本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2012年2月16日，申請(qǐng)?zhí)枮?01280009244.5，發(fā)明名稱為“加工方法”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及對(duì)植物性食品和飼料產(chǎn)品、尤其是植物油的工業(yè)加工。本發(fā)明可以用于減少或消除由葉綠素和葉綠素衍生物所致的污染。
背景技術(shù)：
：：葉綠素是在整個(gè)植物界廣泛存在的一種綠色色素。葉綠素是光合作用所必需的，并且是地球上發(fā)現(xiàn)的最豐富的有機(jī)金屬化合物之一。因而許多來自植物的產(chǎn)品(包括食物和飼料)含有明顯量的葉綠素。例如，源自含油種子(例如大豆、棕櫚或油菜種子(卡諾拉油菜)、棉籽)的植物油和花生油通常含有一些葉綠素。然而，通常不期望植物油中存在高水平的葉綠素色素。這是因?yàn)槿~綠素賦予難看的綠色，并且可能在儲(chǔ)存期間引起油的氧化，導(dǎo)致油變質(zhì)。已經(jīng)采用各種方法旨在從植物油除去葉綠素。葉綠素可以在產(chǎn)油過程的多個(gè)階段(包括種子破碎、油提取、脫膠、堿處理和漂白步驟)除去。然而，漂白步驟通常對(duì)于降低葉綠素殘留物至可接受水平是最有效的。在漂白期間，將油加熱并使其通過吸附劑以除去葉綠素和影響成品油外觀和/或穩(wěn)定性的其他有色化合物。漂白步驟中所用的吸附劑通常為粘土。在可食用油加工行業(yè)中，采用上述步驟通常會(huì)將加工油中的葉綠素水平降至0.02至0.05ppm之間。然而，漂白步驟因漂白粘土的夾帶作用而增加加工成本和降低油產(chǎn)量。粘土的使用可能從油中除去許多有用的化合物(例如類胡蘿卜素和生育酚)。另外粘土的使用也昂貴，這尤其是因?yàn)橛眠^的粘土(即廢料)的處理困難、危險(xiǎn)(易于自燃)，并且因而處理成本高。因而已進(jìn)行了通過其他手段從油中除去葉綠素的嘗試，例如使用葉綠素酶。在植物中，認(rèn)為葉綠素酶(chlorophyllase或chlase)參與葉綠素降解，并催化葉綠素中酯鍵的水解而生成脫植基葉綠素和葉綠醇。wo2006009676描述了可降低組合物中葉綠素污染的一種工業(yè)方法，例如用葉綠素酶處理植物油。此方法中產(chǎn)生的水溶性脫植基葉綠素也是綠色，但是可通過水提取法或二氧化硅處理除去。葉綠素通常在用于油生產(chǎn)的種子中以及從種子提取油的過程中部分降解。一種常見的修飾為鎂離子從卟啉(二氫卟酚)環(huán)丟失以形成稱作脫鎂葉綠素的衍生物(參見圖1)。高極性鎂離子從卟啉環(huán)中丟失導(dǎo)致脫鎂葉綠素與葉綠素相比在理化性質(zhì)上顯著不同。通常在加工過程中，油中的脫鎂葉綠素比葉綠素含量更豐富。脫鎂葉綠素呈淡綠色，并且可通過與針對(duì)葉綠素所用的類似方法從油中除去，例如wo2006009676中所述通過由具有脫鎂葉綠素酶活性的酶催化的酯酶反應(yīng)。在某些條件下，一些葉綠素酶能夠水解脫鎂葉綠素以及葉綠素，因此適于除去這兩種污染物。脫鎂葉綠素水解的產(chǎn)物為紅色/褐色的脫鎂葉綠酸和葉綠醇。脫鎂葉綠酸也可以因鎂離子從脫植基葉綠素丟失(即葉綠素水解之后)而生成(參見圖1)。wo2006009676教導(dǎo)了通過與脫植基葉綠素類似的方法(例如通過水萃取法或二氧化硅吸附)除去脫鎂葉綠酸。脫鎂葉綠素還可能因含油種子收獲和儲(chǔ)存期間植物酶的活性或者因精制油期間的加工條件(即熱)而進(jìn)一步降解為焦脫鎂葉綠素(參見“behaviourofchlorophyllderivativesincanolaoilprocessing”,jaocs,vol,no.9(sept.1993)pages837-841(“芥花油加工過程中葉綠素衍生物的行為”，《美國油脂化學(xué)家協(xié)會(huì)雜志》，第9卷，1993年9月，第837-841頁))。一種可能的機(jī)制是脫鎂葉綠素的碳環(huán)上甲酯鍵的酶促水解，然后不穩(wěn)定中間體向焦脫鎂葉綠素的非酶促轉(zhuǎn)化。據(jù)報(bào)道，來自藜(chenopodiumalbum)的名為脫鎂葉綠酸酶的28-29kda酶能夠?qū)γ撴V葉綠酸催化類似的反應(yīng)，以產(chǎn)生不含葉綠醇的焦脫鎂葉綠素衍生物，稱為焦脫鎂葉綠酸(參見圖1)。焦脫鎂葉綠酸比脫鎂葉綠酸極性低，導(dǎo)致焦脫鎂葉綠酸與脫鎂葉綠酸相比具有降低的水溶解度和增加的油溶解度。取決于加工條件，焦脫鎂葉綠素可能在加工期間在植物油中比脫鎂葉綠素和葉綠素二者更豐富(參見table9involume2.2.ofbailey’sindustrialoilandfatproducts(2005),6thedition,ed.byfereidoonshahidi,johnwiley&sons(由fereidoonshahidi編輯、約翰威立父子出版公司于2005年出版的《貝雷工業(yè)油脂產(chǎn)品》，第6版，第2.2.卷的表9))。這部分地因?yàn)樵谥参锊牧鲜斋@和儲(chǔ)存期間鎂從葉綠素丟失。如果使用在90℃或更高溫度延長(zhǎng)的熱處理，油中焦脫鎂葉綠素的量可能增加并且可能高于脫鎂葉綠素的量。也通過壓榨和提取之前加熱含油種子以及精制過程期間油脫膠和堿處理來降低葉綠素水平。還觀察到油中的磷脂可以與鎂絡(luò)合并因而減少葉綠素的量。因而與許多植物油中的焦脫鎂葉綠素(和脫鎂葉綠素)相比，葉綠素為相對(duì)微量的污染物。四種葉綠素衍生物(葉綠素a和b以及脫鎂葉綠素a和b)中的每一個(gè)均以一對(duì)差向異構(gòu)體的方式存在，所述差向異構(gòu)體由碳原子編號(hào)132(根據(jù)iupac系統(tǒng)編號(hào)，在圖2中用星號(hào)標(biāo)出)周圍的h和cooch3的立體結(jié)構(gòu)決定。因此，葉綠素a以葉綠素a和葉綠素a′的差向異構(gòu)體對(duì)存在，并且葉綠素b包含b和b'形式。同樣地，脫鎂葉綠素a包含差向異構(gòu)體a和a'對(duì)，并且脫鎂葉綠素b包含b和b'形式。撇號(hào)(')形式具有圍繞碳132原子的s-立體結(jié)構(gòu)，而非撇號(hào)形式具有圍繞碳132原子的r-立體結(jié)構(gòu)。差向異構(gòu)化，例如，從a形式轉(zhuǎn)變成a'形式并且反之亦然，在某些情況下可以通過常見烯醇而發(fā)生，如“epimerizationinthepheophytina/a′system”,chemistryletters(1984),1411-1414(“脫鎂葉綠素a/a′體系中的差向異構(gòu)化作用”，《化學(xué)快報(bào)》，1984年，第1411-1414頁)中所描述。在溶液中，通常存在指示撇形式和非撇形式葉綠素化合物的分布的平衡狀態(tài)，并且這經(jīng)常由物理參數(shù)諸如溫度、ph、溶劑等決定。一般來說，酶通常因僅對(duì)一種立體異構(gòu)體具有活性而充當(dāng)立體特異性催化劑。前面的分析表明葉綠素酶具有高度的立體特異性，僅催化非撇形式的葉綠素化合物水解(參見“thestereospecificinteractionbetweenchlorophyllsandchlorophyllase”j.biol.chem.267(31):22043-22047(1992)(“葉綠素和葉綠素酶之間的立體特異性相互作用”，《生物化學(xué)雜志》，第267卷第31期，第22043-22047頁，1992年))。在采用葉綠素酶相關(guān)酶從植物油中移除葉綠素和葉綠素衍生物的方法中，酶的立體特異性可能帶來麻煩。具體地講，根據(jù)油中葉綠素立體異構(gòu)體的分配和平衡狀態(tài)，完全降解葉綠素組分可能是非常困難的。例如，如果明顯比例的葉綠素或葉綠素衍生物以撇形式存在，那么油中存在的這部分葉綠素衍生物可能抵抗酶促降解。此外，多種酶對(duì)焦脫鎂葉綠素顯示出比例如對(duì)脫鎂葉綠素低得多的活性。伴隨現(xiàn)有方法的這個(gè)問題在圖3中示出。圖3顯示脫鎂葉綠素a的差向異構(gòu)化作用以及向焦脫鎂葉綠素的轉(zhuǎn)化。水/粗制植物油混合物(如包含約1-2％的水)的ph在約60℃通常為約5.0。在此類條件下，粗制大豆油或菜籽油中脫鎂葉綠素a的差向異構(gòu)體分布通常為約70％脫鎂葉綠素a(r-立體異構(gòu)體)和30％脫鎂葉綠素a′(s-立體異構(gòu)體)，并且這兩種差向異構(gòu)體之間的異構(gòu)化緩慢。此外，根據(jù)反應(yīng)條件，可以形成可變量的焦脫鎂葉綠素。如果反應(yīng)中所用的酶僅對(duì)脫鎂葉綠素a優(yōu)勢(shì)地有活性，則油中存在的明顯比例的葉綠素衍生物不能在ph未調(diào)整時(shí)由酶直接水解。因此需要從植物油中除去葉綠素和葉綠素衍生物(諸如脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠素)的改進(jìn)方法。具體地講，需要增墻從油中移除各種形式的葉綠素和葉綠素衍生物的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于處理植物油的方法，包括使植物油與酶接觸的步驟，其中所述酶能夠水解葉綠素或葉綠素衍生物的a'或b'立體異構(gòu)體。在一個(gè)實(shí)施例中，a'或b'立體異構(gòu)體包括葉綠素a'、脫鎂葉綠素a'、葉綠素b'或脫鎂葉綠素b'。優(yōu)選的立體異構(gòu)體為葉綠素或葉綠素衍生物的a'立體異構(gòu)體，如葉綠素a'或脫鎂葉綠素a'。在一個(gè)實(shí)施例中，與葉綠素或葉綠素衍生物的a'立體異構(gòu)體相比，所述酶對(duì)葉綠素或葉綠素衍生物的a立體異構(gòu)體具有小于10、小于5或小于2的活性比率。在一個(gè)可供選擇的實(shí)施例中，與葉綠素或葉綠素衍生物的b'立體異構(gòu)體相比，所述酶對(duì)葉綠素或葉綠素衍生物的b立體異構(gòu)體具有小于10、小于5或小于2的活性比率。在一個(gè)實(shí)施例中，用酶處理后，所述油包含按油中葉綠素或葉綠素衍生物的a和a'立體異構(gòu)體的總量，至少50％的葉綠素或葉綠素衍生物的a立體異構(gòu)體。在一個(gè)可供選擇的實(shí)施例中，用酶處理后，所述油包含按油中的葉綠素或葉綠素衍生物的b和b'立體異構(gòu)體的總量，至少50％的葉綠素或葉綠素衍生物的b立體異構(gòu)體。在另外的實(shí)施例中，與焦脫鎂葉綠素相比，該酶對(duì)脫鎂葉綠素具有小于10、小于8或小于5的活性比率。在另外的實(shí)施例中，該酶包括葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶和/或焦脫鎂葉綠素酶活性，即對(duì)葉綠素、脫鎂葉綠素和/或焦脫鎂葉綠素的水解活性。在另外的實(shí)施例中，該酶衍生自擬南芥(arabidopsisthaliana)或蓖麻(ricinuscommunis)。例如，所述酶可以包含如seqidno:2或seqidno:13中所定義的多肽序列，或其功能性片段或變體。優(yōu)選地，該酶包含與seqidno:2或seqidno:13在至少50個(gè)氨基酸殘基范圍內(nèi)具有至少75％的序列同一性的多肽序列。在一個(gè)實(shí)施例中，該酶包含與seqidno:2具有至少90％序列同一性的多肽。在另一個(gè)實(shí)施例中，該酶包含與seqidno:13具有至少90％序列同一性的多肽。在另外的方面，本發(fā)明提供了可根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法獲得的植物油。在另外的方面，本發(fā)明提供了能夠水解葉綠素或葉綠素衍生物的酶從植物油中除去葉綠素或葉綠素衍生物的a'或b'立體異構(gòu)體的用途。如本文所述，已鑒定到令人驚訝地對(duì)撇形式以及非撇形式葉綠素衍生物顯示水解活性的酶。此外，與已知方法中所用的酶相比，此類酶還可以顯示對(duì)焦脫鎂葉綠素增強(qiáng)的水解活性。此類酶能夠有利地用來增強(qiáng)從植物油移除各種形式的葉綠素衍生物。附圖說明圖1顯示涉及本發(fā)明中所用的葉綠素和衍生物以及酶的反應(yīng)。圖2顯示脫鎂葉綠素a，其中根據(jù)iupac編號(hào)系統(tǒng)用星號(hào)標(biāo)出c-132。圖3顯示脫鎂葉綠素a分子的差向異構(gòu)化作用以及向焦脫鎂葉綠素a的轉(zhuǎn)化。圖4顯示氨基酸序列和核苷酸序列，所述序列顯示葉綠素酶基因與組氨酸標(biāo)簽和凝血酶位點(diǎn)融合。圖5顯示大腸桿菌(e.coli.)表達(dá)載體pet28-tri_chl的示意圖,所述表達(dá)載體包含編碼來自普通小麥(triticumaestivum)的葉綠素酶的tri_chl基因(數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)bt009214)。圖6顯示了顯示葉綠素酶基因與apre信號(hào)序列和agk序列融合的氨基酸序列和核苷酸序列。圖7顯示枯草芽孢桿菌(b.subtilis)表達(dá)載體pbn-tri_chl的示意圖,所述表達(dá)載體包含編碼來自普通小麥的葉綠素酶的tri_chl基因(數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)bt009214)。圖8顯示了顯示葉綠素酶基因與apre啟動(dòng)子直接融合的氨基酸序列和核苷酸序列。圖9顯示枯草芽孢桿菌(b.subtilis)表達(dá)載體pbn-spe-tri_chl的示意圖,所述表達(dá)載體包含編碼來自普通小麥的葉綠素酶的tri_chl基因(數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)bt009214)。圖10顯示了顯示葉綠素酶基因與cela信號(hào)序列融合的氨基酸序列和核苷酸序列。圖11顯示變鉛青鏈霉菌(s.lividans)表達(dá)載體pkb-tri_chl的示意圖,所述表達(dá)載體包含編碼來自普通小麥的葉綠素酶的tri_chl基因(數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)bt009214)。圖12顯示擬南芥(arabidopsisthaliana)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:1)。圖13顯示擬南芥葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:2)。圖14顯示甜橙(citrussinensis)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:3)。圖15顯示普通小麥葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:4)。圖16顯示普通小麥葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:5)。圖17顯示甘藍(lán)(brassicaoleracea)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:6)。圖18顯示甘藍(lán)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:7)。圖19顯示甘藍(lán)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:8)。圖20顯示玉蜀黍(zeamays)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:9)。圖21顯示玉蜀黍葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:10)。圖22顯示毛竹(phyllostachysedulis)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:11)。