專利名稱：一種定量檢測mpl基因w515位點突變的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域的熒光定量PCR技術，具體涉及一種定量檢測MPL基因W515位點突變的試劑盒。
背景技術：
骨髓增殖性疾病(myeloproliferative diseases, MPD)是骨髓組織持續異常增殖之后，造成紅細胞和血小板過多，以及骨髓纖維化問題的疾病。根據2008年WHO (WorldHealthOrganization,世界衛生組織)的修訂，將骨髓增殖性疾病改為骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative, MPN)。MPN 中包括真性紅細胞增多癥(Polycythemia Vera, PV),原發性血小板增多癥(Essential Thrombocytosis, ET)和原發性骨髓纖維化(primarymyelofibrosis, PMF)，它們均是血細胞過度增殖的疾病，如若不及時治療，最終會發展成為急性粒細胞性白血病。因此,早期快速診斷對病人疾病的發生發展起關鍵性作用。2008年WHO修訂MPN診斷標準的依據是多數患者都具有JAK2基因突變，主要是JAK2基因V617F和JAK2基因外顯子12突變。研究表明JAK2基因V617F是診斷為PV的敏感指標，也見于50%的ET和PMF中。但是不能排除JAK2基因V617F陰性卻患有MPN的可能性。隨后在JAK2V617F陰性的MPN患者中發現促血小板生成素受體MPL基因突變，包括MPL基因W515L位點突變和W515K位點突變。該基因是骨髓增殖性白血病病毒同源性致癌基因，屬于促紅細胞生成素超級家族，可促使促血小板生成素配體(Thromboietin，ΤΡ0)全身造血和巨核細胞生長與分化，此基因位于染色體lq34并包含12個外顯子。2006年，人體MPL基因W515L位點突變是在JAK2基因V617F陰性的PMF中被發現，突變位于第10外顯子中，在1544號核苷酸處G轉變成T，致使橫跨膜區域515密碼子有色氨酸轉變成亮氨酸。此后，又發現在1543與1544處核苷酸由TG轉變為AA即MPL基因W515K位點突變。盡管之后又在第10外顯子中發現其它突變，但是只有MPL基因W515位點的突變會誘導模仿JAK2基因V617F的功能，發展成MPN。MPL基因W515L位點和MPL基因W515K位點的功能獲得性突變率在PMF和ET中分別為10%和3%，而在PV中從未出現。因此，MPL基因W515L突變和W515K位點突變主要用于診斷PMF和ET。在JAK2基因V617F陰性的患者中，檢測MPL基因W515L突變和W515K位點突變有助于MPN的診斷。使用等位基因特異性熒光定量PCR(Polymerase ChainReaction,聚合酶鏈式反應)檢測技術，其敏感性顯著高于直接測序。實時熒光定量PCR技術實現了PCR從定性到真正意義的定量的飛躍，為人類疾病基因的定量檢測提供了一個行之有效的檢測工具，與普通PCR相比具有特異性增強、靈敏度提高和檢測快速、降低了污染等特點，但目前尚未有實時熒光定量PCR方法檢測MPL基因W515位點突變試劑盒的相關報道。

發明內容
為了解決現有技術的問題，本發明實施例提供了一種檢測MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點突變的試劑盒。所述技術方案如下CN 102925559 A
書
明
說
2/9頁本發明實施例提供了一種檢測MPL基因W515位點突變的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括MPL基因W515L位點突變特異性引物和MPL基因W515K位點突變特異性引物中的至少一種和內參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中MPL基因W515L位點突變特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；·
MPL基因W515L位點突變特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示；MPL基因W515L位點突變特異性Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 3所示；MPL基因W515K位點突變特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；MPL基因W515K位點突變特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所示；MPL基因W515K位點突變特異性Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID N0:6所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 7所不；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示；ABL基因Taqman滅光探針如序列表中SEQ ID NO:9所不；進一步地，所述試劑盒還包括內部陽性控制序列、內部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示；內部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO: 11所示；內部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ IDNO: 12所示；內部陽性控制序列的Taqman突光探針如序列表中SEQ IDNO: 13所示。進一步地，所述MPL基因W515L位點突變特異性Taqman熒光探針、MPL基因W515K位點突變特異性Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團TAMRA ;所述內部陽性控制序列Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團TET，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA。具體地，所述內參基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示。