專利名稱：貓杯狀病毒感染性克隆及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種正義RNA病毒表達載體及其構建方法和應用，特別涉及一種貓杯狀病毒感染性克隆及其構建方法和應用。
背景技術：
單股正鏈RNA病毒的堿基序列與mRNA完全相同，可直接起到病毒mRNA的作用。因此，該類病毒稱為正義RNA病毒，其裸RNA具有感染性。該類病毒基因組復制的特點是先合成(-)RNA，再以之作為合成(+)RNA的模板。Racaniello和Baltimore于1981年首次成功的構建了動物RNA病毒的感染性克隆，他們把脊髓灰質炎病毒(Poliovirus，PV)基因組的全長cDNA克隆到pBR322載體中，用該重組質粒轉染哺乳動物細胞后，可以產生具有感染性的病毒粒子，從此拉開了動物RNA病毒反向遺傳學研究的序幕。隨后其它一些正鏈RNA病毒的反向遺傳學系統也在不斷被成功建立。Sumiyoshi等(1992)采用分段克隆的方法成功拯救了日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus JEV)。分段克隆即將黃病毒的全基因組分成兩段或者多個片段構成重組質粒然后體外連接成全長cDNA分子，再進行體外轉錄或拯救，以此解決了黃病毒科中一些病毒基因組cDNA的亞克隆在寄主細菌中常不能穩定增殖的問題。FMDV的第一個感染性cDNA由Zibert A等于1990年構建成功，隨后 Riederd等也成功構建了 A型FMDV的感染性克隆，他們各自采用不同的方法克服了 FMDV基因組中Poly(C)尾巴的問題。AlmaZ(5n(2000)等利用BAC系統首次成功構建出了豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis coronavirus TGEV)的全長cDNA分子克隆， 并實現了病毒拯救。這是反向遺傳學發展史上的一個突破性進展，TGEV感染性克隆的成功構建表明RNA病毒的反向遺傳學操作將不再受到基因組大小的限制。2006年，St-Jean等利用BAC系統又成功拯救出具有神經毒力的人冠狀病毒(Human corona virus，HCoV)。此外， Casais等0001)率先利用痘病毒做載體成功構建了雞傳染性支氣管炎病毒Gnfectious bronchitis virus, IBV)的反向遺傳研究系統，為建立其它冠狀病毒的感染性克隆提供了范例。其后，Thiel等Q001)也將人冠狀病毒的全長cDNA克隆到痘病毒載體中，并能穩定的增值病毒cDNA。Yount等^00 在體外采用順次連接的方法獲得了 MHV的全長cDNA，以其為模板進行體外轉錄，獲得了具有感染性的全長RNA。這種策略雖然可行，但是存在RNA 獲得率低，病毒拯救效率低的缺陷。Coley等000 將體外裝配好的鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus, MHV)的全長cDNA分子克隆至痘苗病毒載體中，然后用豆苗病毒感染靶細胞，通過體內轉錄過程實現了 MHV的拯救，用該方法拯救出的病毒不僅滴度高，而且具有很強的侵略性，與母本毒相似。至此冠狀病毒的反向遺傳學研究系統已經完全走向成熟。貓杯狀病毒(Feline Calicivirus，FCV)，屬于杯狀病毒科，是一種正鏈RNA病毒。 是貓上呼吸道疾病的主要病原，主要引起貓的急性口腔潰瘍、上呼吸道感染和慢性胃腸炎疾病，該病發病率較高，但死亡率較低。幾乎所有的貓科動物對FCV都易感。一歲以下的貓最易感，潛伏期為2 3天，病貓臨床癥狀表現為采食困難、打噴嚏、流涎、口腔潰瘍、結膜炎等。有些毒株可以引起急性關節炎，貓表現出跛行。FCV呈世界性分布，可能感染所有的貓科動物。自首次在貓身上分離到該病毒后，之后從獵豹和老虎體內也分離到該病毒。貓杯狀病毒屬于杯狀病毒科，杯狀病毒科現有四個屬兔病毒屬(Lagovirus)、諾瓦克病毒屬(Norovirus)、扎幌樣病毒屬(Sappovirus)、以及水泡疹病毒屬(Vesirus)。其中諾瓦克樣病毒和扎幌樣病毒合稱人類杯狀病毒(Human calicivirus HuCV)，它們是引起成人和兒童非細菌性急性胃腸炎的主要病原體，HuCV不僅可以引發腸道感染，也能引起心肌損害。而兔病毒屬的主要成員兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus RHDV) 則是一種烈性毀滅性病毒性傳染病，已經列入二類動物病原微生物，對養兔業和實驗兔危害極大。盡管此類病毒已發現很多年，但由于缺乏相應的細胞培養系統，使得相關研究仍然緩慢。同科的貓杯狀病毒卻能夠在貓腎細胞(CRH0中培養增殖。因此科學家們以它作為研究模型，試圖解決目前存在的問題，現對FCV的分子生物學及反向遺傳學的研究進展進行綜述。在RNA病毒家族中，杯狀病毒是一類不易引起人們重視的病毒。