專利名稱：鑒別蛇皮果性別的dna片段、引物和方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，具體涉及鑒別蛇皮果性別的DNA片段、引物和方法。
背景技術：
蛇皮果(Salacca zalacca)是一種果形獨特、果肉富含鈣鐵、果實采摘方便、適合我國海南和云南栽培的熱帶果樹。有性繁殖是蛇皮果繁殖的重要方式，然而蛇皮果是雌雄異株植物，有性繁殖生產的實生苗肉眼難以鑒定其性別。性別不明的實生苗造林后容易造成雌株分布不均、修復成本高和單產低等后果。傳統肉眼鑒定蛇皮果植株性別需要等待植株開始繁殖生長，而蛇皮果植株初次繁殖生長時間的年齡在海南和云南為3年。2009年印尼有報道稱可利用同工酶來鑒定蛇皮果實生苗的性別，但該技術的具體步驟和過程資料難以取到，因此國內生產上還不能對蛇皮果實生苗性別進行鑒別，實生苗造林的后果還是難以避免。

發明內容
本發明的目的是提供一種用以鑒別蛇皮果雌雄性別的DNA片段、引物和方法。本發明運用RAPD方法在雄性蛇皮果基因組中擴增出一條雄性蛇皮果所特有的特異性條帶，通過克隆和測序獲得一段長度為1638bp的DNA片段，具體核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，該DNA片段可以用以鑒別蛇皮果的雌雄性別。本發明人根據該特異性的DNA片段設計了一對蛇皮果雌雄性別鑒定引物LF4 5' -AGCACAGCCTAGTTAGTT-3‘，序列如 SEQ ID NO. 2 所示；LR4 5' -TGACACCTCCTCCCATAT-3‘，序列如 SEQ ID NO. 3 所示。根據該對蛇皮果雌雄性別鑒定引物能夠擴增出一條雄性蛇皮果擁有的特異性序列，其長度為1579bp。本發明的蛇皮果性別鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟常規提取蛇皮果樣品的基因組DNA，以其作為模板，以LF4 :5 ‘ -AGCACAGCCTAGTTAGTT-3 ‘，LR4 5' -TGACACCTCCTCCCATAT-3‘作為引物進行PCR反應，將PCR產物進行電泳檢測，電泳結果中出現一段1579bp條帶的樣品為雄株，而相同部位沒有出現條帶的樣品為雌株。所述的PCR反應優選為PCR反應體系為15 μ L，反應液中含IOXbuffer 1. 5 μ L、 dNTPs 0. 12mmol/L、Taq DNA 聚合酶 0. lOU/μ L、MgCl2 1. 4mmol/L、引物 LF4 和引物 LR4 各 0. 3μπι01/1、12ι^蛇皮果基因組DNA模板；反應程序為94°C預變性2分鐘；94°C 30秒、 390C 30秒、72°C 2分鐘，40個循環；72°C延伸10分鐘。本發明提供的如SEQ ID NO. 1所示的DNA序列為雄性蛇皮果所特有的特異性DNA 序列，可以用于鑒定蛇皮果的雌雄性別。實驗結果表明，本發明的鑒定引物和鑒定方法能夠準確的鑒別出蛇皮果的雌雄性別，相比于傳統肉眼鑒定蛇皮果植株性別需要等待植株開始繁殖生長才能鑒定，本發明具有簡單，方便，隨時都可以鑒定的優點，為更有效、合理的種植蛇皮果創造了條件。


圖1是實施例1的RAPD產物的電泳圖，其中1 10為雌性蛇皮果實生苗，11 20為雄性蛇皮果實生苗；圖2是實施例2的PCR產物的電泳圖，其中1 10為雌性蛇皮果實生苗，11 20 為雄性蛇皮果實生苗。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例1 以已確定性別的雌雄蛇皮果各10株作為樣品，按照下述方法提取基因組DNA，進行RAPD擴增和電泳。步驟1:葉片采集以蛇皮果實生苗直立未展葉為第1葉，往下數第3葉的葉片作為采集葉，在該葉上取5厘米X5厘米的葉片，拭去葉樣表面灰塵和水分，并放至塑料袋里，然后將塑料袋密封并放至冰袋。步驟2 基因組DNA提取在10毫升離心管中加入4毫升2% CTAB提取液(CTAB20克/升、NaCl 81. 816克 /升、EDTA9. 306克/升、Tris-HCl 12. 114克/升、ρΗ8· 0)后再加入2% β -巰基乙醇和 5% PVP_40，65°C保溫。稱取蛇皮果葉樣1. 2克，將葉樣剪碎，放入研缽，加液氮研磨至粉末狀。將研磨好的葉樣加入預熱的提取液中，封口，65°C保溫60分鐘，每隔10分鐘搖動1次。 將樣品11000轉/分鐘離心10分鐘，取上清液。上清液中加入氯仿異戊醇04 1)4毫升，搖勻，11000轉/分鐘離心10分鐘，取上清液；重復1次本步驟。向上清液中2毫升5 摩爾/升NaCl，然后再加入4°C冷藏的2毫升異丙醇，輕輕晃動混勻，-20°C下靜置1小時以上。取冷凍液，11000轉/分鐘離心10分鐘，倒掉上清液，加入2毫升無水乙醇洗兩次，洗后將管倒置于衛生紙上吸干，在真空濃縮儀中干燥5分鐘左右。加入1毫升1XTE，溶解沉淀的DNA即為蛇皮果基因組DNA，彈動或震蕩以充分溶解，放入冰箱備用。DNA濃度測定通過與IOObp DNA Ladder的500bp片段亮度對比進行。步驟3 =PCR 擴增(RAPD)將1. 