具體地，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點突變的基因組DNA樣品。具體地，所述熒光定量PCR的混合液(以反應體系終濃度表示)為1X的PCR預混合液(原液為 2 XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、。· 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、O. 2U/ μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶以及無RNase去離子水。本發明試劑盒的優點和效果如下(I)敏感性高可重復敏感度為O. 01%，即10000個細胞中有一個含MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點突變就可以被檢測出。(2)特異性強使用特異性探針對定量分子進行識別，準確性高。同時，靶序列由弓I物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。(3)簡便安全操作簡單、安全、自動化程度高而且防止污染。擴增和檢測可以在同一管內檢測，不需要開蓋，不易被污染；同時擴增和檢測一步完成，不需要后期處理，無需要擔心放射性污染。(4)全程監控本發明實施例提供的試劑盒引入了內部陽性控制質量控制體系，對檢測過程進行全程質量監控，有效避免假陽性或者假陰性。(5)快速速度快、高通量，可在3-4小時完成。本發明的試劑盒能快速、準確、定量檢測MPL基因W515L位點突變和MPL基因
4W515K位點突變水平，有效杜絕了假陽性和假陰性的發生，用于骨髓增殖性腫瘤的診斷及治療過程中微小殘留病的監測，為骨髓增殖性腫瘤的診斷、制定治療方案及療效評價和預后提供了重要的檢測手段。


為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使·用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖I是本發明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增MPL基因W515L位點突變陽性的骨髓增殖性腫瘤患者的熒光曲線圖，及ABL標準品擴增的熒光曲線圖和內部陽性控制序列標準品擴增的熒光曲線圖；圖2是本發明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增MPL基因W515K位點突變陽性的骨髓增殖性腫瘤患者的熒光曲線圖，及ABL標準品擴增的熒光曲線圖和內部陽性控制序列標準品擴增的熒光曲線圖。圖中1-MPL基因W515L位點突變擴增曲線、2-ABL標準品擴增曲線、3-內部陽性控制品擴增曲線、4-MPL基因W515K位點突變擴增曲線。
具體實施例方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面結合附圖對本發明實施方式作進一步地詳細描述。實施例I.試劑盒的制備I、特異性的引物和熒光探針的設計根據基因序列(ABL基因序列和MPL基因序列來源于美國國家生物技術信息中心核酸數據庫，其中ABL基因ID分別為25，參考序列號為NM_005157.4;MPL基因ID分別為4352，參考序列號為NG_007525. I)分別設計對上述各基因序列特異的引物和熒光探針。2、按照下列試劑盒的組成配制試劑盒的各組分本發明試劑盒組成如下①基因組DNA提取試劑采用組織基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司，貨號69504)快速提取O. 5ml骨髓增殖性腫瘤患者骨髓組織基因組DNA。②引物、探針和標準品包括MPL基因W515L位點突變特異性引物、MPL基因W515K位點突變特異性引物、內部陽性控制序列序列、內部陽性控制序列弓I物和內參基因ABL引物，以及與引物對應的Taqman熒光探針，具體如下 MPL 基因 W515L 位點突變特異性上游引物5 ’ -GAAGTCTGACCCTTTTTGTCTCCTA-3，(序列表中序列I);MPL基因W515L位點突變特異性下游引物5’ -CTGGTCCACCGCCAGTCT-3’(序列表中序列2)；MPL 基因 W515L 位點突變特異性 Taqman 熒光探針FAM5，-CTGCTGAGGTTGC-3，TAMRA(序列表中序列3)；
5
MPL 基因 W515K 位點突變特異性上游引物5 ’ -TTTTTGTCTCCTAGCCTGGATCTC-3，(序列表中序列4)；MPL 基因 W515K 位點突變特異性下游引物5 ’ -GTCACAGAGCGAACCAAGAATG-3 ’(序列表中序列5)；MPL基因W515K位點突變特異性Taqman熒光探針FAM5’ -CTGCTGAGGAAGCA-3’ TAMRA (序列表中序列 6)；內部陽性控制序列序列為5’-GAAGTCTGACCCTTTTTGTCTCCATGCCTGGATCTCCTTGGTGACCGCTCTGCATCTAGTGCTGGGCCTCAGCGCCGTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGGTGGCAGTTTCCTGCACACTACAGGTACCGCCCCCGCCAGGCAGGACAGTGGCGGTGGACCAG-3’(序列表中序列 10)；內部陽性控制序列上游引物序列為5’-GAAGTCTGACCCTTTTTGTCTCCAT-3’(序列表中序列11);內部陽性控制序列下游引物序列為5’ -CTGGTCCACCGCCACTGT-3’(序列表中序列12)；內部陽性控制序列Taqman熒光探針TET5’ -CTGCTGAGGTGGCA-3’ TAMRA (序列表中序列13)；ABL 基因序列為5’ -CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’(序列表中序列14)；ABL基因上游引物序列為5，-CCGGGTCTTAGGCTAATCACA-3，(序列表中序列7)；ABL基因下游引物序列為5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列8)；ABL 基因 Taqman 熒光探針FAM5’ -TGGTGTGAAGCCC-3 ’ TAMRA (序列表中序列 9)；其中，內部陽性控制序列為人工合成序列，包含MPL基因W515K/L突變位點的的基因序列和一部分人工合成序列；內部陽性控制序列和ABL基因序列分別用作標準品。