根據Meyers andMiller, (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4 :11-17 (Meyers 和 Miller, 1988 年，《計算機在生物科學中的應用》，第4卷，第11-17頁)的算法計算保守置換的分數，例如如在程序PC/GENE (Intelligenetics (美國加州山景城(Mountain View, California, USA)))中所實現的。如本文所用，“序列同一性百分數”意指通過在比較窗口上比較兩個最佳比對的序列所確定的數值，其中多核苷酸序列在比較窗口中的部分與參考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便兩個序列的最佳比對。該百分數是這樣計算的確定在兩個序列中出現相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數目以得到匹配的位置的數目，將匹配的位置的數目除以比較窗口中的位置的總數目，然后將結果乘以100以得到序列同一性百分數。術語多核苷酸序列的“基本上相同”意指利用所描述的比對程序之一采用標準參數與參考序列比較時，多核苷酸包含具有50-100%之間的序列同一性，優選至少50%的序列同一'I"生，優選至少60 %的序列同一'丨生,優選至少70 %,更優選至少80 %,更優選至少90 %且最優選至少95%序列同一性的序列。技術人員將會認識到，可通過考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等等適當調節這些值以確定兩個核苷酸序列所編碼的蛋白質的相 應同一性。用于這些目的的氨基酸序列基本上相同通常意指55-100%之間的序列同一性，優選至少55%，優選至少60%，更優選至少70%、80%、90%，最優選至少95%。核苷酸序列基本上相同的另一指示是兩個分子在嚴格條件下是否彼此雜交。遺傳密碼的簡并性允許許多氨基酸置換，這種氨基酸置換在編碼相同氨基酸的核苷酸序列中導致多樣化，因而有可能該DNA序列可編碼相同多肽但在嚴格條件下不彼此雜交。例如，當利用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡并性產生一個核酸拷貝時，這可能會發生。兩條核酸序列是基本上相同的一個指示是，第一核酸編碼的多肽與第二核酸所編碼的多肽發生免疫交叉反應。在肽的情形中，術語“基本上相同”指肽包含在指定比較窗口上與參考序列具有55-100%之間的序列同一性；優選與參考序列具有至少55%的序列同一性,優選60%,優選70%,更優選80%,最優選至少90%或95%的序列同一性。優選地,利用Needleman和Wunsch(出處同上)的同源比對算法進行最佳比對。兩條肽序列是基本上相同的指示是，一種肽可與針對第二種肽產生的抗體發生免疫反應。因而，例如，如果某種肽與第二種肽差別僅在于保守置換的話，則這兩種肽基本上相同。此外，當某種肽與第二種肽差別在于非保守變化時,如果抗體識別的表位基本上相同，則它們基本上相同。“基本上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的殘基位置差別可在于保守氨基酸變化。本發明公開了晝夜多核苷酸和多肽。本發明的新型核苷酸和蛋白質具有表明它們調控細胞數量并因而在植物發育中起重要作用的表達模式。該多核苷酸在多種植物組織中表達。該多核苷酸和多肽因而提供了操縱植物發育來改變種子和營養組織發育、時間安排或組成的機會。這可用于產生不育植株、無籽植株或具有改變的胚乳組成的植株。通過交互BLAST搜索并評估推斷的蛋白質關系是否遵循物種形成模式，來鑒定擬南芥和水稻晝夜節律基因的玉米直系同源基因，然后查詢葉和穗組織的振蕩模式。采用這些標準，在玉米同源基因中鑒定出了數個主要核心組分，包括CCA1/LHY、TOCU PRR7/3、GI和 ZTL (圖 I)。本研究鑒定了兩個TOCl同源基因ZmTOCa和ZmTOCb，它們分別定位于5號和4號染色體。兩個基因的轉錄都在6pm達到峰值，這與擬南芥TOCl基因表達相符。TOCl是偽應答調控因子(PRR)家族的成員，該家族由擬南芥和水稻中進化上保守的五個PRR基因組成(Murakami, et al.，(2007) Biosci Biotechnol Biochem 71 :1107-1110 (Murakami 等人,2007年，《生物科學、生物技術與生物化學》，第71卷，第1107-1110頁)；Murakami,et al.，(2003) Plant Cell Physiol 44 :1229-1236 (村上等人，2003年，《植物細胞生理學》，第44卷，第1229-1236頁))。除了兩個ZmTOCl同源基因外，本研究還鑒定了 ZmPRR73、ZmPRR37和ZmPRR59，它們是基于序列相似性水平根據水稻PRR基因命名的(村上等人，(2003))。還鑒定了兩個 ZEITLUPE 同源基因(Kim, et al.，(2007) Nature 449 :356-360 (Kim 等人，2007年，《自然》，第449卷，第356-360頁))ZmZTLa和ZmZTLb，它們定位于2號和4號染色體。