圖23顯示藜葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:12)。圖24顯示蓖麻葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:13)。圖25顯示大豆(glycinemax)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:14)。圖26顯示銀杏(ginkgobiloba)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:15)。圖27顯示發(fā)財(cái)樹(pachiramacrocarpa)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:16)。圖28顯示毛果楊(populustrichocarpa)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:17)。圖29顯示高粱(sorghumbicolor)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:18)。圖30顯示高粱葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:19)。圖31顯示葡萄(vitisvinifera)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:20)。圖32顯示小立碗蘚(physcomitrellapatens)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:21)。圖33顯示耬斗菜(aquilegia)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:22)。圖34顯示二穗短柄草(brachypodiumdistachyon)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:23)。圖35顯示蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:24)。圖36顯示蔞葉(piperbetle)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:25)。圖37顯示百脈根(lotusjaponicus)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:26)。圖38顯示秈稻(oryzasativaindica)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:27)。圖39顯示粳稻(oryzasativajaponica)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:28)。圖40顯示粳稻葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:29)。圖41顯示北美云杉(piceasitchensis)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:30)。圖42顯示衣藻(chlamydomonas)葉綠素酶的氨基酸序列(seqidno:31)。圖43顯示植物葉綠素酶以及本文所述的衣藻葉綠素酶(chl_chl)的系譜樹。圖44顯示含有衍生自各種物種的重組葉綠素酶的大腸桿菌提取物的蛋白質(zhì)印跡分析。泳道1：bam_chlcore112。泳道2：cit_chlcore113a。泳道3：ara_chlcore114a。泳道4：cb_chlcore127。泳道5：glymax_chlcore133。泳道6：sor_chlcore134。泳道7：ara_chl2core135。泳道8：bra_chl1core136。與上述縮寫相對(duì)應(yīng)的酶的源物種的定義參見下表1和表2。圖45顯示含有衍生自各種物種的重組葉綠素酶的大腸桿菌提取物的蛋白質(zhì)印跡分析。泳道1：sorg_chlcore137a。泳道2：tri_chl2core138a。泳道3：zea_chl2core139。泳道4：tri_chlcore20。泳道5：brach_chlcore156。泳道6：pip_chlcore158。泳道7：picea_chlcore163。泳道8：載體對(duì)照。與上述縮寫相對(duì)應(yīng)的酶的源物種的定義參見下表1和表2。圖46顯示衍生自各種物種的重組酶對(duì)脫鎂葉綠素a的活性，如用每種酶處理后在各時(shí)間點(diǎn)處以ppm計(jì)的總脫鎂葉綠素a(脫鎂葉綠素a+a')水平表示。圖47顯示衍生自各種物種的重組酶對(duì)脫鎂葉綠素a的活性，如用每種酶處理后在各時(shí)間點(diǎn)處以ppm計(jì)的焦脫鎂葉綠素a水平表示。圖48顯示基于處理后油樣品中脫鎂葉綠素a和脫鎂葉綠素a'立體異構(gòu)體的總量計(jì),用衍生自各種物種的重組酶處理后油樣品中脫鎂葉綠素的a立體異構(gòu)體的百分比。圖49顯示使用吸光度檢測(cè)(430nm)的hplc色譜圖，指示與如下物質(zhì)相關(guān)的峰編號(hào)：1＝脫植基葉綠素b；2＝脫植基葉綠素a；3＝新葉黃素；3’＝新葉黃素異構(gòu)體；4＝新色素；5＝紫黃素；6＝黃體呋喃素；7＝玉米黃二呋喃素；8＝花黃素；8’＝花黃素異構(gòu)體；9＝玉米黃呋喃素；10＝葉黃素；10'＝葉黃素異構(gòu)體；10”＝葉黃素異構(gòu)體；11＝脫鎂葉綠酸b；12＝脫鎂葉綠酸a；13＝葉綠素b；13'＝葉綠素b’；14＝葉綠素a；14'＝葉綠素a’；15＝脫鎂葉綠素b；15'＝脫鎂葉綠素b’；16＝β-胡蘿卜素；17＝脫鎂葉綠素a；17'＝脫鎂葉綠素a’；18＝焦脫鎂葉綠素b；19＝焦脫鎂葉綠素a。圖50顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的精制油方法的圖示。圖51顯示脫鎂葉綠酸a和a’的底物濃度的對(duì)數(shù)在1/2小時(shí)后隨ara_chl2(擬南芥葉綠素酶)劑量的變化。具體實(shí)施方式在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及處理植物油的方法。通常，例如在葉綠素和/或葉綠素衍生物作為污染物存在的情況下，使用該方法從油中除去葉綠素和/或葉綠素衍生物，或者降低油中葉綠素和/或葉綠素衍生物的水平。葉綠素和葉綠素衍生物所謂“葉綠素衍生物”通常意指包含卟啉(二氫卟酚)環(huán)和葉綠醇基團(tuán)(尾)的化合物，包括不含鎂含葉綠醇的衍生物，諸如脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠素。葉綠素和(含葉綠醇)葉綠素衍生物通常為綠色，這是因?yàn)榉肿又写嬖谶策?二氫卟酚)環(huán)。鎂從卟啉環(huán)的丟失意味著脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠素在顏色上比葉綠素更呈偏褐色。因而油中葉綠素和葉綠素衍生物的存在，可以給予這種油難看的綠色、淡綠色或褐色。在一個(gè)實(shí)施例中，可以進(jìn)行本方法以除去或降低油中存在的綠色或褐色。因此，本方法可稱為漂白或脫色方法。該方法中所用的酶可以水解葉綠素和含葉綠醇的葉綠素衍生物以從二氫卟酚環(huán)裂解葉綠醇尾巴。葉綠素和葉綠素衍生物的水解通常得到諸如脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和焦脫鎂葉綠素的化合物，它們是不含葉綠醇的葉綠素衍生物。這些化合物仍包含有色卟啉環(huán)，脫植基葉綠素呈綠色而脫鎂葉綠酸和焦脫鎂葉綠素則呈紅棕色。在一些實(shí)施例中，也可能期望除去這些不含葉綠醇的衍生物以及降低油的綠色/紅色/褐色。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該方法還可包括除去或降低油中不含葉綠醇的葉綠素衍生物水平的步驟。該方法可以涉及漂白或脫色以除去油的綠色和/或紅色/褐色。葉綠素或葉綠素衍生物可以為a或b形式。因而如本文所用，術(shù)語“葉綠素”包括葉綠素a和葉綠素b。以類似方式，當(dāng)提及脫鎂葉綠素、焦脫鎂葉綠素、脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和焦脫鎂葉綠素時(shí)，覆蓋a和b形式。如本文所述，葉綠素和葉綠素衍生物可以作為一對(duì)差向異構(gòu)體存在，所述差向異構(gòu)體由碳原子編號(hào)132(根據(jù)iupac系統(tǒng)編號(hào)，在圖2中用星號(hào)標(biāo)出)周圍的立體化學(xué)決定。因此，葉綠素a以葉綠素a和葉綠素a′的差向異構(gòu)體對(duì)存在，并且葉綠素b包含b和b'形式。脫鎂葉綠素a包括差向異構(gòu)體a和a'，并且脫鎂葉綠素b包括b和b'形式。撇號(hào)(')形式具有圍繞碳132原子的s-立體結(jié)構(gòu)，而非撇號(hào)形式具有圍繞碳132原子的r-立體結(jié)構(gòu)。當(dāng)在本文中普遍使用時(shí)，術(shù)語“葉綠素和葉綠素衍生物”包括撇形式和非撇形式兩者。植物油可以根據(jù)本方法處理任何植物油，以除去由葉綠素和/或葉綠素衍生物引起的不期望的污染。油可以來自任何類型的植物，以及來自植物的任何部分，包括整株植物、葉、莖、花、根、植物原生質(zhì)體、種子和植物細(xì)胞及其相同后代。可以本發(fā)明方法處理的產(chǎn)品的來源植物種類包括高等植物，包括被子植物(單子葉植物和雙子葉植物)以及裸子植物。它包括多種倍性水平的植物，包括多倍體、二倍體、單倍體和半合子狀態(tài)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，油可以包括植物油，包括從含油種子或含油果實(shí)加工的油(例如，諸如卡諾拉(油菜籽)油的種子油以及諸如棕櫚油的果油)。合適的油的例子包括米糠、大豆、卡諾拉油菜(油菜籽)、棕櫚、橄欖、棉籽、玉米、棕櫚仁、椰子、花生、芝麻、辣木或向日葵。本發(fā)明的方法可結(jié)合加工精油(例如來自果實(shí)種子油，例如葡萄籽、杏、琉璃苣等的那些)的方法使用。本發(fā)明的方法可結(jié)合加工高磷油(例如大豆油)的方法使用。優(yōu)選地，所述的油為粗制植物油。油中的葉綠素和葉綠素衍生物葉綠素和/或葉綠素衍生物(例如葉綠素、脫鎂葉綠素和/或焦脫鎂葉綠素)可以作為污染物在油中，或作為加工產(chǎn)品中不期望的組分天然存。葉綠素和/或葉綠素衍生物(例如葉綠素、脫鎂葉綠素和/或焦脫鎂葉綠素)可以在油中以任何水平存中。通常，葉綠素、脫鎂葉綠素和/或焦脫鎂葉綠素可以作為天然污染物在油中以基于油的總重量計(jì)0.001至1000mg/kg(0.001至1000ppm，10-7至10-1重量％)的濃度存在。在另一些實(shí)施例中，葉綠素和/或葉綠素衍生物可以在油中以基于油的總重量計(jì)0.1至100、0.5至50、1至50、1至30或1至10mg/kg的濃度存在。不含葉綠醇的葉綠素衍生物也可以存在于油中。例如，脫植基葉綠素、焦脫鎂葉綠素和/或焦脫鎂葉綠素可以在油中以任何水平存在。通常，脫植基葉綠素、焦脫鎂葉綠素和/或焦脫鎂葉綠素在根據(jù)本發(fā)明方法采用酶處理前或處理后可以在油中以基于油的總重量計(jì)0.001至1000mg/kg(0.001至1000ppm，10-7至10-1重量％)的濃度存在。在另一些實(shí)施例中，脫植基葉綠素、焦脫鎂葉綠素和/或焦脫鎂葉綠素可以在組合物中以基于組合物的總重量計(jì)0.1至100、0.5至50、1至50、1至30或1至10mg/kg的濃度存在。水解葉綠素或葉綠素衍生物的酶本發(fā)明的方法包括使油與能夠水解葉綠素或葉綠素衍生物、特別是它們的撇形式立體異構(gòu)體(如a'或b')的酶接觸的步驟。通常，“水解葉綠素或葉綠素衍生物”是指水解葉綠素或(含葉綠醇)葉綠素衍生物中的酯鍵，例如裂解葉綠素或葉綠素衍生物中來自二氫卟酚環(huán)的葉綠醇基團(tuán)。因此該酶通常具有酯酶或水解酶活性。優(yōu)選地該酶在油相中并且任選地也在水相中具有酯酶或水解酶活性。因而該酶可以是例如葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶或焦脫鎂葉綠素酶。優(yōu)選地，該酶能夠水解葉綠素、脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠素中的至少一種、至少兩種或全部三種。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，該酶具有葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶和焦脫鎂葉綠素酶活性。在另一些實(shí)施例中，兩種或更多種酶可以用于該方法中，每種酶具有不同的底物特異性。例如，該方法可以包括選自葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶和焦脫鎂葉綠素酶的兩種或三種酶的組合使用。任何具有能夠水解葉綠素或葉綠素衍生物(尤其是它們的撇形式立體異構(gòu)體)的活性的多肽可以用作本發(fā)明過程中的酶。所謂“酶”，旨在涵蓋對(duì)葉綠素或葉綠素衍生物的撇形式立體異構(gòu)體(如a'或b')具有水解活性的任何多肽，包括例如酶片段等。可以使用任何分離的、重組的或合成的或嵌合的(或合成和重組的組合)多肽。在本發(fā)明的實(shí)施例中，該酶能夠水解葉綠素或葉綠素衍生物的a'或b'立體異構(gòu)體。也就是說，所述酶對(duì)葉綠素或葉綠素衍生物的撇(')形式具有水解活性。所述撇(')標(biāo)號(hào)指的是葉綠素或葉綠素衍生物中碳原子編號(hào)132周圍的立體結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明的實(shí)施例中可以被水解的葉綠素或葉綠素衍生物的撇形式包括葉綠素a′、葉綠素b'、脫鎂葉綠素a'和脫鎂葉綠素b'。優(yōu)選地，所述酶能夠水解a類葉綠素衍生物的至少撇形式，即葉綠素a′或脫鎂葉綠素a'。通常，所述酶對(duì)葉綠素或葉綠素衍生物的非撇形式也具有水解活性。本發(fā)明中所用的酶可能具有降低的立體特異性，即，本文所用的酶對(duì)葉綠素或葉綠素衍生物的非撇形式的特異性低于其他已知的葉綠素酶(例如普通小麥葉綠素酶，參見seqidno:4)。在一個(gè)實(shí)施例中，與葉綠素或葉綠素衍生物的撇形式(如a'或b')立體異構(gòu)體，該酶對(duì)葉綠素或葉綠素衍生物的非撇形式(如a或b)立體異構(gòu)體具有小于100的活性比率。優(yōu)選地，該活性比率小于50、小于10、小于5、小于3、小于2、小于1.5、小于1或小于0.5。所謂“活性比率”，意指在相同條件下，與非撇形式相比，酶對(duì)撇形式的相對(duì)活性。因此，活性比率可以通過測(cè)定(a)酶對(duì)非撇形式立體異構(gòu)體的水解活性，以及(b)酶對(duì)相應(yīng)撇形式立體異構(gòu)體的水解活性，再將(a)除以(b)來確定。因此，低的活性比率表明對(duì)撇形式的活性相對(duì)較高。水解活性可以例如使用下述方法來確定。通常，活性比率可以在不支持差向異構(gòu)化(即在撇形式和非撇形式異構(gòu)體之間轉(zhuǎn)變)的條件下確定。例如，活性比率可以通過測(cè)量在ph為5.0至5.5的條件下在含有大于0.5ppm的脫鎂葉綠素、約2％的水的原油中對(duì)撇形式和非撇形式異構(gòu)體的水解活性來確定。