專利名稱：充質干細胞及其提取方法在制備銀屑病的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及充質干細胞在制備免疫調節(jié)功能藥物中的應用，特別是皮膚間充質干細胞(skin-derived Mesenchymal Stem Cells)在制備治療銀屑病的藥物中的應用。
背景技術：
銀屑病(psoriasis)是一種常見的免疫相關性、復發(fā)性的皮膚慢性炎癥，其特征是真皮內濃密的以T細胞、DC、自然殺傷T細胞和巨噬細胞為主的炎性細胞浸潤。銀屑病患者皮膚的表皮過度增生且無法正常分化，使其表皮顯著增厚、結痂增多(Nestle et al.，2009)。銀屑病的確切發(fā)病原因還不清楚，環(huán)境因子(諸如感染、外傷、壓力等)和遺傳因子等綜合因素決定了個體的易感性。銀屑病目前尚無根治的藥物(Nestle et al.，2009)，早期治療多使用類固醇等非生物性的免疫抑制劑，此類非專一性免疫抑制劑具有相當程度的副作用。近年來，生物制劑如腫瘤壞死因子制劑Etanercept (依那西普)等也被用于銀屑病治療，此類藥物多為人源化抗體，用于阻隔銀屑病相關炎癥細胞因子與受體間的作用。由于許多炎癥細胞因子在機體正常免疫反應中不可缺少，沒有選擇性地阻擋炎癥細胞因子亦會導致用藥后的副作用，停藥后疾病容易反彈。此外，抗體類藥物生產成本高、價格昂貴、普通病人很難能承受。我國從1984年以來我國約有超過400萬患者被診斷為銀屑病，自主研究開發(fā)我國有知識產權的治療銀屑病的新藥物勢在必行。充質干細胞(mesenchymal stem cell)是一種未分化、能自我增生、且能分化成多種間充質組織細胞的多能性細胞(Nestle et al.，2009)。早期，間充質干細胞多從骨髓中取得，骨髓間充質干細胞具有抑制免疫應答和誘導外周免疫耐受的特質(Nestle et al.，2009)，曾被應用于抑制骨髓移植時所導致的移植體對宿主排斥反應(graft-versus-hostdisease, GVHD) (Nestle et al.，2009)。除了骨髓以外，間充質干細胞也存在于其他成體組織中。不同于骨髓間充質干細胞，在皮膚真皮層中的間充質干細胞，除了能分化成中胚層(mesodermal)相關組織細胞(如脂肪細胞、平滑肌細胞)，還具有分化成神經細胞、造血細胞、肝細胞等多種非中胚層組織細胞的特性，因此在臨床上有極大的應用價值(Nestle etal., 2009)。由于大量的皮膚樣本較骨髓易于取得，從皮膚樣本提取治療用間充質干細胞實屬可行性高、用途廣、侵入性小、且具經濟效益的選擇。然而，皮膚間充質干細胞的免疫調節(jié)功能目前尚未被發(fā)現，本發(fā)明將就此問題進行研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種充質干細胞在制備具有免疫調節(jié)功能的藥物中的應用，以及相關充質干細胞的提取方法:
充質干細胞在制備治療具有免疫調節(jié)功能的藥物中的應用。充質干細胞在制備治療銀屑病的藥物中的應用。
所述的充質干細胞在制備治療具有免疫調節(jié)功能的藥物中的應用，其中所述的充質干細胞來源于皮膚真皮層中。所述的充質干細胞在制備治療銀屑病的藥物中的應用，其中所述的充質干細胞來源于皮膚真皮層中。所述的應用中所述的充質干細胞通過下列方法提取:剪取背部皮膚置于dispase酶中，消化過夜后清洗，剝去表皮，將真皮置于膠原酶中消化，消化完成后再添加DNase I消化，用PBS洗一遍，用滴管吹打成單細胞懸液，過濾后接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)后，棄去懸浮細胞，將貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，待長滿瓶底大部分后，胰酶消化，常規(guī)傳代。