上述引物序列、控制序列、基因序列和Taqman熒光探針序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。③陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點突變的基因組DNA樣品為陽性對照，采用上述實施例I中提供的本發明試劑盒組成①基因組DNA提取試劑，快速提取已經確診的含有MPL基因W515L位點突變的骨髓增殖性腫瘤患者的O. 5ml骨髓組織DNA，作為陽性對照。④MPL基因W515L位點突變熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測MPL基因W515L位點突變特異性的引物、探針組成1X的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號:210212, 2XPCRPremix)、2. 5-4. OmM 的Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs和O. 3-0. 6mM 的 dUTP、O. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 MPL 基因 W515L 位點突變特異性上、下游引物(序列表中序列1、2) O. 3pmol/uL的MPL基因W515L位點突變特異性探針(序列表中序列3)、0. 25pmol/yL的內部陽性控制序列上游引物(序列表中序列11)、
O.25pmol/yL的內部陽性控制序列下游引物(序列表中序列12)、0. 3pmol/yL的內部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列13)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被測樣品DNA和內部陽性控制序列DNA)，其余為無RNase去離子水，反應總體積通常為20 μ L0⑤MPL基因W515K位點突變熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測MPL基因W515L位點突變特異性的引物、探針組成1Χ的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號:210212,2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6m·M 的dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 MPL 基因 W515K 位點突變特異性上、下游引物(序列表中序列4、5) O. 3pmol/uL的MPL基因W515K位點突變特異性探針(序列表中序列6)、0. 25pmol/yL的內部陽性控制序列上游引物(序列表中序列11)、0· 25pmol/yL的內部陽性控制序列下游引物(序列表中序列12)、0· 3pmol/yL的內部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列13)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被測樣品DNA和內部陽性控制序列DNA)，其余為無RNase去離子水,反應總體積通常為20 μ L。⑥ABL內參基因熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測ABL內參基因的引物、探針組成=IX的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號210212, 2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/y L的ABL內參基因上游引物(序列表中序列7)、
0.25pmol/ μ L的ABL內參基因下游引物(序列表中序列8)、0· 3pmol/ μ L的ABL基因Taqman熒光探針(序列表中序列9)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。檢測時，加入ABL基因標準品模板2 μ L,反應總體積通常為20 μ L。⑦內部陽性控制序列熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測內部陽性控制序列的引物、探針組成ix的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號=210212,2 XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/yL的內部陽性控制序列上游引物(序列表中序列11)、0· 25pmol/yL的內部陽性控制序列下游引物(序列表中序列12)、0· 3pmol/yL的內部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列13)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。檢測時，通常取1-2 μ L的模板(內部陽性控制序列DNA)，其余為無RNase去離子水，反應總體積通常為20 μ L03、PCR擴增程序的設定在Iightcycler儀器上先經過50°C 10s, 95°C IOmin,然后再經過95°C 15s，60°C lmin，共40個循環。實施例2.用實施例I制備的試劑盒檢測MPL基因W515位點突變的以檢測30例骨髓增殖性腫瘤患者骨髓組織標本結果為例。用本發明的試劑盒檢測MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點突變的檢測流程為首先根據基因序列設計特異性的引物和熒光探針。其次獲取臨床骨髓增殖性腫瘤患者骨髓組織樣本，快速提取組織DNA;先配制ABL內參基因和內部陽性控制序列的熒光定量PCR反應液，將內部陽性控制序列標準品和ABL標準品分別稀釋至拷貝數/mL為