在一個(gè)實(shí)施例中，酶對(duì)脫鎂葉綠素a或脫鎂葉綠素a’的水解活性在初始底物濃度的一半處進(jìn)行計(jì)算(參見如實(shí)例4)。在另一個(gè)實(shí)施例中，與焦脫鎂葉綠素相比，該酶對(duì)脫鎂葉綠素具有小于80、小于50、小于10、小于8、小于7或小于5的活性比率。例如，該酶可能具有0.1至10、1至10或1至5的脫鎂葉綠素酶對(duì)焦脫鎂葉綠素酶的活性比率。可以通過使用下述方法測(cè)定相同條件下的脫鎂葉綠素酶活性和焦脫鎂葉綠素酶活性，并用脫鎂葉綠素酶活性除以焦脫鎂葉綠素酶活性，由此計(jì)算出脫鎂葉綠素酶對(duì)焦脫鎂葉綠素酶的活性比率。上述比率范圍內(nèi)的活性比率可以針對(duì)脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠素的相應(yīng)種類，如脫鎂葉綠素a(包括a和a'形式)對(duì)焦脫鎂葉綠素a來確定。酶(葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶或焦脫鎂葉綠素酶)活性測(cè)定可以使用任何合適的分析技術(shù)，例如基于本文所述的測(cè)定法來檢測(cè)對(duì)葉綠素或葉綠素衍生物(包括它們的撇形式和非撇形式)的水解活性。例如，可以使用基于熒光的技術(shù)檢測(cè)水解活性。在一個(gè)合適的檢測(cè)分析中，將待測(cè)試其葉綠素或葉綠素衍生物水解活性的多肽在底物存在的情況下溫育，并且通過熒光測(cè)量法監(jiān)測(cè)產(chǎn)物或底物水平。合適的底物包括如葉綠素、脫鎂葉綠素和/或焦脫鎂葉綠素，包括它們的a和b以及撇形式和非撇形式。可以檢測(cè)的產(chǎn)物包括脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸、焦脫鎂葉綠素和/或葉綠醇。用于檢測(cè)葉綠素或葉綠素衍生物的水解的測(cè)定方法在例如以下文獻(xiàn)中公開：alikhamessanetal.(1994),journalofchemicaltechnology&biotechnology,60(1),pages73–81(alikhamessan等人，1994年，《化學(xué)技術(shù)與生物技術(shù)雜志》，第60卷第1期，第73–81頁)；kleinandvishniac(1961),j.biol.chem.236:2544-2547(klein和vishniac，1961年，《生物化學(xué)雜志》，第236卷，第2544-2547頁)；以及kianietal.(2006),analyticalbiochemistry353:93–98(kiani等人，2006年，《分析生物化學(xué)》，第353卷，第93–98頁)。作為另外一種選擇，合適的檢測(cè)分析可在加入某種酶后基于底物或產(chǎn)物含量的hplc檢測(cè)和定量，例如基于如下所述的技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施例中，測(cè)定法可以按hornero-mendezetal.(2005),foodresearchinternational38(8-9):1067-1072(hornero-mendez等人，2005年，《國際食品研究》，第38卷，第8-9期，第1067-1072頁)中所述進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施例中，可以使用以下測(cè)定法：向ph7.0的170μlmmhepes中添加溶解于丙酮中的20μl0.3mm葉綠素、脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠素。將酶溶解于ph7.0的50mmhepes中。將10μl酶溶液添加到190μl底物溶液以引發(fā)反應(yīng)，并在40℃溫育各種時(shí)間段。通過添加350μl丙酮終止反應(yīng)。離心(在18,000g下離心2min)后，通過hplc分析上清液，并確定(i)葉綠素和脫植基葉綠素(ii)脫鎂葉綠素和脫鎂葉綠酸或者(iii)焦脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠素的量。可以通過hplc分析區(qū)分葉綠素和葉綠素衍生物的撇形式和非撇形式，如圖49中所示。將1單位酶活性定義為例如采用本文所述的測(cè)定方法，在40℃每分鐘水解1微摩爾底物(例如葉綠素、脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠素)的酶的量。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，基于例如通過本文所述測(cè)定方法確定的每克純化酶的活性單位計(jì),本方法中所用的酶具有至少1000u/g、至少5000u/g、至少10000u/g或者至少50000u/g的葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶和/或焦脫鎂葉綠素酶活性。優(yōu)選地，基于每克純化酶的活性單位計(jì)，所述酶具有至少1000u/g、至少5000u/g、至少10000u/g或至少50000u/g的對(duì)葉綠素或葉綠素衍生物(如，葉綠素a'、葉綠素b'、脫鎂葉綠素a'或脫鎂葉綠素b')的撇形式(如a'或b')立體異構(gòu)體的水解活性。在一個(gè)另外的實(shí)施例中，對(duì)葉綠素或葉綠素衍生物的水解活性可以使用如ep10159327.5中所述的方法確定。葉綠素酶在一個(gè)實(shí)施例中，該酶能夠水解葉綠素的至少一種撇形式(如a'或b')立體異構(gòu)體。也可以在本方法中使用催化葉綠素a'或b'酯鍵的水解從而生成脫植基葉綠素a'或b'和葉綠醇的多肽。在一個(gè)實(shí)施例中，該酶是采用酶命名分類法(e.c.3.1.1.14)進(jìn)行分類的葉綠素酶。可使用分離的、重組的或合成的或嵌合的(合成和重組的組合)多肽(例如酶或催化性抗體)，參見例如marchler-bauer(2003)nucleicacidsres.31:383-387(marchler-bauer，2003年，《核酸研究》，第31卷，第383-387頁)。在一個(gè)實(shí)施例中，該酶可以衍生自擬南芥。例如，該酶可以是包含seqidno:2的序列(參見圖13)的多肽。在另一個(gè)實(shí)施例中，葉綠素酶衍生自蓖麻子，如衍生自蓖麻。例如，葉綠素酶可以是包含seqidno:13序列(參見圖24)的多肽。本文還提供包含如seqidno:1至31中任一者定義的多肽序列、以及它們的功能性片段和變體的酶，如下所述。變體和片段水解葉綠素或葉綠素衍生物的撇形式的已知序列的功能性變體和片段也可用于本發(fā)明。所謂“功能性”，是指所述片段或變體保留著對(duì)葉綠素或葉綠素衍生物的撇形式(如a'或b')立體異構(gòu)體的可檢測(cè)水解活性。通常，此類變體和片段顯示與來源葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶或焦脫鎂葉綠素酶序列具有同源性，例如與來源葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶或焦脫鎂葉綠素酶氨基酸序列，如與seqid:2或seqidno:13，如在序列的至少約10、20、30、50、100、200、300、500或1000或更多個(gè)殘基的區(qū)域范圍內(nèi)或在整個(gè)長(zhǎng)度范圍內(nèi)具有至少約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。序列同一性的百分比可以用序列比較算法分析或通過肉眼檢查確定。在一個(gè)方面，序列比較算法是blast算法，例如blast2.2.2版算法。其他適用于本發(fā)明方法的對(duì)葉綠素或葉綠素衍生物的撇形式具有活性的酶，可以通過確定存在于例如已知葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶或焦脫鎂葉綠素酶序列中的保守序列基序的存在性來鑒定。例如，包含絲氨酸活性位點(diǎn)的基序ghsrg(seqidno:32)在葉綠素酶序列中是高度保守的。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明中使用的酶可以包含這種序列。具有合適活性的多肽序列可以通過搜索基因組數(shù)據(jù)庫，例如微生物組宏基因組數(shù)據(jù)庫(美國能源部聯(lián)合基因組研究所(jgi-doe,usa))中這些基序的存在來鑒定。酶的分離和制備適用于本發(fā)明的酶可以從它們的天然來源分離，或可以例如使用重組dna技術(shù)制備。編碼具有葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶和/或焦脫鎂葉綠素酶活性的多肽的核苷酸序列可以分離或構(gòu)建并且用于產(chǎn)生相應(yīng)的多肽。例如，可以使用來自產(chǎn)生該多肽的生物的染色體dna或信使rna，構(gòu)建基因組dna和/或cdna文庫。如果該多肽的氨基酸序列已知，則可以合成標(biāo)記的寡核苷酸探針，并且將它用來鑒定來自從該生物制備的基因組庫中的編碼多肽的克隆(polypeptide-encodingclone)。或者，可以使用含有與另一個(gè)已知多肽的基因同源的序列的標(biāo)記寡核苷酸探針來鑒定編碼多肽的克隆。在后一種情況下，使用較低嚴(yán)格性的雜交和洗滌條件。或者，可以通過以下方式鑒定編碼多肽的克隆：將基因組dna的片段插入到表達(dá)載體(如質(zhì)粒)中，用所得的基因組dna文庫轉(zhuǎn)化酶陰性細(xì)菌，然后將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌接種到含有被該多肽抑制的酶的瓊脂上，從而導(dǎo)致鑒定表達(dá)該多肽的克隆。在又一個(gè)另選方案中，編碼該多肽的核苷酸序列可以通過已確立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備，例如beucages.l.etal(1981)tetrahedronletters22,p1859-1869(beucages.l.等人，1981年，《四面體通訊》，第22卷，第1859-1869頁)所描述的亞磷酰胺方法，或matthesetal(1984)emboj.3,p801-805(matthes等人，1984年，《歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志》，第3卷，第801-805頁)所述的方法。在亞磷酰胺方法中，合成寡核苷酸，例如在自動(dòng)dna合成儀中，將其純化、復(fù)性、連接并克隆入適當(dāng)?shù)妮d體中。核苷酸序列可以為混合的基因組和合成起源、混合的合成和cdna起源或混合的基因組和cdna起源，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過連接合成、基因組或cdna起源的片段制備(視情況而定)。每一連接的片段對(duì)應(yīng)于整個(gè)核苷酸序列的各個(gè)部分。dna序列還可使用特異性引物通過聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)制備，例如us4,683,202或saikirk等人(science(1988)239,pp487-491)(《科學(xué)》，1988年，第239卷，第487-491頁)所描述。本文所用的術(shù)語“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其變體、同源物、片段和衍生物(如其部分)。該核苷酸序列可以來自基因組或者來自合成或者來自重組，無論代表正義鏈還是反義鏈都可以是雙鏈或單鏈。通常，編碼具有葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶和/或焦脫鎂葉綠素酶活性的多肽的核苷酸序列使用重組dna技術(shù)制備。然而，在本發(fā)明的可供選擇的實(shí)施例中，可以使用本領(lǐng)域熟知的化學(xué)方法合成該核苷酸序列的全部或部分(參見caruthersmhetal(1980)nucacidsressympser215-23(caruthersmh等人，1980年，《核酸研究論文集系列》，第215-223頁)和horntetal(1980)nucacidsressympser225-232(hornt等人，1980年，《核酸研究論文集系列》，第225-232頁))。酶序列的修飾一旦已經(jīng)分離出編碼酶的核苷酸序列，或者鑒定到推定性編碼酶核苷酸序列，可能需要修飾選定的核苷酸序列，例如可能需要突變?cè)撔蛄幸灾苽浔景l(fā)明的酶。可以使用合成性寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸含有分布所需突變位點(diǎn)旁側(cè)的核苷酸序列。合適的方法在morinaga等人(biotechnology(1984)2,p646-649(《生物技術(shù)》，1984年，第2卷，第646-649頁))中公開。向酶編碼核苷酸序列引入突變的另一種方法在nelson和long(analyticalbiochemistry(1989),180,p147-151(《分析生物化學(xué)》，1989年，第180卷，第147-151頁))中描述。可以例如使用市售的試劑盒，如來自stratagene的genemorphpcr誘變?cè)噭┖谢蛘邅碜詂lontech的diversifypcr隨機(jī)誘變?cè)噭┖校S機(jī)地引入突變，而不是如上所述進(jìn)行定點(diǎn)誘變。ep0583265提到了優(yōu)化基于pcr的誘變的方法，也可將它們與誘變dna類似物(諸如ep0866796中描述的那些)組合使用。易錯(cuò)pcr技術(shù)適用于產(chǎn)生水解葉綠素和/或葉綠素衍生物的具有優(yōu)選特性的酶變體。wo0206457提到了脂肪酶的分子進(jìn)化。獲得新序列的第三種方法是，用任何數(shù)目的限制性內(nèi)切核酸酶或者諸如dna酶i的酶將不相同的核苷酸序列片段化，并且然后重新組裝出編碼功能蛋白的完整核苷酸序列。或者，可以使用一條或多條不相同的核苷酸序列并在完整核苷酸序列的重新組裝過程中引入突變。dna改組和家族改組技術(shù)適用于產(chǎn)生具有優(yōu)選特性的酶變體。進(jìn)行“改組”的合適方法可以在ep0752008、ep1138763、ep1103606中找到。也可以將改組與其他形式的dna誘變組合，如us6,180,406和wo01/34835中所描述。因此，有可能在體內(nèi)或體外對(duì)核苷酸序列產(chǎn)生多個(gè)定點(diǎn)突變或隨機(jī)突變，并且隨后通過各種方法篩選所編碼多肽的改進(jìn)功能性。例如，采用計(jì)算機(jī)和離體介導(dǎo)的(insilicoandexomediated)重組方法(參見wo00/58517、us6,344,328、us6,361,974)，可以進(jìn)行分子進(jìn)化，其中所產(chǎn)生的變體保留與已知酶或蛋白質(zhì)的非常低的同源性。由此獲得的此類變體可以與已知葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶或焦脫鎂葉綠素酶具有顯著的結(jié)構(gòu)相似性，但是具有非常低的氨基酸序列同源性。另外，作為一個(gè)非限制性例子，可以將多核苷酸序列的突變或自然變體與野生型或其他突變或自然變體重組，以產(chǎn)生新變體。也可以針對(duì)所編碼的多肽的改善功能性篩選這種新變體。上述的和類似的分子進(jìn)化方法的應(yīng)用，允許在事先不知道蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能的情況下鑒定并選擇具有優(yōu)選特性的本發(fā)明酶的變體，并允許產(chǎn)生不可預(yù)測(cè)但有利的突變或變體。