本發(fā)明的有益效果是:充質干細胞在炎癥環(huán)境中有選擇地抑制致病性效應T細胞應答并誘導調節(jié)性T細胞發(fā)生而達到治療效果。從小鼠皮膚真皮中分離得到真皮間充質干細胞:取新生小鼠，處死后剪取背部皮膚置于dispase酶中，消化過夜后清洗，剝去表皮，將真皮置于膠原酶中消化，消化完成后再添加DNase I消化,用PBS洗一遍,用滴管吹打成單細胞懸液，過濾后接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)后，棄去懸浮細胞，將貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，待長滿瓶底大部分后，胰酶消化，常規(guī)傳代，取傳至第三代的細胞進行研究。對其進行鑒定，將體外培養(yǎng)的真皮間充質干細胞胰酶消化后接種于不同的分化誘導體系中，培養(yǎng)后經行組織染色，鑒定分化情況。向成骨細胞分化通過茜素紅染色；向脂肪細胞分化通過形態(tài)學觀察和油紅染色。觀察到從小鼠皮膚真皮中分離的皮膚間充質干細胞具有免疫調節(jié)的特性，在體外培養(yǎng)時異體皮膚真皮間充質干細胞(Allogeneic Skin-derived Mesenchymal Stem Cells)和同體皮膚真皮間充質干細胞(Autologous Skin-derived Mesenchymal Stem Cells)均能有效抑制效應T細胞免疫應答。在測試皮膚間充質干細胞對銀屑病的治療效果實驗中發(fā)現，異體和同體皮膚間充質干細胞尾靜脈注入患有“銀屑病”的小鼠體內21天后，顯著地改善小鼠的“銀屑病”癥狀。本發(fā)明公開的皮膚間充質干細胞容易取得、不具有免疫排斥性、能夠特異抑制致病性效應 T細胞應答、療效高、副作用小。


圖1:小鼠真皮間充質干細胞的分離鑒定:
A.體外培養(yǎng)的真皮間充質干細胞；
B.真皮間充質干細胞的成骨誘導分化；
C.真皮間充質干細胞的成脂誘導分化。_
圖2:小鼠的異體皮膚間充質干細胞和同體皮膚間充質干細胞抑制效應T細胞免疫應
答:
A.同體骨髓間充質干細胞與T細共培養(yǎng)3天，有11.5% T細胞分裂增殖；
B.體皮膚間充質干細胞與T細共培養(yǎng)3天，有12.8% T細胞分裂增殖；
C.同體皮膚間充質干細胞與T細共培養(yǎng)3天，有19.6% T細胞分裂增殖；
D.T細胞單獨培養(yǎng)有85.0%的分裂增殖；
E.沒有用ant1-⑶3和ant1-⑶28抗體刺激的T細胞幾乎沒有分裂增值。這個預備實驗說明了和骨髓間充質干細胞一樣異體皮膚間充質干細胞和同體皮膚間充質干細胞均可以在體外抑制抗體刺激下的T細胞分裂增殖。
圖3:通過PASI指數，小鼠異體皮膚間充質干細胞和同體皮膚間充質干細胞對小鼠的“銀屑病”的治療效果明顯:
A.異體皮膚間充質干細胞治療前后；
B.同體皮膚間充質干細胞治療前后；
C.6只患病小鼠異體皮膚間充質干細胞治療前后；
D.6只患病同體皮膚間充質干細胞治療前后。PASI 銀屑病”小鼠“病情”評分指數。PASI (Psoriasis Area and SeverityIndex)即銀屑病面積和嚴重程度指數是目前國際上通用的評定銀屑病嚴重程度的方法。銀屑病斑塊的厚度、紅斑、鱗屑3項指標均按0-4共5級計分(0=無，1=輕度，2=中度，3=重度，4=極重度)，嚴重程度分是這三項指標得分之和。皮損面積按1-6共6級計分，皮損面積<10%為I分，>10%為2分，>30%為3分，>50%為4分，>70%為5分，>90%為6分。最后按公式來計算PASI總分，PASI總分=0.1X (頭部面積分X頭部嚴重程度分)+0.2X (上肢面積分X上肢嚴重程度分)+0.3X (軀干面積分X軀干嚴重程度分)+0.4X (下肢面積分X下肢嚴重程度分)。
具體實施例方式1.小鼠真皮間充質干細胞的分離:
取出生3天左右的新生小鼠，引頸處死，酒精消毒，剪取背部皮膚置于0.25%的dispase酶中，4°C消化過夜，PBS液清洗3次，剝去表皮，將真皮置于0.2%的膠原酶中消化一個小時，消化完成后再添加DNase I消化10到15分鐘，用PBS洗一遍，用滴管吹打成單細胞懸液，過濾除去大塊組織和碎片，接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)條件為DMEM (low glucose)+10%胎牛血清，37°C，5%C02。培養(yǎng)6小時后，輕輕棄去懸浮細胞，將貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，待長滿瓶底大部分后，胰酶消化，常規(guī)傳代。取傳至第三代的細胞進行研究。
2.小鼠真皮間充質干細胞的鑒定:
將體外培養(yǎng)的真皮間充質干細胞胰酶消化后接種于不同的分化誘導體系中，培養(yǎng)3周后經行組織染色，鑒定分化情況。向成骨細胞分化通過茜素紅染色；向脂肪細胞分化通過形態(tài)學觀察和油紅染色。
3.小鼠的皮膚間充質干細胞抑制效應T細胞免疫應答:
用細胞標記物CFSE來標記免疫磁珠分離的小鼠⑶4+⑶25- T細胞，與皮膚間充質干細胞共培養(yǎng)(皮膚間充質干細胞=T細胞為1:4);在共培養(yǎng)中用ant1-CD3和anti_CD28抗體刺激T細胞3天。CFSE標記過的細胞的分裂增殖情況可以被流式細胞儀檢測，這個預備實驗說明了和骨髓間充質干細胞一樣異體皮膚間充質干細胞和同體皮膚間充質干細胞均可以在體外抑制抗體刺激下的T細胞分裂增殖。4.小鼠皮膚間充質干細胞對小鼠的“銀屑病”的治療:
運用第I步方法分離從小鼠皮膚真皮中分離間充質干細胞，培養(yǎng)至P3代。每只患病小鼠尾靜脈注射Γ 106個皮膚間充質干細胞，觀察21天后評分，可以從圖3看出小鼠異體皮膚間充質干細胞和同體皮膚間充質干細胞對小鼠的“銀屑病”的治療效果明顯。
5.皮膚間充質干細胞對銀屑病患者的治療:
從人的皮膚中分離出皮膚間充質干細胞，無菌環(huán)境下培養(yǎng)至P3代。每位患者靜脈注射5(Τ 106個皮膚間充質干 細胞進行治療。
權利要求
1.充質干細胞在制備治療具有免疫調節(jié)功能的藥物中的應用。
2.充質干細胞在制備治療銀屑病的藥物中的應用。
3.權利要求1所述的充質干細胞在制備治療具有免疫調節(jié)功能的藥物中的應用，其中所述的充質干細胞來源于皮膚真皮層中。
4.權利要求2所述的充質干細胞在制備治療銀屑病的藥物中的應用，其中所述的充質干細胞來源于皮膚真皮層中。
5.權利要求3或4所述的應用，其中所述的充質干細胞通過下列方法提取:剪取背部皮膚置于dispase酶中，消化過夜后清洗，剝去表皮，將真皮置于膠原酶中消化，消化完成后再添加DNase I消化， 用PBS洗一遍，用滴管吹打成單細胞懸液，過濾后接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)后，棄去懸浮細胞，將貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，待長滿瓶底大部分后，胰酶消化，常規(guī)傳代。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供充質干細胞在制備具有治療銀屑病的藥物中的應用，這種應用中涉及的皮膚間充質干細胞取得容易、不具免疫排斥性、療效高、治療后疾病不易復發(fā)而副作用小。
文檔編號C12N5/0775GK103191154SQ20121000264
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月6日 優(yōu)先權日2012年1月6日
發(fā)明者王宏林, 柯芳 申請人:上海交通大學醫(yī)學院