GIGANTI的兩個玉米直系同源基因gigzlA和gigzlB此前已有描述(Miller，et al.，(2008)Planta 227 :1377-1388 (Miller 等人，2008 年，《植物》，第 227 卷，第 1377-1388 頁))，在此確認了它們在穗和葉中的振蕩。通過RT-PCR分析進一步確認了核心組分ZmCCA、ZmLHY、ZmTOCla和ZmTOClb的循環(圖2)。與葉組織相比，發育期穗中的核心組元的振幅減弱，但仍然強健。這些數據表明大部分植物核心振蕩器系統在非光合作用組織例如穗中起作用，但振蕩器輸出顯然與影響下游晝夜表達改變的轉錄機器遠遠分離。 確定了晝夜調控的轉錄物遍及玉米葉細胞的大部分功能。本文所確定會受晝夜調控的6674個轉錄物(出自10，037個安捷倫(Agilent)陣列探針)代表超過22%的檢測到的表達的全部轉錄物，這6674個轉錄物可以歸屬于1716個不同的基因本體(GO)項和22個KOG功能類別。一般而言，各個基因峰在其晝夜循環中只有一個峰。當把這些基因歸屬于各功能項并繪制這些功能項在一天范圍內的相對富集時，大部分功能具有一天中時間特有模式的顯著富集。然而，一些功能項也明顯趨向于具有雙峰模式，其中在IOAM有上午中間的峰，在傍晚6PM或晚上IOPM有第二個峰。超過18%的功能項被分類為雙峰調控的，并根據上午或下午峰的相對富集進一步細分。加上指定為一天中只在一個峰處達峰值的各個功能，所述1738個功能的94. 5%歸屬于這兩模式中的一種,只剩下95個歸屬于“其他”模式。通常雙峰模式的功能項代表更廣泛的基因富集功能分類，例如蛋白質激酶活性、信號轉導機制或氨基酸轉運和代謝。(圖5)因此，這些雙峰模式往往在整天也具有充分代表性，不只是IOAM和6/10PM。然而，基因和功能富集峰通常在上午中間出現并在傍晚/晚上再次出現，這仍然是晝夜模式的主要特征。在本實驗中，日出是6:02AM，日落在8:40PM。因此，日出為IOAM的功能峰之前4小時，但日落為6PM時間點之后2. 45小時和IOPM時間點之前I. 25小時。附加的時間點可提供更高的分辨率，但在雙峰模式中IOAM > 6/10PM模式的功能富集指數比6PM > IOAM模式高出70%，這可能與這些時間點相對于日出和日落的不對稱分布有關。或者，一些功能類別可能固有地在上午階段富集，反映潛在的生物趨勢。1643個或94. 5%的功能項歸屬于一個時間峰模式,這表明各功能在一天中有相當確定的演化。可見功能組不是均勻分布于一天的不同階段，而是表現出特定的模式和偏向。黎明富集的功能類別包括例如對寒冷的響應、脂類分解代謝和激素信號傳導。然后在上午中間，多個激素響應功能被富集。預期中午由光合作用系統I和II、葉綠素合成和參與抗氧化劑生成的單脫水抗壞血酸還原酶(MDAR)主導。傍晚和晚上顯示出明顯的核糖體和DNA損傷修復(包括解旋酶、端粒酶和核酸內切酶活性)的富集，說明染色體和核糖體修復系統被激活。此外，蔗糖轉運和戊糖磷酸支路在傍晚/晚上達峰值，說明了葉綠體碳水化合物代謝的力度變化。深夜峰包括紅光遠紅光傳導，如引言所述，其不僅調控核心時鐘，而且調控過氧化氫代謝。在夜間通常與細胞死亡相關的半胱天冬酶(樣)活性、光系統II分解代謝、核苷酸轉運和代謝以及乙酰輔酶A結合功能都達到峰值。其他不規則但令人關注的峰模式是在6PM和2AM都達到峰值的氨基酸糖基化，以及在IOAM和2AM達到峰值的蘋果酸酶和鈣調蛋白結合。這些只是描述全株植物細胞生理學的非常復雜的情形的幾個例子。值得注意的是，盡管許多基因和功能受晝夜調控，但大部分功能類別只有少數受晝夜調控的成員。在1738個功能類別中，平均覆蓋率是28. 2 %，中位數為20 %，眾數為約15%。晝夜調控的轉錄物無法完全代表包含多個基因的功能類別，對于晝夜調控的轉錄物而言，只有很少功能類別顯著地富集。在晝夜調控組中，GO :0004614磷酸葡萄糖變位酶活性在6個轉錄物中有5個，GO =0009926生長素極性運輸在4個轉錄物中有3個。這些發現說明晝夜調控的轉錄物參與但不主導這些不同的功能。在分析中鑒定了多個玉米晝夜調控的基因。總共471個序列，包括來自未成熟穗的序列、在葉組織中有聞振幅/大幅度循環的序列以及與NUE和碳氣功能相關的多種序列。這些序列包含0RF、編碼的多肽和與其相關的啟動子。 鍾本發明特別提供包括晝夜多核苷酸在內的RNA、DNA及它們的類似物和/或嵌合體的分離的核酸。本發明還包括為在不同生物體中表達而經優化的多核苷酸。例如，對于多核苷酸在玉米植物中的表達，可變更該序列以解決特定的密碼子偏好性和改變GC含量，如根據Murray等人(出處同上)所述。關于來自玉米植物的28種基因的玉米密碼子使用在Murray等人(出處同上)的表4中列出。本發明的晝夜核酸包括分離的晝夜多核苷酸，所述多核苷酸包括(a)編碼晝夜多肽及其經保守修飾的和多態性的變體的多核苷酸；(b)與(a)或(b)的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；(c) (a)或(b)的多核苷酸的互補序列。下面的表I列出了本文公開的多核苷酸和多肽的具體成份表I