在本領(lǐng)域中存在將分子進(jìn)化用于優(yōu)化或改變酶活性的許多例子，這些例子包括(但不限于)如下中的一種或多種：優(yōu)化宿主細(xì)胞中或體外的表達(dá)和/或活性、增加酶活性、改變底物和/或產(chǎn)物特異性、增加或減少酶或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、優(yōu)選環(huán)境條件(如溫度、ph、底物)下改變的酶活性/特異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白，使用分子進(jìn)化工具，可以改變酶以改進(jìn)其功能性。合適地，編碼用于本發(fā)明的酶(例如葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶和/或焦脫鎂葉綠素酶)的核苷酸序列可以編碼變體酶，即與親本酶比較時(shí)，變體酶可以包含至少一個(gè)氨基酸置換、缺失或插入。變體酶保留與親本酶至少1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％的同一性。合適的親本酶可以包括對(duì)葉綠素和/或葉綠素衍生物的撇形式具有水解活性的任何酶。多肽序列本發(fā)明還涵蓋由核苷酸序列編碼的氨基酸序列的用途，所述核苷酸序列編碼用于本發(fā)明方法和/或用途的任一者中的酶。如本文所用，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“多肽”和/或術(shù)語“蛋白質(zhì)”同義。在某些情況下，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“多肽”同義。氨基酸序列可以從合適的來源制備/分離，或可以合成制備或可以使用重組dna技術(shù)制備。合適地，氨基酸序列可通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)從本文教導(dǎo)的分離多肽獲得。一種從分離的多肽確定氨基酸序列的合適方法如下。可以將純化的多肽冷凍干燥，并可將100μg的冷凍干燥材料溶解于50μl的8m尿素和0.4m碳酸氫銨(ph8.4)的混合物中。可將溶解的蛋白質(zhì)變性，并在覆蓋氮?dú)夂图尤?μl的45mm二硫蘇糖醇后在50℃還原15分鐘。冷卻到室溫后，可以加入5μl的100mm碘代乙酰胺，以讓半胱氨酸殘基在氮?dú)庀略诎堤幱谑覝匮苌?5分鐘。可以向以上反應(yīng)混合物加入135μl水和溶于5μl水的5μg內(nèi)切蛋白酶lys-c，然后可在氮?dú)狻?7℃進(jìn)行消化24小時(shí)。所得的多肽可以在vydacc18柱(0.46×15cm；10μm；美國加利福尼亞州分離集團(tuán)(theseparationgroup,california,usa))上使用溶劑a：溶于水的0.1％tfa和溶劑b：溶于乙腈的0.1％tfa通過反相hplc分離。可以在n末端測(cè)序前，將選定的肽在develosilc18上用相同的溶劑體系再進(jìn)行色譜分離。可以根據(jù)廠商說明書(美國加利福尼亞州應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems,california,usa))使用appliedbiosystems476a測(cè)序儀，采用脈沖液體快速循環(huán)進(jìn)行測(cè)序。序列比較在此，術(shù)語“同源物”意指與主題氨基酸序列和主題核苷酸序列具有一定同源性的實(shí)體。在此，術(shù)語“同源性”可以等同于“同一性”。同源氨基酸序列和/或核苷酸序列應(yīng)能提供和/或編碼保留著功能活性和/或增強(qiáng)酶活性的多肽。在本說明書的語境中，同源序列意在包括這樣的氨基酸序列，其可以與主題序列具有至少75、85或90％同一性、優(yōu)選至少95或98％同一性。通常，同源物將包含與主題氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)等等。盡管同源性也可以根據(jù)相似性(即氨基酸殘基具有類似的化學(xué)性質(zhì)/功能)來考慮，但在本說明書的語境中優(yōu)選根據(jù)序列同一性來表示同源性。在本說明書的語境中，同源序列意在包括這樣的核苷酸序列，其可與編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列(主題序列)具有至少75、85或90％同一性、優(yōu)選至少95或98％同一性。通常，同源物將包含與主題序列相同的編碼活性位點(diǎn)等的序列。盡管同源性也可以根據(jù)相似性(即氨基酸殘基具有類似的化學(xué)性質(zhì)/功能)來考慮，但在本說明書的語境中優(yōu)選根據(jù)序列同一性來表示同源性。同源性比較可通過眼，或更通常地，借助于容易獲得的序列比較程序來進(jìn)行。這些商購的計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算兩個(gè)或更多個(gè)序列之間的％同源性。可以對(duì)連續(xù)序列計(jì)算％同源性，即一個(gè)序列與其他序列比對(duì)，并且一個(gè)序列中的每個(gè)氨基酸直接與其他序列中相應(yīng)的氨基酸比較，每次一個(gè)殘基。這稱為“無空位”比對(duì)。通常，這種無空位比對(duì)僅在相對(duì)短數(shù)目的殘基范圍內(nèi)進(jìn)行。盡管這是十分簡(jiǎn)單和可靠的方法，但其不能考慮，例如，在原本相同的一對(duì)序列中，一個(gè)插入或缺失將引起后面的氨基酸殘基不再對(duì)齊，從而在進(jìn)行全局比對(duì)時(shí)可能導(dǎo)致％同源性有大的降低。因此，將大多數(shù)序列比較方法設(shè)計(jì)產(chǎn)生最佳比對(duì)，所述最佳比對(duì)考慮可能的插入和缺失而不會(huì)過度罰掉整體同源性分?jǐn)?shù)。這通過在序列比對(duì)中插入“空位”以試圖使局部同源性最大化來實(shí)現(xiàn)。然而，這些更復(fù)雜的方法向比對(duì)結(jié)果中出現(xiàn)的每一個(gè)空位賦予“空位罰分”，從而對(duì)于同樣數(shù)目的相同氨基酸，具有盡可能少空位的序列比對(duì)(反映兩條比較序列之間相關(guān)性較高)將獲得比具有許多空位的序列比對(duì)結(jié)果更高的分?jǐn)?shù)。通常使用“仿射空位成本(affinegapcosts)”，其對(duì)空位的存在征收相對(duì)較高的成本，對(duì)該空位中每一個(gè)后續(xù)殘基征收較少的罰分。這是最通常使用的空位評(píng)分系統(tǒng)。高的空位罰分將當(dāng)然會(huì)產(chǎn)生具有較少空位的最佳比對(duì)結(jié)果。大多數(shù)比對(duì)程序允許修改空位罰分。然而，當(dāng)用這種軟件進(jìn)行序列比較時(shí)優(yōu)選使用默認(rèn)值。最大％同源性的計(jì)算因而首先需要在考慮空位罰分的情況下產(chǎn)生最佳比對(duì)。適用于進(jìn)行這種比對(duì)的計(jì)算機(jī)程序是vectorntiadvancetm11(英杰公司(invitrogencorp.))。其他可進(jìn)行序列比較的軟件的例子包括(但不限于)：blast軟件包(參見ausubeletal1999shortprotocolsinmolecularbiology,4thed-chapter18(ausubel等人，1999年，《精編分子生物學(xué)方案》，第4版，第18章))和fasta(altschuletal1990j.mol.biol.403-410(altschul等人，1990年，《分子生物學(xué)雜志》，第403-410頁))。blast和fasta均可用于離線和在線搜索(參見ausubel等人，1999年，第7-58至7-60頁)。然而，對(duì)于一些應(yīng)用，使用vectorntiadvancetm11程序是優(yōu)選的。稱為blast2sequences的新型工具也可用于比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列(參見femsmicrobiollett1999174(2):247-50(《歐洲微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)微生物學(xué)通訊》，1999年，第174卷第2期，第247-250頁)和femsmicrobiollett1999177(1):187-8(《歐洲微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)微生物學(xué)通訊》，1999年，第177卷第1期，第187-188頁))。盡管最終的同源性百分?jǐn)?shù)(％)也可以就同一性來度量，但比對(duì)過程本身通常不是基于要么全有要么全無的成對(duì)比較。相反，通常使用標(biāo)度化相似性評(píng)分矩陣，該矩陣基于化學(xué)相似性或進(jìn)化距離向每一成對(duì)比較賦予分值。通常使用的這種矩陣的實(shí)例是blosum62矩陣-blast程序包的默認(rèn)矩陣。vectornti程序通常使用公用默認(rèn)值或定制的符號(hào)比較表(如果提供的話)(對(duì)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)請(qǐng)參見用戶手冊(cè))。對(duì)于某些應(yīng)用，優(yōu)選使用vectorntiadvancetm11程序包的默認(rèn)值。作為另外一種選擇，同源性百分?jǐn)?shù)可用vectorntiadvancetm11(英杰公司(invitrogencorp.))中的多重比對(duì)特征來計(jì)算，該特征基于類似于clustal(higginsdg&sharppm(1988),gene73(1),237-244(higginsdg和sharppm，1988年，《基因》，第73卷第1期，第237-244頁))的算法。一旦該軟件已經(jīng)產(chǎn)生最佳比對(duì)結(jié)果，則有可能計(jì)算％同源性，優(yōu)選％序列同一性。作為序列比較的一部分，該軟件通常進(jìn)行這些計(jì)算并產(chǎn)生數(shù)值結(jié)果。如果確定序列同一性時(shí)使用空位罰分，則可優(yōu)選地使用程序的默認(rèn)參數(shù)于成對(duì)比對(duì)。例如，以下參數(shù)是blast2成對(duì)比對(duì)的當(dāng)前默認(rèn)參數(shù)：在一個(gè)實(shí)施例中，優(yōu)選地核苷酸序列和/或氨基酸序列的序列同一性可以通過blast2(blastn)使用如上定義的評(píng)分參數(shù)設(shè)置確定。出于本發(fā)明的目的，同一性的程度是基于相同的序列元件的數(shù)目。根據(jù)本發(fā)明氨基酸序列的同一性程度可合適地通過本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序例如vectorntiadvancetm11(英杰公司(invitrogencorp.))確定。對(duì)于成對(duì)比對(duì)，所使用的評(píng)分參數(shù)優(yōu)選地為blosum62，其中空位存在罰分為11，空位延伸罰分為1。合適地，關(guān)于核苷酸序列的同一性程度是在至少20個(gè)連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選在至少30個(gè)連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選在至少40個(gè)連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選在50個(gè)連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選在至少60個(gè)連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選在至少100個(gè)連續(xù)核苷酸上測(cè)定。合適地，關(guān)于核苷酸序列的同一性程度可在整個(gè)序列上測(cè)定。氨基酸突變序列還可以具有氨基酸殘基的插入或置換，所述插入或置換產(chǎn)生沉默改變和導(dǎo)致功能等同的物質(zhì)。可以基于殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)的相似性進(jìn)行有意的氨基酸置換，只要該物質(zhì)的二級(jí)結(jié)合活性得以保留。例如，帶負(fù)電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；并且具有類似親水性值的含不帶電的極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯基丙氨酸和酪氨酸。可以例如根據(jù)下表進(jìn)行保守置換。第二列中同一區(qū)組內(nèi)的氨基酸，優(yōu)選第三列中同一行內(nèi)的氨基酸可以彼此置換：本發(fā)明還涵蓋可能出現(xiàn)的同源置換(在本文中，置換和取代均用來指將現(xiàn)有的氨基酸殘基用另選的殘基進(jìn)行交換)，即對(duì)等置換，如堿性對(duì)堿性、酸性對(duì)酸性、極性對(duì)極性等。非同源置換也可能出現(xiàn)，即從一類殘基置換成另一類殘基，或者涉及到加入非自然氨基酸，如鳥氨酸(下文稱為z)、二氨基丁酸鳥氨酸(下文稱為b)、正亮氨酸鳥氨酸(下文稱為o)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。置換還可以由非天然氨基酸產(chǎn)生。變體氨基酸序列可以包括可在序列的任何兩個(gè)氨基酸殘基之間插入的合適間隔基團(tuán)，這些間隔基團(tuán)除了氨基酸間隔物如甘氨酸或β-丙氨酸殘基外還包括烷基基團(tuán)如甲基、乙基或丙基基團(tuán)。變異的另一種形式(涉及存在類肽(peptoid)形式的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基)將是本領(lǐng)域技術(shù)人員十分了解的。為了避免疑惑，“類肽形式”用于指其中α-碳取代基處于殘基的氮原子而不是α-碳上的變體氨基酸殘基。用于制備類肽形式的肽的方法是本領(lǐng)域已知的，例如simonrjetal.,pnas(1992)89(20),9367-9371(simonrj等人，《美國國家科學(xué)院院刊》，1992年，第89卷第20期，第9367-9371頁)和horwelldc,trendsbiotechnol.(1995)13(4),132-134(horwelldc，《生物技術(shù)趨勢(shì)》，1995年，第13卷第4期，第132-134頁)。核苷酸序列用于在本發(fā)明中的核苷酸序列或者編碼具有本文所定義的特定性質(zhì)的多肽的核苷酸序列，可以在其中包含合成的或修飾的核苷酸。對(duì)寡核苷酸的多種不同類型的修飾是本領(lǐng)域已知的。這包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯主鏈和/或在分子的3'和/或5'端添加吖啶或多聚賴氨酸鏈。出于本發(fā)明的目的，應(yīng)當(dāng)理解本文所描述的核苷酸序列可以通過本領(lǐng)域可用的任何方法修飾。可進(jìn)行此類修飾以提高核苷酸序列的體內(nèi)活性或壽命。本發(fā)明還涵蓋與本文所討論的序列互補(bǔ)的核苷酸序列或其任何衍生物、片段或衍生物的用途。