隨著其重要成員偌瓦克病毒(NV)的發現，人們才開始重視該科病毒的研究。因為它可以引起人類的非細菌性腸胃炎，對人類的健康威脅極大。遺憾的是該科的大多數病毒都不能在體外培養，給病毒的分離和研究帶來很大不便。反向遺傳學技術的興起給研究這些病毒帶來了希望。但水泡疹樣病毒屬(如FCV)例外，它可以在CRFK(貓腎細胞)中高滴度的增殖，因此它往往被作為杯狀病毒研究的模型。Manislav V. Sosnovtsev(1995)等最早利用RT-PCR的方法克隆了 FCVUrbana株的全基因組，運用T7RNA聚合酶啟動子在體外轉錄了 FCV mRNA,同時在5'-端加上帽狀結構，恢復了具有感染性的FCV病毒粒子。Kyeong-OK Chang等采用同樣的方法恢復了具有感染性的豬的杯狀病毒。Jorg Oliver Thumfart等采用體外轉錄的方法和構建真核表達質粒的方法，都成功恢復了 FCV病毒粒子。并且把綠色熒光蛋白基因 (GFP)插入FCV衣殼蛋白基因位置后，構建了感染性嵌合DNA克隆質粒，轉錄細胞GFP獲得了表達，嵌合病毒基因組可自我復制，并且被包裝成病毒粒子。但是，現有的貓杯狀病毒感染性克隆普遍感染性不高，滴度較低。

發明內容
本發明的目的在于提供一種新型的貓杯狀病毒感染性克隆。本發明的另一個目的在于提供上述貓杯狀病毒感染性克隆的構建方法。本發明的再一個目的在于提供上述貓杯狀病毒感染性克隆在表達外源蛋白中的應用。本發明所采取的技術方案是
貓杯狀病毒感染性克隆，通過在FCV病毒的全長cDNA的兩端連接酶切位點，之后將序列連接到表達載體中得到。表達載體為去除了 f 1、ori、SV40、neo、ρ 1 yA序列的商品化質粒pcDNA3，優選的，表達載體的3’端連接有核酶。核酶優選為自剪切型核酶。上述貓杯狀病毒感染性克隆的構建方法，包括以下步驟
1)使用PCR法擴增FCV全長cDNA，并在兩端引入酶切位點；
2)將商品化質粒pcDNA3的fl、ori、SV40、neo、plyA序列去除，得到改造質粒；
3)在改造質粒上引入核酶序列；4)克隆出FCV全長基因組并連接到真核表達載體ρ⑶NA中，得到貓杯狀病毒感染性克隆。優選的，引入核酶序列時包括如下步驟
1)以PCDNA3為模板以DNA3HDRZ1和DNAIBB為引物，進行PCR，PCR程序是95°C5min ； 98°C 10s，55°C 15s，72°C 4min，30 個循環；72°C lOmin，得到 PCR 產物 pHDRZl ；
2)以pHDRZl 為模板，以 DNA3HDRZ2 和 DNA3B 為引物，PCR 程序是:95°C 5min ；98°C IOs, 55°C 15s，72°C 4min,30 個循環；72°C lOmin，得到的 PCR 產物命名為 pHDRZ2 ；
3)以pHDRZ2 為模板，以 DNA3HDRZ3 和 DNAIBB 為引物，PCR 程序是95°C 5min ；98°C IOs, 59°C 15s，72°C 4min，30 個循環；72°C lOmin，得到的 PCR 產物命名為 pCDNA-HDRZ ；
4)膠回收ρ⑶NA-HDRZ連接pMD18_T載體，轉化，得到改造載體； 其中，引物的序列為
DNA3HDRZ1 5 ‘ -GGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGCTGATCAGCCTCGACTGTG C-3' ； (SEQ ID NO 1) DNA3HDRZ2
5 ‘ -TCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCG-3 ‘ ；(SEQ ID NO 2)
DNA3HDRZ3
5' -ATTTAAATGCGGCCGCGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTC-3' (SEQ ID NO 3) DNA3B 5' -TTAATTAAGCTAGCAGTTAGCCAGA GAGCTC TGC-3 ’ (SEQ ID NO 4)。通過將外源蛋白編碼序列引入本發明的貓杯狀病毒感染性克隆中，即可表達翻譯得到外源蛋白。本發明的有益效果是
實驗結果表明，使用本發明克隆生產得到的FCV，與親本毒具有相似的特性，具有很好地感染性，可使細胞明顯變性，滴度高，傳代穩定。有利于長期使用。通過引入核酶序列，有助于基因組3、端的精確組裝。


圖1是FCV全序列的PCR產物的電泳圖； 圖2是改造的pcDNA3載體的電泳圖3是引入核酶過程中間序列的PCR產物的電泳圖； 圖4是病毒復制的動力曲線圖。
具體實施例方式全長的擴增
