專利名稱：一種菊芋碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法
技術領域：
本發明屬于草酸脫羧酶的制備領域，特別涉及一種菊芋碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法。
背景技術：
草酸脫羧酶可以催化草酸脫羧形成甲酸和二氧化碳，因此在酶法檢測草酸含量， 降解工業廢水中草酸鹽，制備低草酸含量食品以及降低人體內草酸濃度等方面具有廣闊的應用前景。彩絨革蓋菌作為生產草酸脫羧酶的重要菌種，如何降低其培養成本，大量生產菌絲體，并誘導菌絲體合成草酸脫羧酶是一項重要課題。由于碳元素是生物體內含量最多的元素，因此碳源是培養基中用量最大的一種，占生物產品總成本的比例較高，所以通過利用低成本碳源替代目前使用的純凈葡萄糖能大幅度降低微生物的培養成本。菊芋，又名洋姜，是一種菊科向日葵屬宿根性草本植物。菊芋栽培對土質和環境要求較低，耐寒耐旱能力強，繁殖能力強，耐儲存，利于大面積栽培。我國現在菊芋主要用途為腌制咸菜食用，導致經濟價值較低，不能大面積推廣栽培。菊芋中富含菊糖等多糖，采用浸提的方式提取菊芋汁內菊糖等營養物質，制成菊芋汁培養基培養彩絨革蓋菌制備草酸脫羧酶，可以降低產酶成本提高菊芋經濟附加值，具有很好的經濟效益。與菊芋具有類似營養成分的植物還有菊苣和大麗花，也可以制成培養基培養彩絨革蓋菌制備草酸脫羧酶。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種菊芋碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，該方法工藝簡單，成本低，效率高；底物誘導產草酸脫羧酶不受抑制，產酶量穩定。本發明的一種菊芋碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，包括(1)將菊芋在105°C汽蒸15-30min，然后按照1 1_1 10的質量比加水，勻漿得到菊芋漿；在30-120°C下浸提0. 5-3h，過濾，離心，得到菊芋汁；(2)將上述菊芋汁稀釋至7-100g/L的總糖量，補加氮源和無機鹽獲得發酵培養基，調節PH值至4. 0-5. 0，滅菌后備用；(3)以3-15%的接種量將彩絨革蓋菌的菌絲體種子液接入發酵培養基，在 10-30°C和100-250rpm條件下培養2-6天；(4)待菌絲球形成時，加入終濃度為I-IOOmM的草酸誘導產生草酸脫羧酶，培養
0.5-6天后獲取菌絲體；(5)將上述菌絲體經破碎或冷凍后破碎，然后用0. 2M、pH 3. 7的醋酸緩沖液提取菌絲碎片，去除殘渣，即得草酸脫羧酶粗酶液。所述步驟O)中的發酵培養基中組分為總糖為7_10(^的菊芋汁，3.(^蛋白胨，
1.OgKH2PO4,0. 2g Na2HPO4 · 12H20，0. 5g MgSO4 · 7H20 以及微量元素 1ml，以水定容至 1L。所述步驟(3)中的菌絲體種子液的培養基組分為7_5(^葡萄糖，3.(^蛋白胨，1. OgKH2PO4,0. 2g Na2HPO4 · 12Η20，0· 5g MgSO4 · 7Η20 以及微量元素 1ml，以水定容至 1L，。所述微量元素的組分為=FeSO4· 7H20 10g, MnSO4 · H2O 1. 0g, ZnSO4 · 7H20 1. 0g, CuSO4 · 5H20 2. 0g, CaCl2 · 2H20 13g，用水定容至 IL0所述步驟中的草酸加入方式為間歇式、分批補料式或連續式。所述步驟(5)中的破碎方式為研磨破碎、珠磨破碎、均質機破碎或超聲破碎。所述步驟(1)中的菊芋為菊芋、菊苣、大麗花塊莖等富含果聚糖的植物。所述步驟(1)中的菊芋汁可以被果聚糖或者果糖替代。本發明通過浸提菊芋汁獲得培養彩絨革蓋菌生長的碳源，并用底物草酸誘導菌絲體合成草酸脫羧酶。有益效果(1)本發明利用浸提菊芋汁作為發酵培養彩絨革蓋菌的碳源，方法簡單，易于操作；(2)本發明使用的菊芋產量大，成本低，作為生產碳源的原料價格低廉；且碳源的制備可控性強，含糖量穩定；(3)與傳統培養基碳源——葡萄糖相比，以該低值碳源生產彩絨革蓋菌獲得的菌絲體生物量大，是葡萄糖碳源的5倍以上，轉化率高；(4)與傳統培養基相比，以該低值碳源培養菌體時，底物誘導產草酸脫羧酶不受抑制，產酶量穩定。