如果序列與其片段互補(bǔ)，則該序列可用作探針來鑒別其他生物體中的相似編碼序列等等。不與本發(fā)明的序列100％同源但處于本發(fā)明的范圍之內(nèi)的多核苷酸可以多種方式獲得。本文描述的序列的其他變體可例如通過用探針探測(cè)從一系列個(gè)體，例如來自不同種群的個(gè)體制備的dna文庫來獲得。此外，可以獲得植物細(xì)胞中存在的其他病毒/細(xì)菌或細(xì)胞同源物，特別是細(xì)胞同源物，此類同源物及其片段通常將能夠選擇性地與本文序列表中所示的序列雜交。此類序列可以通過如下方式獲得：探測(cè)從其他植物物種制備的cdna文庫或基因組dna文庫，并且在中等至高嚴(yán)格性條件下用包含隨附的序列表中的序列中的任一條的全部或部分的探針探測(cè)此類文庫。類似的考慮用來獲得本發(fā)明的多肽或核苷酸序列的種同源物和等位基因變體。變體和株系/物種同源物還可用簡(jiǎn)并pcr獲得，簡(jiǎn)并pcr將使用下述引物，所述引物設(shè)計(jì)成靶向變體和同源物內(nèi)部編碼本發(fā)明序列中保守氨基酸序列的序列。保守序列可例如通過比對(duì)來自數(shù)種變體/同源物的氨基酸序列來預(yù)測(cè)。序列比對(duì)可以用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)軟件來進(jìn)行。例如，廣泛使用gcgwisconsinpileup程序。簡(jiǎn)并pcr中使用的引物將含有一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)并位置并將在比從已知序列用單序列引物克隆序列所用的嚴(yán)格性條件低的嚴(yán)格性條件下使用。作為另外一種選擇，這種多核苷酸可通過對(duì)已表征的序列進(jìn)行定點(diǎn)誘變來獲得。在例如需要沉默密碼子序列改變來優(yōu)化多核苷酸序列在其中表達(dá)的特定宿主細(xì)胞的密碼子偏好的情形中這可能是有用的。為了引入限制多肽識(shí)別位點(diǎn)，或者為了改變由多核苷酸編碼的多肽的性質(zhì)或功能，可能需要其他的序列改變。本發(fā)明的多核苷酸(核苷酸序列)可以用來產(chǎn)生引物(例如pcr引物)、用于可變擴(kuò)增反應(yīng)的引物、探針(例如用放射性或非放射性標(biāo)記通過常規(guī)手段標(biāo)記有顯示標(biāo)記的探針)，或者可以將該多核苷酸克隆入載體中。這類引物、探針和其他片段將具有至少15個(gè)，優(yōu)選至少20個(gè)，例如至少25、30或40個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并且也被本文所用的術(shù)語“本發(fā)明的多核苷酸”涵蓋。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸如dna多核苷酸和探針可重組產(chǎn)生、合成產(chǎn)生或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何手段產(chǎn)生。它們還可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)克隆。通常，引物將通過合成手段產(chǎn)生，涉及所需核酸序列的逐步制備，一次一個(gè)核苷酸。利用自動(dòng)化技術(shù)完成該過程的技術(shù)是本領(lǐng)域輕易獲得的。較長(zhǎng)的多核苷酸通常將用重組手段產(chǎn)生，例如用pcr(聚合酶鏈反應(yīng))克隆技術(shù)。這將涉及到制備在需要克隆的酶序列區(qū)域旁側(cè)分布的一對(duì)引物(例如約15至30個(gè)核苷酸的引物)，使引物與從植物細(xì)胞獲得的mrna或cdna接觸，在導(dǎo)致所需區(qū)域擴(kuò)增的條件下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，分離擴(kuò)增的片段(例如通過在瓊脂糖凝膠上純化反應(yīng)混合物來分離)并且回收擴(kuò)增的dna。引物可被設(shè)計(jì)為含有合適的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)使得可將擴(kuò)增的dna克隆進(jìn)合適的克隆載體中。酶的配制和劑量本發(fā)明方法中所用的酶可以進(jìn)行配制或改性，例如化學(xué)改性，以提高油溶解度、穩(wěn)定性、活性或用于固定。例如，本發(fā)明方法中所用的酶可以配制為兩親或更親脂的。例如，本發(fā)明方法中所用的酶可以包埋在例如脂質(zhì)體或凝膠，如藻酸鹽水凝膠或藻酸鹽微珠或等同物中。本發(fā)明方法中所用的酶可以在膠束體系，例如三元膠束(tms)或反膠束體系(rms)介質(zhì)中配制。本發(fā)明方法中所用的酶可以如yi(2002)j.ofmolecularcatalysisb:enzymatic,vol.19,pgs319-325(yi，2002年，《分子催化雜志，b輯：酶催化》，第19卷，第319-325頁)中所述進(jìn)行配制。本發(fā)明方法的酶反應(yīng)，如使油接觸能夠水解葉綠素或葉綠素衍生物的撇形式(如a'或b')立體異構(gòu)體的酶的步驟，可以在一個(gè)反應(yīng)容器或多個(gè)反應(yīng)容器中完成。在一個(gè)方面，本發(fā)明方法的酶促反應(yīng)在植物油精制設(shè)備或工廠中進(jìn)行。本發(fā)明的方法可以用固定化酶實(shí)施，例如固定化葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶和/或焦脫鎂葉綠素酶。該酶可以固定在任何有機(jī)或無機(jī)載體上。示例性無機(jī)載體包括氧化鋁、硅藻土、dowex-1-氯化物、玻璃微珠和硅膠。示例性有機(jī)載體包括deae-纖維素、藻酸鹽水凝膠或藻酸鹽微珠或等同物。在本發(fā)明的各個(gè)方面，酶的固定化可以通過物理吸附于無機(jī)載體上而優(yōu)化。用于實(shí)施本發(fā)明的酶可固定在不同的介質(zhì)中，包括水、tris-hcl緩沖溶液以及包含tris-hcl緩沖溶液、己烷和表面活性劑的三元膠束體系。可以將酶固定至任何類型的基底，例如過濾器、纖維、柱、微珠、膠體、凝膠、水凝膠、網(wǎng)片等等。酶可以按任何合適的量加入油中。例如，酶可以按約0.001至10u/g組合物，優(yōu)選地0.01至1u/g，例如0.01至0.1u/g油的范圍加入。將1個(gè)單位定義為如在j.biol.chem.(1961)236:2544-2547(《生物化學(xué)雜志》，1961年，第236卷，第2544-2547頁)中所述的測(cè)定條件下，在40℃每分鐘水解1μmol底物(如葉綠素a或b、脫鎂葉綠素a或b和/或焦脫鎂葉綠素a或b、或它們的撇形式(如a'或b')立體異構(gòu)體)的酶量。酶反應(yīng)條件通常，油可以與酶在約5℃至約100℃之間，更優(yōu)選地在10℃至約90℃之間，更優(yōu)選地在約15℃至約80℃之間，更優(yōu)選地在約20℃至約75℃之間溫育(或混合)。脫鎂葉綠素在高溫下分解為焦脫鎂葉綠素，這通常是較不優(yōu)選的，因?yàn)榕c脫鎂葉綠素相比，一些葉綠素酶對(duì)焦脫鎂葉綠素活性較低。此外，焦脫鎂葉綠素的葉綠素酶降解產(chǎn)物焦脫鎂葉綠素的水溶性比脫鎂葉綠酸低，并且因此之后更難從油移除。酶反應(yīng)速率在高溫下增加，但有利于使脫鎂葉綠素至焦脫鎂葉綠素的轉(zhuǎn)化保持為最小。根據(jù)以上描述，在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，油與酶在低于約80℃，優(yōu)選地低于約70℃，優(yōu)選地約68℃或更低，優(yōu)選地約65℃或更低的溫度溫育，以減少向焦脫鎂葉綠素轉(zhuǎn)化的量。然而，為了保持良好的反應(yīng)速率，優(yōu)選的是與酶溫育期間保持油的溫度高于50℃。因此，酶與油溫育的優(yōu)選溫度范圍包括約50℃至低于約70℃，約50℃至約65℃以及約55℃至約65℃。優(yōu)選地，當(dāng)酶與油混合時(shí)，油的溫度可以處于所需的反應(yīng)溫度。在酶加入之前和/或期間，可以將油加熱和/或冷卻至所需溫度。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，設(shè)想本發(fā)明方法的其他步驟可以是冷卻和/或加熱油。反應(yīng)時(shí)間(即酶與油溫育的時(shí)間段，優(yōu)選伴以攪拌)可適當(dāng)?shù)厥谷~綠素和葉綠素衍生物(尤其它們的撇形式(如a'或b')立體異構(gòu)體)的水解持續(xù)足夠的時(shí)間，從而形成例如葉綠醇和脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和/或焦脫鎂葉綠酸。例如，反應(yīng)時(shí)間可以為至少約1分鐘，更優(yōu)選地至少約5分鐘，更優(yōu)選地至少約10分鐘。在一些實(shí)施例中，反應(yīng)時(shí)間可以在約15分鐘至約6小時(shí)之間，優(yōu)選地在約15分鐘至約60分鐘之間，優(yōu)選地約30至約120分鐘。在一些實(shí)施例中，反應(yīng)時(shí)間可以為最多6小時(shí)。優(yōu)選地，在約ph4.0和約ph10.0之間，更優(yōu)選地在約ph5.0和約ph10.0之間，更優(yōu)選地在約ph6.0和約ph10.0之間，更優(yōu)選地在約ph5.0和約ph7.0之間，更優(yōu)選地在約ph5.0和約ph7.0之間，更優(yōu)選地在約ph6.5和約ph7.0之間，例如在約ph7.0(即中性ph)下實(shí)施該方法。在一個(gè)實(shí)施例中，優(yōu)選地在約ph5.5和ph6.0之間實(shí)施該方法。與酶溫育(或混合)時(shí)，油中的水含量可以適當(dāng)?shù)卦诩s0.5至約5％水之間，更優(yōu)選地在約1至約3％之間，并且更優(yōu)選地在約1.5和約2％之間。當(dāng)使用固定化酶時(shí)，固定化酶的水活度可適當(dāng)?shù)卦诩s0.2至約0.98的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在約0.4至約0.9之間，更優(yōu)選地在約0.6至約0.8之間。油的分離使用本發(fā)明的酶進(jìn)行酶處理步驟后，在一個(gè)實(shí)施例中處理后的液體(例如油)以適當(dāng)?shù)难b置(例如離心分離器)分離，從而得到加工油。在完成酶處理后，如有必要，加工油可以另外用水或有機(jī)或無機(jī)酸，例如乙酸、檸檬酸、磷酸、琥珀酸等等洗滌，或用鹽溶液洗滌。葉綠素和/或葉綠素衍生物移除涉及酶處理的本發(fā)明方法通常減少油中葉綠素和/或葉綠素衍生物(特別是它們的撇形式(如a'或b')立體異構(gòu)體)的水平。例如，與處理前油中存在的葉綠素、脫鎂葉綠素和/或焦脫鎂葉綠素的濃度(按重量計(jì))相比，該方法可以使葉綠素a或b、脫鎂葉綠素a或b和/或焦脫鎂葉綠素a或b或它們的撇形式(如a'或b')立體異構(gòu)體的濃度減少至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。因此在特定的實(shí)施例中，基于油的總重量，處理后油中葉綠素和/或葉綠素衍生物或它們的撇形式(如a'或b')立體異構(gòu)體的濃度可以小于100、小于50、小于30、小于10、小于5、小于1、小于0.5、小于0.1mg/kg或小于0.02mg/kg。如果使用對(duì)葉綠素或葉綠素衍生物的非撇形式具有立體特異性的酶，則在用酶處理后，與油中殘余的非形式和撇形式立體異構(gòu)體的總量相比，植物油通常包含比例下降的非撇形式立體異構(gòu)體(參見實(shí)例3和下圖48)。相比之下，在本發(fā)明的實(shí)施例中，本發(fā)明方法中所用的酶通常對(duì)葉綠素和葉綠素衍生物的非撇形式具有降低的立體特異性，即所述酶通常不僅能夠水解撇形式，還能夠水解非撇形式。因此，在本發(fā)明的處理步驟后，油中殘余的非撇形式立體異構(gòu)體的比例通常比使用立體特異性酶時(shí)下降得更少。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在通常情況下，粗制油(如粗制大豆油或菜籽油)可以包含大約70％的非撇形式立體異構(gòu)體(如脫鎂葉綠素a)和30％的撇形式立體異構(gòu)體(如脫鎂葉綠素a')。在一個(gè)實(shí)施例中，用酶處理后，基于油中葉綠素或葉綠素衍生物的非主要(如a和/或b)立體異構(gòu)體和撇形式(如a'和/或a')立體異構(gòu)體的總量計(jì)，所述油包含至少50％的葉綠素或葉綠素衍生物的非撇形式(如a和/或b)立體異構(gòu)體。更優(yōu)選地，所述油在處理后包含至少55％、至少60％或至少65％的葉綠素或葉綠素衍生物的非撇形式立體異構(gòu)體。在一個(gè)實(shí)施例中，用酶處理后，基于油中脫鎂葉綠素a和脫鎂葉綠素a'的總量計(jì)，所述油包含至少50％、至少60％或至少65％的脫鎂葉綠素a。在一個(gè)實(shí)施例中，用酶處理后，基于油中脫鎂葉綠素b和脫鎂葉綠素b'的總量計(jì)，所述油包含至少50％、至少60％或至少65％的脫鎂葉綠素b。在這些實(shí)施例中，通常條件可以是(例如)約20℃至約70℃(如約40℃或約60℃)，ph5至8(如約ph6.0或約ph7.0)并且水含量為1至3％(如約2％)。處理時(shí)間可以包括(例如)至少1小時(shí)，優(yōu)選2小時(shí)或更多，更優(yōu)選4小時(shí)或更多。進(jìn)一步加工步驟在典型的植物油加工方法中，將油提取于己烷中，使粗制植物油脫膠，任選地經(jīng)堿中和，漂白(使用例如粘土吸附，隨后棄去粘土)，并且脫臭從而產(chǎn)生精制、漂白和脫臭的油或rbd油(參見圖50)。對(duì)脫膠步驟的需要取決于磷含量和其他因素。本發(fā)明的方法可與基于己烷提取和/或酶輔助油提取的方法結(jié)合使用(參見journalofamericaloilchemists’society(2006),83(11),973-979(《美國油脂化學(xué)家協(xié)會(huì)雜志》，2006年，第83卷第11期，第973-979頁))。通常，本發(fā)明的方法可以使用如bailey’sindustrialoilandfatproducts(2005),6thedition,ed.byfereidoonshahidi,johnwiley&sons(《貝雷工業(yè)油脂產(chǎn)品》，2005年，第6版，fereidoonshahidi編輯，約翰威立父子出版公司)中所述的油加工步驟進(jìn)行。在本發(fā)明的實(shí)施例中，涉及使用能夠水解葉綠素或葉綠素衍生物的酶的酶促反應(yīng)可以在該方法的不同階段進(jìn)行，如圖50中所示。在特定實(shí)施例中，酶在脫膠步驟前與油接觸。在另一個(gè)實(shí)施例中，酶可以在水脫膠步驟期間與油接觸。在另一個(gè)實(shí)施例中，酶與水脫膠油接觸，但該接觸在脫膠完成之前(如，在全脫膠或堿中和步驟之前)進(jìn)行。在用酶處理后，進(jìn)一步加工步驟可幫助移除葉綠素和/或葉綠素衍生物的酶法水解產(chǎn)物。例如，進(jìn)一步加工步驟可移除脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸、焦脫鎂葉綠素和/或葉綠醇。脫膠煉油中的脫膠步驟起到通過加入水來分離磷脂的作用。將通過脫膠沉淀的物質(zhì)分離，并且進(jìn)一步加工為卵磷脂的混合物。商業(yè)化卵磷脂，例如大豆卵磷脂和向日葵卵磷脂是半固態(tài)的或十分粘的物質(zhì)。它們由極性脂質(zhì)(主要是磷脂例如磷脂酰膽堿)與三甘油酯的微量組分的混合物組成。