PCV 的全序列如 GenBank ID :GU214989. 1 所示。使用引物FCVNORZ5 ‘ -GCAGAGCTCTCTGGCTAACTGTAAAAGAAATTTGAGAC-3 ‘ (SE Q ID NO :5)(下劃線部為Mc I酶切位點)。前半部分為ρ⑶NA序列，后半部分為FCV 序列。FCVhouB 5 ‘ -TTTTCTAGAGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ‘(SEQ ID NO :6)。(下劃線為Not I酶切位點)。以含有DCV全長的質粒為模板，使用PrimeSTAR HSDNAPolymerase 擴增，反應體系PrimeSTAR 0. 5 μ L, dNTP (2. 5mM)4y L,5XPS BufferlO μ L, FCVNORZ(IOmM)1 μ L, FCVhouB(IOmM)1 μ L, pFCVO. 5 μ L, ddH20 up to50μ L。 PCR 程序95°C 5min ；98°C 10s，59°C 15s，72°C 4min，30 個循環；72°C IOmin0瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物
以IXTAE緩沖液配制瓊脂糖凝膠，每個加樣槽中加入5yL PCR產物，XDNA/ HindIIIMarker做對照，80V電泳30min，觀察結果。其結果如圖1所示，圖中，1為PCR產物， M 為 Marker。產物的回收和純化
按DNA小量凝膠回收試劑盒的使用說明進行，具體操作如下PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳后，用潔凈的手術刀在紫外燈下快速切下含有目的片段的凝膠，使它盡可能的小， 放入1. 5M Eppendorf管中稱重，向膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，50°C水浴放置lOmin。 將上一步所得的溶液加入吸附柱CAl中，13，000r/rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附管重新放入收集管中。向吸附柱中加入700 μ L漂洗液PW(使用前以1 4加入無水乙醇)13，OOOr/rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。向吸附柱中加入500 μ L漂洗液PW，13，000r/rpm離心30s，倒掉廢液。將離心柱放回收集管中，13，OOOr/ rpm離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱于室溫或50°C溫箱5min，徹底晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步實驗。將吸附柱放到一個干凈的Eppendorf管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65 70°C水浴預熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置aiiin。13，000r/rpm離心 Imin收集DNA溶液。為了提高DNA回收量，可以將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中， 13，000r/rpm 離心 Imin 收集 DNA 溶液。載體的改造
通過PCR方法去掉商品化質粒pcDNA3中原有的fl、ori、SV40、neo、plyA 序列，以PDNA3F -CGGTATCAGCTCACTCAA-3' (SEQ ID N0:7)禾P PDNA3B 5，-TGGTTCTTTCCGCCTCAG-3，(SEQ ID NO 8)為引物擴增改造后的質粒。PCR 程序是:95V 5min ；98°C 10s，55°C 15s，72°C 3min30s，30 個循環；72°C IOmin0將PCR產物進行電泳，其結果如圖2所示，圖中，1為PCR產物，M為Marker?；厥誔CR產物對其進行磷酸化，使用T4 Polymucleotide Kinase。體系是純化 PCR 產物 25 μ L，IOX T4 Buffer 5μ L,T4 PNK 2 μ L, ATP 0. 5 μ L，補水至 50 μ L。自連后轉化感受態細胞JM109，挑單菌落并鑒定陽性質粒。送^witrogen測序。然后再抽提質粒。 改造后的載體命名為P⑶NA。產物的連接、轉化與陽性克隆質粒的鑒定 1)大腸桿菌感受態細胞的制備