權利要求
1.一種分離的多核苷酸,所述分離的多核苷酸選自 a.多核苷酸，如用GAP算法在默認參數下確定的，所述多核苷酸與選自SEQID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、20、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468 和 470 的多核苷酸的全長序列具有至少90%的序列同一性；其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有晝夜活動調節劑的功能； b.多核苷酸，所述多核苷酸選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、20、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468 和 470 ； c.與(a)或(b)的多核苷酸完全互補的多核苷酸； d.由(a)或(b)的多核苷酸編碼的多肽；和 e.多肽，如用GAP算法在默認參數下確定的，所述多肽與選自SEQID NO :185,187,189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、467、469 和 471的多肽的全長序列具有至少90%的序列同一性。
2.一種重組表達盒，所述重組表達盒包含權利要求I所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸以有義或反義取向有效連接至啟動子。
3.—種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求2所述的表達盒。
4.一種轉基因植物，所述轉基因植物包含權利要求2所述的重組表達盒。
5.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述植物是單子葉植物。
6.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述植物是雙子葉植物。
7.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、稷、花生、甘蔗和可可。
8.—種轉基因種子，所述轉基因種子來自權利要求4所述的轉基因植物。
9.一種調制植物晝夜節律的方法，所述方法包括 a.向植物細胞中引入重組表達盒，所述重組表達盒包含有效連接至啟動子的權利要求I所述的多核苷酸；和 b.在植物細胞生長條件下培養所述植物；其中所述植物細胞中的所述晝夜節律被調制。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述植物細胞來自選自以下的植物玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜猜、棉花、水稻、大麥、稷、花生、甘鹿和可可。
11.一種調制植物中整株植物或晝夜節律的方法，所述方法包括 a.向植物細胞中引入重組表達盒，所述重組表達盒包含有效連接至啟動子的權利要求I所述的多核苷酸； b.在植物細胞生長條件下培養所述植物細胞；和 c.從所述植物細胞再生植物；其中所述植物中的晝夜節律被調制。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述植物選自玉米、大豆、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、稷、花生和可可。
13.一種來源于對轉基因植物組織進行加工的方法的產品，所述轉基因植物組織表達編碼晝夜起作用的基因的分離多核苷酸，所述方法包括 a.用重組表達盒轉化植物細胞，所述重組表達盒包含多核苷酸，所述多核苷酸與選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、20、40、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468 和470的多核苷酸的全長序列具有至少90%的序列同一性；所述多核苷酸有效地連接至啟動子;和 b.在植物細胞生長條件下培養所述轉化的植物細胞；其中所述轉化的植物細胞的生長被調制； c.在形成植物的條件下培養所述植物細胞，以在植物組織中表達所述多核苷酸；和 d.對所述植物組織進行加工以獲得產品。
14.根據權利要求13所述的轉基因植物，其中所述植物是單子葉植物。
15.根據權利要求13所述的轉基因植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、甘蔗和稷。
16.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述多核苷酸的過表達導致與未轉化的植物相比改善了的植物生長。
17.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述植物與未轉化的植物相比，表現出改善的源-庫關系。