圖1為菊芋汁培養基(初始pH 5. 0)生產的菌絲體干重隨發酵時間的變化；圖2為不同糖濃菊芋汁培養基對菌絲體干重的影響；圖3為不同糖濃菊芋汁培養基的轉化率；圖4為以草酸誘導菊芋汁培養基(初始pH 5.0)生產的菌絲合成草酸脫羧酶的結果；圖5為以草酸誘導菊芋汁培養基(初始pH 5. 0)生產的菌絲合成草酸脫羧酶后的總糖含量變化。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例1 菊芋汁生產彩絨革蓋菌(培養基初始pH值5. 0) 將新鮮菊芋在105°C汽蒸15min，然后按照1 1的質量比加水，勻漿得到菊芋漿。該菊芋漿在80°C下浸提lh，經過2層紗布過濾，SOOOr/min離心lOmin，得到菊芋汁， 用苯酚硫酸法測定菊芋汁的總糖含量(以葡萄糖為標準糖計)，4°C條件下儲存備用。每 50mL發酵培養基中加入含Ig總糖(以葡萄糖計)的菊芋汁，再加入0. 15g蛋白胨，0.05g磷酸二氫鉀，0.025g MgSO4 ·7Η20，0· Olg Na2HPO4 · 12Η20，以及微量元素50 μ L(微量元素配方為FeS04 · 7H20 10g/L, MnSO4 · H2O 1. Og/L, ZnSO4 · 7H20 1. Og/L, CuSO4 · 5H20 2. Og/L, CaCl2 · 2H20 13g/L)。培養基配制完成后，用硫酸和氫氧化鈉調節初始pH值至5. 0，滅菌后備用。取一塊瓊脂平板菌種，用打孔器打下直徑約IOmm含菌絲體的固體培養基薄片，取 2-3片加入液體種子培養基，30°C靜置4-6天。待菌絲體在培養基上方形成白色菌蓋但尚未完全浮出液面，全部移入裝有玻璃珠的容器，進行震蕩破碎，獲得含有菌絲碎片的懸濁液。 將混勻的菌懸液按8vol %的接種量接入發酵培養基中，培養1-5天，稱取菌絲體絕干重。發現菊芋汁培養基的菌絲體產量高于對照培養基(葡萄糖)菌絲體產量，約高4-5倍，且處于上升趨勢(見圖1)。實施例2菊芋汁生產彩絨革蓋菌(培養基初始PH值5. 0)將新鮮菊芋在105°C汽蒸20min，然后按照1 5的質量比加水，勻漿得到菊芋漿。 該菊芋漿在90°C下浸提1. 5h，經過2層紗布過濾，SOOOr/min離心lOmin，得到菊芋汁，用苯酚硫酸法測定菊芋汁的總糖含量(以葡萄糖為標準糖計)，4°C條件下儲存備用。每50mL 發酵培養基中加入含0.35g總糖(以葡萄糖計)的菊芋汁，再加入0. 15g蛋白胨，0.05g磷酸二氫鉀，0.025g MgSO4 · 7Η20，0· Olg Na2HPO4 · 12Η20，以及微量元素 50 μ L(微量元素配方為FeS04 · 7H20 10g/L, MnSO4 · H2O 1. 0g/L, ZnSO4 · 7H20 1. Og/L, CuSO4 · 5H20 2. Og/L, CaCl2 · 2H20 13g/L)。培養基配制完成后，用硫酸和氫氧化鈉調節初始pH值至5. 0，滅菌后備用。取一塊瓊脂平板菌種，用打孔器打下直徑約IOmm含菌絲體的固體培養基薄片，取 2-3片加入液體種子培養基，30°C靜置4-6天。待菌絲體在培養基上方形成白色菌蓋但尚未完全浮出液面，全部移入裝有玻璃珠的容器，進行震蕩破碎，獲得含有菌絲碎片的懸濁液。 將混勻的菌懸液按3vol %的接種量接入發酵培養基中，培養1-5天，稱取菌絲體絕干重。