1.OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分別制作內部陽性控制序列標準品標準曲線和ABL標準品標準曲線，然后再配制MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點突變的熒光定量PCR反應液，進行熒光定量PCR檢測樣品，在熒光定量PCR儀數據分析系統中讀出CT值結果。PCR擴增結束后，首先分析內部陽性控制序列擴增結果，如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，提示檢測失敗，則需要重新進行檢測，如果其Ct值位于33 35之間，需要重復檢測。當內部陽性控制序列Ct值小于33時，將實時熒光定量PCR所得數據進行計算，分別計算MPL W515L基因突變(如圖I所示)、MPL W515K基因突變(如圖2所示)及ABL基因的Ct值，兩者之差即為ACt值。最后，熒光定量PCR結果采用軟件 分析，并標化計算樣本數據。具體步驟如下①骨髓增殖性腫瘤患者骨髓組織基因組DNA的抽提按DNA抽提純化的方法抽提骨髓增殖性腫瘤患者骨髓組織基因組DNA。②將上述提取的骨髓增殖性腫瘤患者骨髓組織基因組DNA經瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計測定260nm與280nm光密度值計算DNA的純度與濃度，用無菌去離子水調節抽提的DNA至相同濃度，置冰箱_20°C保存。③將內部陽性控制序列標準品和ABL標準品分別稀釋至拷貝數/mL為I. OxlO3、
I.OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用實施例I提供的內部陽性控制序列和ABL內參基因的熒光定量PCR反應液,分別制作內部陽性控制序列標準品標準曲線(如圖I所示)和ABL標準品標準曲線(如圖2所示)。④MPL基因W515L位點突變熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20 μ L :含I XPCR預混合液(Qiagen 公司，產品貨號210212, 2XPCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、O. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG酶，MPL基因W515L位點突變特異性上、下游引物終濃度均為O. 2 μ mol/L, MPL基因W515L位點突變特異性Taqman熒光探針終濃度0. 3 μ mol/L,被提取的骨髓增殖性腫瘤患者骨髓組織基因組DNA2. O μ L，同時加入內部陽性控制序列上、下游引物的終濃度均為0. 2 μ mol/L，內部陽性控制序列Taqman熒光探針濃度0. 3 μ mol/L,終濃度為0. 2 μ mol/L的內部陽性控制序列，加入超純水至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應擴增條件950C IOmin預變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴增40個循環，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。⑤MPL基因W515K位點突變熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20 μ L :含I XPCR預混合液(Qiagen 公司，產品貨號210212, 2XPCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、
0.2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG酶，MPL基因W515K位點突變特異性上、下游引物終濃度均為0. 2 μ mol/L, MPL基因W515K位點突變特異性Taqman熒光探針終濃度0. 3 μ mol/L，被提取的骨髓增殖性腫瘤患者骨髓組織基因組DNA2. 0μ L，同時加入內部陽性控制序列上、下游引物的終濃度均為0. 2 μ mol/L，內部陽性控制序列Taqman熒光探針濃度0. 3 μ mol/L,終濃度為0. 2 μ mol/L的內部陽性控制序列，加入超純水至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應擴增條件950C IOmin預變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴增40個循環，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。⑥ABL內參基因熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，產品貨號:210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，ABL 基因引CN 102925559 A
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明
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物終濃度O. 2 μ mol/L,探針終濃度O. 2 μ mol/L, ABL基因DNA1. OyL,加入無RNase去離子水補至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應擴增條件為95°C IOmin預變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴增40個循環，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。⑦陽性對照、陰性對照熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，產品貨號:210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，MPL 基因W515K位點突變特異性和MPL基因W515L位點突變特異性的引物終濃度均為O. 2 μ mol/L，MPL基因W515K位點突變特異性和MPL基因W515L位點突變特異性的Taqman熒光探針終濃度均為O. 3 μ mol/L,陽性對照的DNA1. OyL或者陰性對照去離子水I. O μ L，加入無RNase去離子水補至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應擴增條件為950C IOmin預變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴增40個循環，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。⑧數據收集處理和分析PCR擴增結束后，首先分析內部陽性控制序列擴增結果，如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，則需要重新進行檢測。當內部陽性控制序列Ct值小于33時，將實時熒光定量PCR所得數據進行計算，得出MPL基因W515L位點突變(如圖I所示)和MPL基因W515K位點突變(如圖2所示)相對于ABL內參基因的相對表達量后再進行統計分析，以比值大于或等于O. 0001為陽性表達，小于O. 0001為陰性表達(具體參見表I):表I為熒光定量PCR分析基因MPL基因W515位點突變在骨髓增殖性腫瘤中的表達