0微摩爾/升已知10個堿基序列為“CCTGGGTCAG”的引物，加入15微升的反應液中，該反應液含IOXbuffer 1.5微升、dNIPs 0. 12毫摩爾/升、Taq DNA聚合酶0. IOU/ 微升、MgCl2L 4毫摩爾/升、RAPD隨機引物、12納克蛇皮果基因組DNA模板，94°C預變性2 分鐘，再完成94°C 30秒、39°C 30秒和72°C 2分鐘的循環40個，最后在72°C下再延伸10分鐘，由此得到PCR產物。步驟4 電泳制備含有Gold View 0. 05微摩爾/升的1. 2%瓊脂糖凝膠，將2微升溴酚藍和 10微升步驟3中的PCR產物混勻，加入到點樣孔中，再把點好樣的瓊脂糖凝膠放在電泳儀上，加入0. 5 X TBE緩沖液，在150伏電壓下電泳45分鐘。電泳結果如圖1所示，從圖1可以看出，在1638bp的位置，10株雄性蛇皮果(11 20)具有一個特異性條帶，而10株雌性蛇皮果(1 10)則沒有該條帶，由此說明該特異性條帶可以用于鑒別雌雄蛇皮果，將該特異性條帶送去測序，其序列如SEQ ID NO. 1所示。實施例2 以SEQ ID NO. 1所示的特異性DNA片段設計一對蛇皮果雌雄性別鑒定引物 LF4 5 ‘ -AGCACAGCCTAGTTAGTT-3 ‘ , LR4 5 ‘ -TGACACCTCCTCCCATAT-3 ‘。以實施例 1的蛇皮果樣品的基因組DNA作為模板，以LF4 5 ‘ -AGCACAGCCTAGTTAGTT-3 ‘，LR4 5 ‘ -TGACACCTCCTCCCATAT-3 ‘作為引物進行PCR擴增反應。PCR擴增反應體系為15 μ L 的反應液中含 IOXbuffer 1. 5μ L、dNTPs 0. 12mmol/L、Taq DNA 聚合酶 0. lOU/μ L、 MgCl2L 4mmol/L、引物LF4和LR4各0. 3 μ mol/L、12ng蛇皮果基因組DNA模板，94°C預變性 2分鐘，再完成94°C 30秒、39°C 30秒和72°C 2分鐘的循環40個，最后在72°C下再延伸10 分鐘，由此獲得PCR產物。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，其電泳圖如圖2所示，由圖2 可以看出10株雌性蛇皮果(1 10)在1579bp位置沒有條帶，而10株雄性蛇皮果(11 20)在1579bp位置有一個特異條帶。這表明本發明設計的引物和方法能夠用于蛇皮果雌雄性別鑒定。
權利要求
1.鑒定蛇皮果性別的DNA特異性片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所不。
2.鑒別蛇皮果性別的鑒定引物，其特征在于，由LF4:5' -AGCACAGCCTAGTTAGTT-3‘和 LR4 5' -TGACACCTCCTCCCATAT-3‘組成。
3.一種蛇皮果性別鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟常規提取蛇皮果樣品的基因組DNA，以其作為模板，以LF4 :5 ‘ -AGCACAGCCTAGTTAGTT-3 ‘，LR4 5' -TGACACCTCCTCCCATAT-3‘作為引物進行PCR反應，將PCR產物進行電泳檢測，電泳結果中出現一段1579bp條帶的樣品為雄株，而相同部位沒有出現條帶的樣品為雌株。
4.根據權利要求3所述的蛇皮果性別鑒定方法，其特征在于，所述的PCR反應為PCR 反應體系為 15 μ L，反應液中含 IOXbuffer 1. 5μ L, dNTPs 0. 12mmol/L, Taq DNA 聚合酶 0. IOU/ μ L、MgCl2 1. 4mmol/L、引物 LF4 和引物 LR4 各 0. 3 μ mol/L、12ng 蛇皮果基因組 DNA 模板；反應程序為94°C預變性2分鐘；94°C 30秒、39°C 30秒、72°C 2分鐘，40個循環；72°C 延伸10分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種鑒別蛇皮果性別的DNA片段、引物和方法。鑒定蛇皮果性別的DNA特異性片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。鑒別引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。鑒定方法是用鑒別引物作為擴增引物，以樣品的基因組DNA作為模板進行PCR反應，將PCR產物進行電泳檢測，電泳結果中出現一段1579bp條帶的樣品為雄株，而相同部位沒有出現條帶的樣品為雌株。本發明的引物和鑒定方法能夠準確的鑒別出蛇皮果的雌雄性別，相比于傳統的肉眼鑒定蛇皮果植株性別，本發明具有簡單，方便，隨時都可以鑒定的優點，為更有效、合理的種植蛇皮果創造了條件。
文檔編號C12Q1/68GK102433389SQ20121000492
公開日2012年5月2日 申請日期2012年1月6日 優先權日2012年1月6日
發明者尹天光, 李發根, 李建光, 李榮生, 楊錦昌, 鄒文濤 申請人:中國林業科學研究院熱帶林業研究所