如本文所用，術(shù)語“脫膠”意指通過從油中移除磷脂來精制油。在一些實(shí)施例中，脫膠可以包括將磷脂(例如卵磷脂和磷脂)轉(zhuǎn)化為可水化磷脂的步驟。本發(fā)明的方法可使用任何脫膠工序，尤其是在脫膠步驟前葉綠素或葉綠素衍生物水解酶與油接觸的實(shí)施例。合適的脫膠方法包括水脫膠法、alcon油脫膠法(例如用于大豆)、safinco脫膠法、“超級(jí)脫膠”、超濾脫膠法、top脫膠法、聯(lián)合脫膠法、干式脫膠法和enzymaxtm脫膠法。參見例如美國專利no.6,355,693、no.6,162,623、no.6,103,505、no.6,001,640、no.5,558,781、no.5,264,367、no.5,558,781、no.5,288,619、no.5,264,367、no.6,001,640、no.6,376,689、wo0229022、wo98118912等等。由本發(fā)明方法并入的各種脫膠工序在bockisch,m.(1998),fatsandoilshandbook,theextractionofvegetableoils(chapter5),345-445,aocspress,champaign,illinois(bockisch,m.，1998年，《油脂手冊(cè)，植物油的提取》，第5章，第345-445頁，美國伊利諾伊州尚佩恩的aocs出版社)中描述。水脫膠法通常指其中油與水(例如1至5重量％)溫育以移除磷脂的步驟。通常，水法脫膠法可以在高溫，如50至90℃進(jìn)行。可攪拌油/水混合物例如5至60分鐘，以允許磷脂分離進(jìn)入水相，所述水相然后從油中除去。也可以進(jìn)行酸脫膠法。例如，可以在60至70℃下使油與酸(例如0.1至0.5％的50％的檸檬酸或蘋果酸溶液)接觸，混合，與1至5％的水接觸，并且冷卻至25至45℃。隨本發(fā)明方法使用的其他合適脫膠工序在wo2006/008508中描述。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括使葉綠素或葉綠素衍生物水解酶與油接觸，隨后使用酰基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行酶法脫膠步驟，如wo2006/008508中所述。適用于本方法的酰基轉(zhuǎn)移酶在wo2004/064537、wo2004/064987和wo2009/024736中也有所描述。可以使用任何具有酰基轉(zhuǎn)移酶活性的酶(通常分類為e.c.2.3.1)，尤其包含氨基酸序列基序gdsx的酶，其中x為以下氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)：l、a、v、i、f、y、h、q、t、n、m或s。在一個(gè)實(shí)施例中，酰基轉(zhuǎn)移酶為具有asn80asp突變的突變型殺鮭氣單胞菌(aeromonassalmonicida)成熟脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶(gcat)。在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括使用磷脂酶的脫膠步驟。可以使用具有例如磷脂酶a1(e.c.3.1.1.32)或磷脂酶a2(e.c.3.1.1.4)活性的任何酶，例如lecitase或胰磷脂酶a2(丹麥諾維信公司(novozymes,denmark))。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將葉綠素或葉綠素衍生物水解酶與油接觸，然后是使用磷脂酶的酶促脫膠步驟，例如使用如在us5,264,367、ep0622446、wo00/32758或clausen(2001)“enzymaticoildegummingbyanovelmicrobialphospholipase,”eur.j.lipidsci.technol.103:333-340(“通過新型微生物磷脂酶進(jìn)行酶法油脫膠”，《歐洲脂質(zhì)科學(xué)和技術(shù)雜志》，第103卷，第333-340頁)中所述的脫膠步驟。在另一個(gè)實(shí)施例中，脫膠步驟可以為水脫膠步驟。在另一個(gè)實(shí)施例中，可以使用利用酶(例如磷脂酶c(iub3.1.4.1))的酶促脫膠步驟。可以在脫膠步驟中使用的具有磷脂酶c活性的多肽在例如wo2008143679、wo2007092314、wo2007055735、wo2006009676和wo03089620中公開。適用于本發(fā)明中的合適磷脂酶c為得自美國馬薩諸塞州劍橋維萊尼姆公司(vereniumcorporation,cambridge,ma)的酸處理/堿中和在一些實(shí)施例中，在水脫膠后可以進(jìn)行酸處理/堿中和步驟以進(jìn)一步降低油中的磷脂水平。在另一個(gè)實(shí)施例中，可以進(jìn)行包括酸處理/堿中和的單一脫膠步驟。此類方法通常稱為全脫膠或堿煉。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，酸處理/堿中和步驟對(duì)于移除葉綠素的酶水解產(chǎn)物，例如脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和焦脫鎂葉綠素是特別有效的。因此，該步驟可以在酶處理步驟后的任何階段進(jìn)行。例如，此步驟可以包括加入酸例如磷酸，然后用堿例如氫氧化鈉中和。在酸/堿中和處理后，將化合物例如脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和焦脫鎂葉綠素從油中萃取到水相中。在此類方法中，通常首先將油與0.05至0.5重量％的濃磷酸例如在50至90℃的溫度接觸，并且混合以幫助沉淀磷脂。接觸時(shí)間可以是例如10秒至30分鐘。隨后，例如在50至90℃的溫度加入堿的水溶液(例如1至20％的氫氧化鈉水溶液)，然后溫育并且混合10秒至30分鐘。然后可以將油加熱至約90℃，并通過離心使含水皂相與油分離。任選地，也可以使用例如氫氧化鈉或水進(jìn)行進(jìn)一步洗滌步驟。移除脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和焦脫鎂葉綠酸本發(fā)明的方法可以任選地涉及移除不含葉綠醇的葉綠素衍生物諸如脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和焦脫鎂葉綠酸(包括它們的撇形式和非撇形式)的步驟。由于本發(fā)明的酶對(duì)葉綠素或葉綠素衍生物的水解，此類產(chǎn)物可以存在于組合物中，或者可以作為污染物，或作為加工產(chǎn)物中的不需要組分天然存在。由于脫鎂葉綠酸的分解，焦脫鎂葉綠素也可以存在于組合物中，脫鎂葉綠酸本身可以由具有脫鎂葉綠素酶活性的酶對(duì)脫鎂葉綠素的活性來產(chǎn)生，或者脫鎂葉綠酸可以在葉綠素酶對(duì)葉綠素作用后由脫植基葉綠素形成(參見圖1)。用于油精制的加工條件，尤其是加熱可以促進(jìn)主要組分焦脫鎂葉綠素的形成，例如促進(jìn)脫鎂葉綠素轉(zhuǎn)化為焦脫鎂葉綠素，焦脫鎂葉綠素隨后水解為焦脫鎂葉綠素。在一個(gè)實(shí)施例中，與酶處理之前和之后的任一含量或二者含量相比，本發(fā)明的方法減少了油中脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和/或焦脫鎂葉綠素的含量。在一些實(shí)施例中，在酶處理后脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和/或焦脫鎂葉綠素的濃度可以增加。通常，方法涉及移除脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和/或焦脫鎂葉綠素的步驟，使得此類產(chǎn)物的濃度低于酶處理后的濃度。優(yōu)選地，將通過該酶促步驟產(chǎn)生的脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和/或焦脫鎂葉綠素從油中移除，使得這些產(chǎn)物在油中的最終含量低于酶處理前的含量。例如，與脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和/或焦脫鎂葉綠酸移除步驟前，即酶處理之前或之后，油中存在的脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和/或焦脫鎂葉綠酸濃度(按重量計(jì))相比，該方法可以降低脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和/或焦脫鎂葉綠酸(包括它們的撇形式和非撇形式)的濃度至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。因此在特定的實(shí)施例中，按組合物(例如植物油)的總重量計(jì)，移除步驟后油中脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和/或焦脫鎂葉綠素的濃度可以低于100、低于50、低于30、低于10、低于5、低于1、低于0.5、低于0.1mg/kg、或低于0.02mg/kg。本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)是，反應(yīng)產(chǎn)物例如脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和/或焦脫鎂葉綠素可以通過例如酸處理/堿中和步驟簡(jiǎn)單、輕松地從油中移除。因此，在優(yōu)選的實(shí)施例中，葉綠素和葉綠素衍生物可以基本上從油中移除，而無需進(jìn)一步加工步驟，例如粘土和/或二氧化硅處理和脫臭(如圖50中所示的虛線框表示的)。粘土處理特別優(yōu)選該方法不包括粘土處理步驟。避免使用粘土是有利的，原因前已述及，尤其是降低成本，減少因粘土粘附造成的油損失以及增加有效化合物例如類胡蘿卜素和生育酚的保留。在一些實(shí)施例中，方法可以在無粘土處理步驟和無脫臭步驟下進(jìn)行，與涉及粘土處理的方法相比，這導(dǎo)致精制油中此類有用化合物濃度的增加。二氧化硅處理雖然并不總是需要，但在一些實(shí)施例中，該方法可以包括二氧化硅處理步驟,優(yōu)選地在酶處理之后包括。例如，該方法可以包括使用本領(lǐng)域已知的無吸附劑或含少量吸附劑的二氧化硅精制裝置和方法，例如使用trisyl二氧化硅精制方法(美國馬里蘭州哥倫比亞的格雷斯戴維森公司(gracedavison,columbia,md))或sorbsilrtm二氧化硅(美國伊利諾伊州喬利埃特的英力士二氧化硅公司(ineossilicas,joliet,il))。二氧化硅處理步驟可用于移除油中的任何殘余脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和/或焦脫鎂葉綠素或其他極性組分。例如，在一些實(shí)施例中，二氧化硅處理步驟可以用作酸處理/堿中和(全脫膠或堿精制)步驟的替代步驟。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括兩階段二氧化硅處理，例如包括由其中移除二氧化硅的分離步驟分隔的兩個(gè)二氧化硅處理步驟。二氧化硅處理可以在升高的溫度，例如在高于約30℃、更優(yōu)選地約50至150℃、約70至110℃、約80至100℃或約85至95℃、最優(yōu)選地約90℃進(jìn)行。脫臭在一些實(shí)施例中，該方法可以包括脫臭步驟，通常作為該方法中的最終精制步驟。在一個(gè)實(shí)施例中，脫臭是指油的蒸汽蒸餾，這通常移除揮發(fā)性氣味和風(fēng)味化合物、生育酚、甾醇、甾烷醇、類胡蘿卜素以及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。通常，將油在低壓(例如0.1至1kpa)下加熱至220至260℃以排除氣體。將蒸汽(例如1-3重量％)經(jīng)油吹過例如15至120分鐘以移除揮發(fā)性化合物。可以收集含水餾出液。在另一個(gè)實(shí)施例中，脫臭可以使用惰性氣體(例如氮?dú)?代替蒸汽進(jìn)行。因此，脫臭步驟可以包括用惰性氣體(例如氮?dú)?進(jìn)行氣泡精煉或鼓泡，例如在a.v.tsiadietal“nitrogenbubblerefiningofsunfloweroilinshallowpools”,journaloftheamericanoilchemists'society(2001),volume78(4),pages381-385(a.v.tsiadi等人，“在淺池中用氮?dú)鈿馀菥珶捪蛉湛汀保睹绹椭瘜W(xué)家協(xié)會(huì)雜志》，2001年，第78卷，第4期，第381-385頁)中所描述。可以收集通過油的氣相并且任選地使其冷凝，和/或可將來自其中的揮發(fā)性化合提取到水相中。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明方法進(jìn)行時(shí)無需粘土處理，但包括脫臭步驟。有用的化合物(例如類胡蘿卜素、甾醇、甾烷醇和生育酚)可以至少部分地從油中萃取到餾出液(例如含水或含氮餾出液)中，所述餾出液得自脫臭步驟。該餾出液提供了化合物例如類胡蘿卜素和生育酚的寶貴來源，而所述化合物在包括粘土處理的方法中可因夾帶而至少部分地?fù)p耗。生育酚在漂白期間的損失取決于漂白條件和所施用的粘土的類型，但已有報(bào)道在漂白步驟中生育酚去除達(dá)20-40％(k.boki,m,kubo,t.wada,andt.tamura,ibid.,69,323(1992)(k.boki、m,kubo、t.wada和t.tamura，出處同上，第69卷，第323頁，1992年))。已有報(bào)道在大豆油加工期間，漂白步驟中生育酚的損失達(dá)13％(s.ramamurthi,a.r.mccurdy,andr.t.tyler,ins.s.koseoglu,k.c.rhee,andr.f.wilson,eds.,proc.worldconf.oilseededibleoilsprocess,vol.1,aocspress,champaign,illinois,1998,pp.130–134(s.ramamurthi、a.r.mccurdy和r.t.tyler，s.s.koseoglu、k.c.rhee和r.f.wilson編輯，《世界含油種子與食用油加工會(huì)議論文集》，第1卷，美國伊利諾伊州尚佩恩aocs出版社，1998年，第130–134頁))。類胡蘿卜素可能在粘土處理和非粘土處理油的脫臭步驟中從油中移除。通常，有顏色的類胡蘿卜素的移除受到控制，以便產(chǎn)生具有在指定范圍的值內(nèi)的預(yù)定顏色的油。可以通過更改脫臭步驟而改變精制油中類胡蘿卜素和其他揮發(fā)性化合物的含量。例如，在想要油中保持較高濃度類胡蘿卜素的實(shí)施例中，脫臭步驟可以在較低溫度(例如使用200℃或更低溫度的蒸汽)進(jìn)行。在此類實(shí)施例中，特別優(yōu)選避免粘土處理步驟，由于這將導(dǎo)致精制油中較高濃度的類胡蘿卜素。進(jìn)一步酶處理在另一方面，本發(fā)明的方法還包括使用脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶、磷脂酶、蛋白酶、磷酸酶、植酸酶、木聚糖酶、淀粉酶(例如α-淀粉酶)、葡聚糖酶、聚半乳糖醛酸酶、半乳糖脂酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和其他植物細(xì)胞壁降解酶，以及混合酶制品和細(xì)胞裂解液。在可供選擇的方面，本發(fā)明的方法可以結(jié)合其他方法，例如酶促處理(如使用糖酶，包括纖維素酶、半纖維素酶和其他降解副活性)或化學(xué)方法(如己烷提取大豆油)實(shí)施。