18.根據權利要求4所述的轉基因植物，其中所述植物與未轉化的植物相比，具有提高的產量。
19.一種調控多核苷酸分子,所述分子包含選自以下的序列(a) SEQ ID NO :31-183 ；(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO :31-183之一的至少50-100個連續核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一個或多個晝夜調控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默認參數下確定的與SEQ ID NO :31-183之一的約500-1000個連續核苷酸至少90%的同一性。
20.一種嵌合多核苷酸分子，所述分子包含權利要求19所述的核酸片段。
21.根據權利要求20所述的嵌合分子，所述分子包含所述晝夜調控元件和組織特異性表達元件。
22.根據權利要求21所述的嵌合分子，其中所述組織特異性表達元件選自根特異性、維管束鞘細胞特異性、葉特異性和胚特異性表達元件。
23.根據權利要求19所述的調控多核苷酸分子，其中所述調控多核苷酸分子是啟動子。
24.一種包含權利要求19所述的調控分子的構建體，所述調控分子有效連接至異源多核苷酸分子，其中所述異源分子賦予所關注的性狀。
25.根據權利要求24所述的構建體，其中所述所關注的性狀選自耐旱性、耐凍性、耐寒性、抗病性和昆蟲抗性。
26.根據權利要求24所述的構建體，其中所述異源分子在源-庫代謝中起作用。
27.一種用權利要求19所述的調控分子轉化的轉基因植物。
28.根據權利要求27所述的轉基因植物，其是單子葉植物。
29.根據權利要求27所述的轉基因植物，其選自玉米、大豆、卡諾拉油菜、棉花、向日葵、苜猜、甜菜、小麥、裸麥、水稻、甘蔗、燕麥、大麥、草坪草、高粱、稷、番茄、木豆、蔬菜、果樹和飼草。
30.一種增加植物產量的方法，所述方法包括在權利要求19所述的調控分子的控制下表達所關注的異源多核苷酸。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述異源多核苷酸是晝夜調控的植物基因。
32.—種提高植物非生物脅迫耐性的方法，所述方法包括在權利要求19所述的調控分子的控制下在植物中表達一種或多種賦予非生物脅迫耐性的多核苷酸。
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述非生物脅迫耐性選自耐旱性、耐凍性和耐寒性。
34.根據權利要求33所述的方法，其中所述賦予耐旱性的多核苷酸是在調控元件控制下表達的，其峰值表達發生于中午或傍晚左右。
35.根據權利要求33所述的方法，其中所述賦予耐凍性或耐寒性的多核苷酸是在調控元件控制下表達的，其峰值表達發生于黎明或上午中間左右。
36.一種降低轉基因表達的產量抑制的方法，所述方法包括表達有效連接至調控多核苷酸分子的轉基因，所述調控多核苷酸分子包含選自以下的序列(a) SEQ ID NO :31-183;(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO =31-183之一的至少50-100個連續核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一個或多個晝夜調控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默認參數下確定的與SEQ ID NO :31-183之一的約500-1000個連續核苷酸至少90%的同一性。
37.一種篩選涉及非生物脅迫耐性的候選基因的方法，所述方法包括(a)鑒定在組成性表達或組織特異性表達下表現產量抑制的一個或多個候選基因和(b)在引導晝夜表達模式的調控分子控制下表達所述候選基因。
38.根據權利要求37所述的方法，其中所述調控分子包含選自以下的序列(a)SEQID NO :31-183 ;(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO :31-183之一的至少50-100個連續核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一個或多個晝夜調控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默認參數下確定的與SEQ ID NO :31-183之一的約500-1000個連續核苷酸至少90%的同一性。
全文摘要
本發明提供涉及玉米的葉和穗組織中晝夜循環的多核苷酸序列。本發明提供了多核苷酸序列及其編碼的與振蕩相關的多肽的用途。所述公開的序列負責控制作物中植物生長、源-庫關系和產量。
文檔編號C12N5/10GK102906267SQ201180012114
公開日2013年1月30日 申請日期2011年1月6日 優先權日2010年1月6日
發明者O.N.丹尼列夫斯卡亞, J.E.黑本, K.R.海斯, C.R.西蒙斯, S.D.德尚 申請人:先鋒國際良種公司, 納幕爾杜邦公司