權利要求
1.一種檢測MPL基因W515位點突變的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、熒光定量 PCR混合液、陰性對照和陽性對照，其特征在于，所述檢測用引物、熒光探針包括MPL基因 W515L位點突變特異性引物和MPL基因W515K位點突變特異性引物中的至少一種和內參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中MPL基因W515L位點突變特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；MPL基因W515L位點突變特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；MPL基因W515L位點突變特異性Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 3所示；MPL基因W515K位點突變特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；MPL基因W515K位點突變特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所示；MPL基因W515K位點突變特異性Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 7所不；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所不；ABL基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:9所示。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內部陽性控制序列、 內部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內部陽性控制序列如序列表中SEQ IDN0:10所示；內部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO: 11所示；內部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID NO: 12所示；內部陽性控制序列的Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 13所示。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述MPL基因W515L位點突變特異性 Taqman熒光探針、MPL基因W515K位點突變特異性的Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman 熒光探針的5’端連接有熒光報告基團FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團TAMRA ;所述內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團TET，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA。
4.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述內參基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 14 所示。
5.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點突變的基因組DNA樣品。
6.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR的混合液為1X的 PCR 預混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs,O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和無RNase去離子水。
全文摘要
本發明涉及一種檢測MPL基因W515位點突變含量的試劑盒，屬于生物技術領域。所述試劑盒包含MPL基因W515L位點突變特異性體系和MPL基因W515K位點突變特異性體系中至少一種體系及內參基因ABL體系，所述體系均包括上游引物、下游引物和Taqman熒光探針。研究表明MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點功能獲得性突變率在PMF和ET中分別為10%和3%，而在PV中從未出現。因此，MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點突變主要用于診斷PMF和ET。采用敏感性及特異性均較高的熒光定量PCR檢測MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點突變，其檢測結果的特異性和敏感度均顯著提高。本發明試劑盒為預測骨髓增殖性疾病的診斷提供了一種全新的快速簡便的基因診斷技術。
文檔編號C12Q1/68GK102925559SQ20121037490
公開日2013年2月13日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者童永清, 李艷 申請人:童永清, 李艷