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可以結(jié)合如wo2006031699中定義的方法實(shí)施。現(xiàn)在將結(jié)合以下非限制性實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)例1鑒定和克隆葉綠素酶使用不同的方法(包括blast)搜索ncbi數(shù)據(jù)庫，將幾個(gè)序列鑒定為葉綠素酶或與葉綠素酶具有同源性的序列。所述序列的名稱、它們的起源以及ncbi數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)列于表1中。表1：具有以下登錄號(hào)和名稱的本文所用葉綠素酶。生物體數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)chl名稱擬南芥aag12547ara_chl擬南芥np_199199ara_chl2甜橙aaf59834cit_chl普通小麥bt009214tri_chl普通小麥bt008923tri_chl2甘藍(lán)aan51935bra_chl甘藍(lán)aan51933bra_chl1甘藍(lán)aan51934brass_chl2玉米acn32030zea_chl玉米acg44273zea_chl2毛竹fp092915bam_chl藜q9le89che_chl蓖麻xp_002517075cb_chl大豆baf43704glymax_chl銀杏aap44978gin_chl發(fā)財(cái)樹aco50429pac_chl2毛果楊xp_002315752pop_chl高粱xp_002459848sor_chl高粱xp_002445588sorg_chl葡萄xp_002273926vitis_chl小立碗蘚edq81786phys_chl耬斗菜aqu_chl二穗短柄草addn01001446brach_chl蒺藜苜蓿acj85964med_chl蔞葉abi96085pip_chl百脈根ak338339lotus_chl秈稻eec66959oryi_chl粳稻np_001064620oryj1_chl粳稻eee50970oryj2_chl北美云杉acn40275picea_chl衣藻xp_001695577chl_chl葉綠素酶序列從ncbi數(shù)據(jù)庫中搜索而鑒定的葉綠素酶序列在表1中列出，并且氨基酸序列在圖12至42中顯示(seqidno:1至31)。選中的葉綠素酶氨基酸序列的多重序列比對(duì)顯示分布在整個(gè)序列中的若干保守殘基。包含絲氨酸活性位點(diǎn)的基序ghsrg(seqidno:32)是高度保守的。這種比對(duì)產(chǎn)生如圖43中所示的系譜樹。在大腸桿菌中的克隆制備了編碼表1中所示葉綠素酶的合成基因。每個(gè)基因均為大腸桿菌中的表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。出于克隆的目的，基因在5'-端擴(kuò)展以包含nhei限制位點(diǎn)，并且在3'-端擴(kuò)展以包含xhoi限制位點(diǎn)。用nhei和xhoi限制酶消化后，將合成dna連接至用相同限制酶消化的大腸桿菌表達(dá)載體pet-28a(+)(novagen公司)。該載體包括用于控制插入基因表達(dá)的t7啟動(dòng)子以及l(fā)ac操縱子。葉綠素酶基因以符合可讀框方式與組氨酸標(biāo)簽和凝血酶切割位點(diǎn)融合以便純化(圖4中所示的例子)。將所得的構(gòu)建體(例子pet28-tri_chl在圖5中顯示)轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌top10細(xì)胞(英杰公司(invitrogen))，并且從轉(zhuǎn)化的菌落中分離出質(zhì)粒并進(jìn)行核苷酸測(cè)序，以便驗(yàn)證正確的序列，并且全部融合均如預(yù)期。在大腸桿菌中的表達(dá)為了表達(dá)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主大腸桿菌bl21(de3)(novagen公司)。將細(xì)胞在37℃于含有羧芐青霉素(50mg/ml)lb中培養(yǎng)，直到od600為0.6-0.8。為了誘導(dǎo)，向培養(yǎng)物加入1mmiptg，并在25℃溫育另外20-24小時(shí)，隨后通過離心收獲細(xì)胞。通過超聲處理使重組的葉綠素酶從細(xì)胞沉淀中釋出，并通過離心除去細(xì)胞殘片。在枯草芽孢桿菌中的克隆為了在枯草芽孢桿菌中克隆和表達(dá)，將編碼葉綠素酶(表1)的合成基因針對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行密碼子優(yōu)化。將基因克隆在兩種不同的質(zhì)粒中，一種用于細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，一種用于分泌到培養(yǎng)基中(細(xì)胞外表達(dá))。細(xì)胞外表達(dá)將基因在5'-端擴(kuò)展，以包含bsshii限制位點(diǎn)和用于符合可讀框地融合到apre信號(hào)序列的apre信號(hào)序列的一部分，以及編碼氨基酸agk的序列，從而有利于信號(hào)序列切除。將基因在3’-端用paci限制位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)展。將經(jīng)bsshii和paci消化的基因連接至用相同限制酶消化的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pbn中。pbn載體包含apre啟動(dòng)子和apre信號(hào)序列。葉綠素酶基因與apre信號(hào)序列的所得融合物的例子在圖6中顯示。將最終的構(gòu)建體(例子pbn-tri_chl在圖7中顯示)轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌top10細(xì)胞(英杰公司(invitrogen))，并且從轉(zhuǎn)化的菌落中分離出質(zhì)粒并進(jìn)行核苷酸測(cè)序，以便驗(yàn)證正確的序列，并且全部融合均如預(yù)期。為了表達(dá)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主枯草芽孢桿菌bg6002中。將細(xì)胞在33℃于格蘭特公司(grant)的ii號(hào)培養(yǎng)基中培養(yǎng)68小時(shí)。通過離心使細(xì)胞沉淀后，從培養(yǎng)基中分離重組的葉綠素酶。細(xì)胞內(nèi)表達(dá)將基因在5’-端擴(kuò)展，以包含spei限制位點(diǎn)，從而允許將基因直接與不具有apre信號(hào)序列的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pbn中的apre啟動(dòng)子融合。將基因在3’-端用hindiii限制位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)展。葉綠素酶基因與apre啟動(dòng)子的融合在圖8中顯示。將所得的構(gòu)建體(例子pbn-spe-tri_chl在圖9中顯示)轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌top10細(xì)胞(英杰公司(invitrogen))，并且從轉(zhuǎn)化的菌落中分離出質(zhì)粒并進(jìn)行核苷酸測(cè)序，以便驗(yàn)證正確的序列，并且全部融合均如預(yù)期。為了表達(dá)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主枯草芽孢桿菌bg6002中。將細(xì)胞在33℃于格蘭特公司(grant)的ii號(hào)培養(yǎng)基中培養(yǎng)68小時(shí)。通過用1mg/ml的溶菌酶在30℃處理1小時(shí)，從培養(yǎng)物釋出重組的葉綠素酶。通過離心除去細(xì)胞殘片，并且從上清液回收葉綠素酶。在變鉛青鏈霉菌中的克隆為了在變鉛青鏈霉菌中克隆和表達(dá)，將編碼葉綠素酶(表1)的合成基因針對(duì)變鉛青鏈霉菌進(jìn)行密碼子優(yōu)化。出于克隆的目的，將基因在5’-端擴(kuò)展，以包含nhei限制位點(diǎn)和用于與cela信號(hào)序列符合可讀框地融合的cela信號(hào)序列的一部分。擴(kuò)展3’-端以包含bamhi限制位點(diǎn)。葉綠素酶基因(tri_chl)與cela信號(hào)序列的融合在圖10中顯示。將所得的構(gòu)建體(例子pkb-tri_chl在圖11中顯示)轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌top10細(xì)胞(英杰公司(invitrogen))，并且從轉(zhuǎn)化的菌落中分離出質(zhì)粒并進(jìn)行核苷酸測(cè)序，以便驗(yàn)證正確的序列，并且全部融合均如預(yù)期。在變鉛青鏈霉菌中的表達(dá)為了表達(dá)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主變鉛青鏈霉菌菌株g3s3的原生質(zhì)體中。將細(xì)胞在30℃于補(bǔ)充硫鏈絲菌素的tsg培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)。在streptpdxn2改良培養(yǎng)基中將預(yù)培養(yǎng)物稀釋10倍，然后在30℃溫育96小時(shí)。通過離心使細(xì)胞沉淀后，從培養(yǎng)基中分離重組的葉綠素酶。實(shí)例2葉綠素酶的活性通過如上所述的基因組挖掘鑒定了多種葉綠素酶并在大腸桿菌中表達(dá)它們。針對(duì)脫鎂葉綠素酶活性，分析來自具有包含葉綠素酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌的提取物。所述分析測(cè)定可以如ep10159327.5中所述進(jìn)行。或者，脫鎂葉綠素酶活性可以通過如上文所述的方法(如基于hplc的方法)確定。表2中顯示結(jié)果。脫鎂葉綠素酶活性可以基于在反應(yīng)緩沖液中水解脫鎂葉綠素a，然后對(duì)生成的脫鎂葉綠酸a進(jìn)行熒光測(cè)定來確定。這種測(cè)定法也可能適于采用焦脫鎂葉綠素作為底物。將1u酶活性定義為在40℃每分鐘水解1μmol脫鎂葉綠素a或焦脫鎂葉綠素。表2：酶的脫鎂葉綠素酶活性酶酵素活性u(píng)/mlbam_chlcore1120,32cit_chlcore113-a0,25ara_chlcore114-a5,19cb_chlcore1270,10glymax_chlcore1330,010sor_chlcore1346,14ara_chl2core1350,94bra_chl1core1361,21sorg_chlcore137-a0,78tri_chl2core138-a0,19zea_chl2core1390,03tri_chlcore200,18brach_chlcore1561,50pip_chlcore1580,01picea_chlcore1630,05對(duì)照空載體0,000通過蛋白質(zhì)印跡分析采用兔體內(nèi)針對(duì)純化的tri_chl所產(chǎn)生的第一抗體來分析表2中所述的酶。圖44和45顯示來自表2的所有酶與產(chǎn)生的抗體反應(yīng)。實(shí)例3植物油中葉綠素衍生物的水解測(cè)試了一些酶降解油體系中葉綠素組分的能力。表3中顯示配方。在惠頓(wheaton)玻璃杯中稱量粗制油菜籽油，并伴以磁力攪拌加熱至60℃。加入水和酶。采用高剪切混合將樣品處理20秒，隨后在60℃伴以磁力攪拌進(jìn)行溫育。在0.5、2和4小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后取出樣品。將樣品離心并通過hplc-ms進(jìn)行分析。表3：用于測(cè)試油體系中葉綠素酶的配方圖46中顯示如通過hplc-ms所確定的脫鎂葉綠素a(脫鎂葉綠素a+a′)的總含量。圖47中顯示焦脫鎂葉綠素a的降解。所有5種候選酶均能夠降解脫鎂葉綠素和脫鎂葉綠素，但對(duì)焦脫鎂葉綠素的活性尤其在5種受試酶之間明顯變動(dòng)。在用葉綠素酶處理過的油樣品中，還分析脫鎂葉綠素立體異構(gòu)體a和a′的分布。令人驚訝地，取決于所施加的酶，我們發(fā)現(xiàn)這種分配的巨大差異(參見圖48)。對(duì)于bra_chl1和tri_chl，脫鎂葉綠素a的百分比降到約初始含量的一半，然而ara_chl2和cb_chl表現(xiàn)出與對(duì)照和初始含量相當(dāng)?shù)姆植肌Ｔ谡麄€(gè)反應(yīng)過程中保持立體異構(gòu)體的初始分布具有明顯的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@意味著總反應(yīng)速率不依賴于脫鎂葉綠素a′至a的差向異構(gòu)化。這些發(fā)現(xiàn)還表明ara_chl2和cb_chl對(duì)c-132處的基團(tuán)不是十分敏感。這兩種酶還顯示對(duì)c-132處具備2個(gè)氫原子的焦脫鎂葉綠素具有好得多的活性(參見圖47)。體外測(cè)定中的底物特異性在體外測(cè)定系統(tǒng)中測(cè)量了上述酶對(duì)脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠素的相對(duì)活性，例如如ep10159327.5中所述。表4給出脫鎂葉綠素活性相對(duì)于焦脫鎂葉綠素活性的比率。表4：脫鎂葉綠素活性相對(duì)于焦脫鎂葉綠素活性的比率酶脫鎂葉綠素相對(duì)于焦脫鎂葉綠素的活性比率sorg_chl173ara_chl24cb_chl4tri_chl45顯然，與tri_chl相比，sorg_chl對(duì)焦脫鎂葉綠素具有相對(duì)較低的活性。cb_chl和ara2_chl顯示不同的底物特異性，該特異性朝著焦脫鎂葉綠素大為改善。這些發(fā)現(xiàn)與圖46至48中所示的內(nèi)容相互關(guān)聯(lián)。實(shí)例4葉綠素酶對(duì)脫鎂葉綠素a和a’的相對(duì)活性根據(jù)表5中的配方測(cè)試粗制油菜籽油中葉綠素酶的劑量反應(yīng)。表5在1/2、2和4小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后取出樣品，并通過hplc-ms進(jìn)行分析。為了比較不同葉綠素酶對(duì)兩種異構(gòu)體的活性，在底物濃度為初始濃度的一半時(shí)計(jì)算對(duì)兩種異構(gòu)體的酶活性。將底物濃度的自然對(duì)數(shù)隨酶劑量(u/g)的變化繪成圖，如圖51中針對(duì)擬南芥葉綠素酶(ara_chl2)所示。根據(jù)圖51中的曲線圖，在底物濃度為初始濃度的一半時(shí)計(jì)算酶對(duì)脫鎂葉綠素a和a’的活性，如表6中所示。表6：計(jì)算ara-chl2對(duì)脫鎂葉綠素a和脫鎂葉綠素a’的活性根據(jù)在初始底物濃度的一半處的酶活性，可以在相同的條件下比較不同的酶。在表7中，比較來自兩種不同的葉綠素酶的結(jié)果。表7：葉綠素酶對(duì)粗制菜籽油中的脫鎂葉綠素a和a’異構(gòu)體的活性脫鎂葉綠素_a’脫鎂葉綠素_a相對(duì)活性酶μg/u/hμg/u/ha'/aara_chl2,core1355746050,95cb_chl,core127-a1413430,41表7的結(jié)果表明，ara_chl2對(duì)脫鎂葉綠素a和a’異構(gòu)體具有幾乎相同的活性。這與以下觀察到一致：在用ara_chl2進(jìn)行酶促降解期間兩種異構(gòu)體之間的比率不變(參見圖48)。相比之下，cb_chl也顯示對(duì)脫鎂葉綠素a’的顯著水解活性。