發現菌絲體產量的變化趨勢與實施例1類似，同樣高于對照培養基(葡萄糖)菌絲體產量，且處于上升趨勢。實施例3菊芋汁生產彩絨革蓋菌(培養基初始pH值5. 0)將新鮮菊芋在105°C汽蒸30min，然后按照1 10的質量比加水，勻漿得到菊芋漿。該菊芋漿在110°c下浸提2h，經過2層紗布過濾，SOOOr/min離心lOmin，得到菊芋汁， 用苯酚硫酸法測定菊芋汁的總糖含量(以葡萄糖為標準糖計)，4°C條件下儲存備用。每 50mL發酵培養基中加入含l_4g總糖(以葡萄糖計)的菊芋汁，再加入0. 15g蛋白胨，0. 05g 磷酸二氫鉀，0.025g MgSO4 ·7Η20，0· Olg Na2HPO4 · 12Η20，以及微量元素50 μ L(微量元素配方為FeS04 · 7H20 10g/L, MnSO4 · H2O 1. 0g/L, ZnSO4 · 7H20 1. Og/L, CuSO4 · 5H20 2. Og/L, CaCl2 · 2H20 13g/L)，配制成含菊芋汁20、40和80g/L的發酵培養基。培養基配制完成后， 用硫酸和氫氧化鈉調節PH值至5. 0，滅菌后備用。取一塊瓊脂平板菌種，用打孔器打下直徑約IOmm含菌絲體的固體培養基薄片，取 2-3片加入液體種子培養基，30°C靜置4-6天。待菌絲體在培養基上方形成白色菌蓋但尚未完全浮出液面，全部移入裝有玻璃珠的容器，進行震蕩破碎，獲得含有菌絲碎片的懸濁液。將混勻的菌懸液按15ν01%的接種量接入發酵培養基中，培養1-5天，稱取菌絲體絕干重。 結果見圖2和圖3，結果發現菌絲體產量的變化趨勢與實施例1類似，同樣高于對照培養基 (葡萄糖)菌絲體產量，且80g/L的干重高于20g/L和40g/L的干重。圖3表明40g/L菊芋培養基的糖轉化率最高，是優選濃度。實施例4菊芋汁生產菌絲體并誘導合成草酸脫羧酶(培養基初始PH值5. 0)任取實施例1 3培養2 6天的菌絲，加入終濃度為5-100mM的草酸，誘導0. 5-6 天后，收取菌絲體，保存發酵液，將菌絲體液氮冷凍研磨破碎后，用0. 2M, pH 3. 7的醋酸緩沖液提取菌絲碎片，離心去除殘渣，上清即為粗酶液。殘渣烘至絕干稱重，上清測定草酸脫羧酶活力(圖4)，發酵液測定殘留總糖濃度(圖幻。對照組采用葡萄糖培養基，培養方法相同。圖4結果顯示菊芋汁培養的菌絲合成的草酸脫羧酶的活力是葡萄糖培養的5倍以上。圖5顯示菊芋汁培養的菌絲對草酸的加入不敏感，糖能繼續被消耗，代謝能力明顯比葡萄糖培養的菌絲強。實施例5菊苣汁生產彩絨革蓋菌(培養基初始pH值5. 0)將新鮮菊苣在105°C汽蒸15min，然后按照1 1的質量比加水，勻漿得到菊苣漿。該菊苣漿在80°C下浸提lh，經過2層紗布過濾，SOOOr/min離心lOmin，得到菊苣汁， 用苯酚硫酸法測定菊苣汁的總糖含量(以葡萄糖為標準糖計)，4°C條件下儲存備用。每 50mL發酵培養基中加入含Ig總糖(以葡萄糖計)的菊苣汁，再加入0. 15g蛋白胨，0.05g 磷酸二氫鉀，0.025g MgSO4 ·7Η20，0· Olg Na2HPO4 · 12Η20，以及微量元素50 μ L(微量元素配方為FeS04 · 7H20 10g/L, MnSO4 · H2O 1. Og/L, ZnSO4 · 7H20 1. Og/L, CuSO4 · 5H20 2. Og/L, CaCl2 · 2H20 13g/L)。培養基配制完成后，用硫酸和氫氧化鈉調節初始pH值至5. 0，滅菌后備用。取一塊瓊脂平板菌種，用打孔器打下直徑約IOmm含菌絲體的固體培養基薄片，取 2-3片加入液體種子培養基，30°C靜置4-6天。待菌絲體在培養基上方形成白色菌蓋但尚未完全浮出液面，全部移入裝有玻璃珠的容器，進行震蕩破碎，獲得含有菌絲碎片的懸濁液。 將混勻的菌懸液按8vol %的接種量接入發酵培養基中，培養1-5天，稱取菌絲體絕干重。發現菊苣汁培養基的菌絲體產量高于對照培養基(葡萄糖)菌絲體產量，約高4倍，且處于上升趨勢，結果類似于圖1。