以對(duì)脫鎂葉綠素a較之對(duì)脫鎂葉綠素a'的活性的比率表示(即表7中所示的倒數(shù))，ara_chl2具有1.05的活性比率，并且cb_chl具有2.44的活性比率。結(jié)論本發(fā)明鑒定了31種葉綠素酶序列，此外將它們?cè)诖竽c桿菌、枯草芽孢桿菌或變鉛青鏈霉菌中克隆和表達(dá)。根據(jù)大腸桿菌中的表達(dá)，在接近一半的經(jīng)鑒定的葉綠素酶中檢測(cè)到脫鎂葉綠素酶活性(表2)，并且所有這些葉綠素酶均與針對(duì)tri_chl所產(chǎn)生的抗體反應(yīng)(圖44和45)。在不具有可檢測(cè)的脫鎂葉綠素酶活性的蛋白質(zhì)提取物中，不能基于使用以針對(duì)tri_chl所產(chǎn)生的抗體的蛋白質(zhì)印跡來檢測(cè)任何表達(dá)的葉綠素酶。當(dāng)測(cè)試油應(yīng)用中的候選葉綠素酶時(shí)，發(fā)現(xiàn)主要存在對(duì)于脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠素底物的特異性的差異。與其他測(cè)試的候選酶相比，ara_chl2和cb_chl對(duì)焦脫鎂葉綠素顯示好得多的活性(圖47)。對(duì)于這兩種候選酶，還觀察到在油試驗(yàn)中溫育期間脫鎂葉綠素a相對(duì)a′的比率未顯著改變。對(duì)于其他待測(cè)試的候選酶，觀察到該比率在溫育期間明顯下降。在使用脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠素作為底物的體外測(cè)定中，還測(cè)量到在油測(cè)定中ara_chl2和cb_chl朝著焦脫鎂葉綠素的改善活性(表4)。hplc分析在本文的實(shí)例中，葉綠素衍生物通常可以根據(jù)以下方法通過hplc分析進(jìn)行定量。使用通常根據(jù)“determinationofchlorophyllsandcarotenoidsbyhigh-performanceliquidchromatographyduringolivelacticfermentation”,journalofchromatography,585,1991,259-266(“在橄欖乳酸發(fā)酵期間通過高效液相色譜測(cè)定葉綠素和類胡蘿卜素”，《色譜雜志》，第585卷，1991年，第259-266頁)中描述的方法進(jìn)行hplc分析。通過連接到二極管陣列檢測(cè)器的hplc對(duì)脫鎂葉綠素、脫鎂葉綠酸、焦脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠酸進(jìn)行測(cè)定。該方法采用的色譜柱填充有c18材料，葉綠素通過梯度洗脫分離。使用得自西格瑪奧德里奇公司(sigmaaldrich)的葉綠素a和b標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)峰進(jìn)行歸屬，例如根據(jù)圖49中顯示的代表性hplc色譜圖(摘自journalofchromatography,585,1991,259-266(《色譜雜志》，第585卷，1991年，第259-266頁))。上面說明書中提及的所有出版物均以引用的方式并入本文。在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，所述的本發(fā)明方法和系統(tǒng)的各種修改形式和變型形式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見。盡管本發(fā)明已結(jié)合特定的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行了說明，但應(yīng)該理解受權(quán)利要求書保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)該不當(dāng)?shù)厥芟抻谶@些特定的實(shí)施例。實(shí)際上，對(duì)生物化學(xué)和生物技術(shù)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員明顯的用于執(zhí)行本發(fā)明的所述模式的多種修改旨在處于如下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。序列表<110>丹尼斯克公司<120>加工方法<130>p042731wo<150>us61/445665<151>2011-02-23<160>41<170>patentinversion3.5<210>1<211>324<212>prt<213>擬南芥(arabidopsisthaliana)<400>1metalaalailegluaspserprothrpheserservalvalthrpro151015alaalaphegluileglyserleuprothrthrgluileprovalasp202530provalgluasnaspserthralaproprolysprovalargilethr354045cysprothrvalalaglythrtyrprovalvalleuphephehisgly505560phetyrleuargasntyrphetyrseraspvalleuasnhisileala65707580serhisglytyrileleuvalalaproglnleucyslysleuleupro859095proglyglyglnvalgluvalaspaspalaglyservalileasntrp100105110alasergluasnleulysalahisleuprothrservalasnalaasn115120125glylystyrthrserleuvalglyhisserargglyglylysthrala130135140phealavalalaleuglyhisalaalathrleuaspproserilethr145150155160pheseralaleuileglyileaspprovalalaglythrasnlystyr165170175ileargthraspprohisileleuthrtyrlysprogluserpheglu180185190leuaspileprovalalavalvalglythrglyleuglyprolystrp195200205asnasnvalmetproprocysalaprothraspleuasnhisgluglu210215220phetyrlysglucyslysalathrlysalahisphevalalaalaasp225230235240tyrglyhismetaspmetleuaspaspaspleuproglyphevalgly245250255phemetalaglycysmetcyslysasnglyglnarglyslysserglu260265270metargserphevalglyglyilevalvalalapheleulystyrser275280285leutrpglyglulysalagluileargleuilevallysaspproser290295300valserproalalysleuaspproserprogluleugluglualaser305310315320glyilepheval<210>2<211>318<212>prt<213>擬南芥<400>2metserserserserserargasnalaphegluaspglylystyrlys151015serasnleuleuthrleuaspserserserargcyscyslysilethr202530proserserargalaserproserproprolysglnleuleuvalala354045thrprovalglugluglyasptyrprovalvalmetleuleuhisgly505560tyrleuleutyrasnserphetyrserglnleumetleuhisvalser65707580serhisglypheileleuilealaproglnleutyrserilealagly859095proaspthrmetaspgluilelysserthralagluilemetasptrp100105110leuservalglyleuasnhispheleuproalaglnvalthrproasn115120125leuserlysphealaleuserglyhisserargglyglylysthrala130135140phealavalalaleulyslyspheglytyrserserasnleulysile145150155160serthrleuileglyileaspprovalaspglythrglylysglylys165170175glnthrproproprovalleualatyrleuproasnserpheaspleu180185190asplysthrproileleuvalileglyserglyleuglygluthrala195200205argasnproleupheproprocysalaproproglyvalasnhisarg210215220gluphepheargglucysglnglyproalatrphisphevalalalys225230235240asptyrglyhisleuaspmetleuaspaspaspthrlysglyilearg245250255glylyssersertyrcysleucyslysasnglyglugluargargpro260265270metargargphevalglyglyleuvalvalserpheleulysalatyr275280285leugluglyaspasparggluleuvallysilelysaspglycyshis290295300gluaspvalprovalgluileglngluphegluvalilemet305310315<210>3<211>329<212>prt<213>甜橙(citrussinensis)<400>3metalaalametvalaspalalysproalaalaservalglnglythr151015proleuleualathralathrleuprovalphethrargglyiletyr202530serthrlysargilethrleugluthrserserproserserpropro354045proprolysproleuileilevalthrproalaglylysglythrphe505560asnvalileleupheleuhisglythrserleuserasnlyssertyr65707580serlysilepheasphisilealaserhisglypheilevalvalala859095proglnleutyrthrserileproproproseralathrasngluleu100105110asnseralaalagluvalalaglutrpleuproglnglyleuglngln115120125asnleuprogluasnthrglualaasnvalserleuvalalavalmet130135140glyhisserargglyglyglnthralaphealaleuserleuargtyr145150155160glypheglyalavalileglyleuaspprovalalaglythrserlys165170175thrthrglyleuaspproserileleuserpheaspserpheaspphe180185190serileprovalthrvalileglythrglyleuglyglyvalalaarg195200205cysilethralacysalaprogluglyalaasnhisglugluphephe210215220asnargcyslysasnserserargalahisphevalalathrasptyr225230235240glyhismetaspileleuaspaspasnproseraspvallyssertrp245250255alaleuserlystyrphecyslysasnglyasngluserargasppro260265270metargargcysvalserglyilevalvalalapheleulysaspphe275280285phetyrglyaspalagluasppheargglnileleulysaspproser290295300phealaproilelysleuaspservalglutyrileaspalaserser305310315320metleuthrthrthrhisvallysval325<210>4<211>319<212>prt<213>小麥(triticumaestivum)<400>4metalaalaalaalaproalagluthrmetasnlysseralaalagly151015alagluvalproglualaphethrservalpheglnproglylysleu202530alavalglualaileglnvalaspgluasnalaalaprothrpropro354045ileprovalleuilevalalaprolysaspalaglythrtyrproval505560alametleuleuhisglyphepheleuhisasnhisphetyrgluhis65707580leuleuarghisvalalaserhisglypheileilevalalaprogln859095pheserileserileileproserglyaspalagluaspilealaala100105110alaalalysvalalaasptrpleuproaspglyleuproservalleu115120125prolysglyvalgluprogluleuserlysleualaleualaglyhis130135140serargglyglyhisthralapheserleualaleuglyhisalalys145150155160thrglnleuthrpheseralaleuileglyleuaspprovalalagly165170175thrglylysserserglnleuglnprolysileleuthrtyrglupro180185190serserpheglymetalametprovalleuvalileglythrglyleu195200205glygluglulyslysasnilephepheproprocysalaprolysasp210215220valasnhisalagluphetyrargglucysargproprocystyrtyr225230235240phevalthrlysasptyrglyhisleuaspmetleuaspaspaspala245250255prolyspheilethrcysvalcyslysaspglyasnglycyslysgly260265270lysmetargargcysvalalaglyilemetvalalapheleuasnala275280285alaleuglyglulysaspalaaspleuglualaileleuargasppro290295300alavalalaprothrthrleuaspprovalgluhisargvalala305310315<210>5<211>323<212>prt<213>小麥<400>5metalaalametalathrthrvalpheglnalaglyprometgluval151015aspvallyshisvalasplyssermetileproasnleualaargpro202530leumetvalvalalaprolysgluthrglyalatyrprovalileval354045phe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