權利要求
1.一種菊芋碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，包括(1)將菊芋在105°c汽蒸15-30min，然后按照1 1_1 10的質量比加水，勻漿得到菊芋漿；在30-120°C下浸提0. 5-3h，過濾，離心，得到菊芋汁；(2)將上述菊芋汁稀釋至7-100g/L的總糖量，補加氮源和無機鹽獲得發酵培養基，調節pH值至4. 0-5.0，滅菌后備用；(3)以3-15ν01%的接種量將彩絨革蓋菌的菌絲體種子液接入發酵培養基，在10-30°C 和100-250rpm條件下培養2_6天；(4)待菌絲球形成時，加入終濃度為I-IOOmM的草酸誘導產生草酸脫羧酶，培養0.5-6 天后獲取菌絲體；(5)將上述菌絲體經破碎或冷凍后破碎，然后用0.2M、pH 3. 7的醋酸緩沖液提取菌絲碎片，去除殘渣，即得草酸脫羧酶粗酶液。
2.根據權利要求1所述的一種菊芋碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，其特征在于所述步驟O)中的發酵培養基中組分為總糖為7-10(^的菊芋汁，3.(^蛋白胨， 1. Og KH2PO4,0. 2g Na2HPO4 · 12Η20，0· 5g MgSO4 · 7H20 以及微量元素 1ml，以水定容至 1L。
3.根據權利要求1所述的一種菊芋碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，其特征在于所述步驟C3)中的菌絲體種子液的培養基組分為7-50g葡萄糖，3. Og蛋白胨，1. Og KH2PO4,0. 2g Na2HPO4 · 12Η20，0· 5g MgSO4 · 7H20 以及微量元素 lml,以水定容至 1L，。
4.根據權利要求2或3所述的一種菊芋碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法， 其特征在于所述微量元素的組分為=FeSO4 ·7Η20 10g，MnSO4 .H2O 1. 0g，ZnSO4 ·7Η20 1. 0g, CuSO4 · 5Η20 2. 0g, CaCl2 · 2Η20 13g，用水定容至 IL0
5.根據權利要求1所述的一種菊芋碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，其特征在于所述步驟中的草酸加入方式為間歇式、分批補料式或連續式。
6.根據權利要求1所述的一種菊芋碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，其特征在于所述步驟(5)中的破碎方式為研磨破碎、珠磨破碎、均質機破碎或超聲破碎。
全文摘要
本發明涉及一種菊芋碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，包括(1)浸提菊芋汁；(2)將上述菊芋汁稀釋至7-100g/L的總糖量，補加氮源和無機鹽獲得發酵培養基，調節pH值至4.0-5.0，滅菌后備用；(3)以3-15vol％的接種量將彩絨革蓋菌的菌絲體種子液接入發酵培養基培養2-6天；(4)待菌絲球形成時，加入終濃度為1-100mM的草酸誘導產生草酸脫羧酶，培養0.5-6天后獲取菌絲體；(5)將上述菌絲體經冷凍后破碎，然后用醋酸緩沖液提取菌絲碎片，去除殘渣，即得草酸脫羧酶粗酶液。本發明工藝簡單，成本低，效率高；底物誘導產草酸脫羧酶不受抑制，產酶量穩定。
文檔編號C12R1/645GK102533707SQ20121000291
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月6日 優先權日2012年1月6日
發明者宮搏陽, 楊雪霞, 洪楓 申請人:東華大學