在無菌條件下，挑取保存的JM109菌種，劃線接種于不含抗生素的LB瓊脂平板上，370C 倒置培養1 左右。挑取單個菌落，接種到3mL不含抗生素的LB培養液中，37°C振搖培養過夜。次日無菌吸取ImL細菌培養液加入到預熱至37°C的IOOmL不含抗生素的LB培養液中，37°C劇烈振搖培養。培養至培養物的0D600 = 0. 4 0. 5(約2. 5 3h)后，冰浴15min，使培養物冷卻至0°C。在無菌條件下(注意，以下操作均需嚴格無菌且在冰水浴中進行)，將細菌培養液轉移到2個無菌且冰預冷的50mL聚丙烯離心管中，4°C條件下離心(4，000r/rpm) IOmin,棄上清；回收細菌沉淀，每管加入IOmL冰預冷的75mmol/L CaCl2,IOmmol/LTris · Cl (pH 6. 5)溶液重懸沉淀，冰浴 IOmin, 4°C 4，000r/rpm 離心 lOmin，徹底棄上清；每管用 2mL 冰浴冷的 CaCl2 保存液(75mmol/L CaCl2、10mmol/L Tris. Cl、pH 6. 5、 15% (ν/ν)甘油)將菌體沉淀懸起。將重懸好的感受態細胞分裝于無菌微量離心管中，每管100 μ L，置_70°C超低溫冰箱凍存備用。2)擴增產物與pMD18-T連接
將瓊脂糖凝膠回收純化的PCR產物與pMDIS-T載體連接，連接反應體系為DNA回收片段 3 μ L，pMD18-T 載體 0. 5 μ L，ligation Rase 1 μ L 加水補至 10 μ L，于 16°C連接過夜。3)連接產物的轉化
在冰水中融化ー支JM 109感受態細胞，將10 μ L連接產物加入其中并輕輕混勻，冰浴 30min，42°C熱沖擊 90s 后，立即冰浴 5min，加 500 μ L LB (37°C )培養基，37°C 以 80_100r/ rpm振搖lh，取50 μ L 200 μ L加到含Amp (50 μ g/mL)的LB瓊脂板上，待菌液吸收后將平板倒置，于37°C培養過夜或14h 16h，可出現轉化菌落。4)陽性克隆質粒的鑒定菌液PCR鑒定
挑取單菌落，做菌液PCR鑒定。反應體系如下
取ー潔凈 0.2mL PCR 管，カロ IOXEx Taq buffer 5μ L,2. 5mM dNTP 2 μ L，上游引物 1μ L，下游引物1μ L，菌液1μ L，Ex Taq酶0. 5 μ L，補水至25 μ L，瞬時離心10s，放置PCR 儀上進行循環擴增，參數同上。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR反應產物，觀察并記錄結果。質粒的小量制備(堿裂解法)
挑取單克隆，在含有Amp的LB培養基中培養，參照TaKaRa質粒提取試劑盒中說明書提取重組質粒。質粒PCR鑒定
反應體系為取ー潔凈 0. 2mL PCR 管，加 IOXExiTaq buffer 5μ L,2. 5mM dNTP2yL，上游引物1 μ L，下游引物1ロし質粒0. IuLjEx Taq酶0. 5 μ L，補水至25 μ L，瞬時離心10s， 放置PCR儀上進行循環擴増。PCR反應參數同上。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR反應產物， 觀察并記錄結果。陽性質粒命名為pMD-p⑶NA。核酶的引入
為了便于體內轉錄，并使合成的RNA就有精確地末端結構，在改造后的載體pCDNA 的-3'端通過多重PCR(Multi-PCR)分三步在基因組-3'端引入H印atitis delta ribozyme (HdvRz,88bp)。HdvRz的自我剪切位點在其5 ‘-末端的鳥嘌呤之后的磷酸ニ酯鍵。使用PrimeSTARTMHS DNAPolymerase以保證序列的真實性。HdvRz 的序列(88bp)
5' -GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTC GGATGGCTAAGGGAGGGCG-3‘ (SEQ ID NO :9)。引入核酶引物 上游引物 DNA3HDRZ15 ‘ -GGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGCTGATCAGCCTCGACTGTGC-3 ‘ (SEQ ID NO 1)下劃線為pCDNA3序列，其它為HDVRZ ； DNA3HDRZ2
5 ‘ -TCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCG-3‘ (SEQ ID NO
2)
DNA3HDRZ3
5' -ATTTAAATGCGGCCGCGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTC-3' (SEQ ID NO 3)下劃線部分依次為Smi I和Not I序列，其它為DNA3HDRZ2重復序列。下游引物 DNA3B
5' -TTAATTAAGCTAGCAGTTAGCCAGAGAGCTCTGC-3' (SEQ ID NO :4)雙線為 pCDNA3TATA 盒后序列，下劃依次為PacI、NheI、NotI序列。多重PCR的步驟如下
1)第一歩PCR以pCDNA3為模板，以DNA3HDRZ1和DNAIBB為引物。PCR程序是95°C5min ； 98°C 10s，55°C 15s，72°C 4min，30 個循環；72°C IOmin0 得到的 PCR 產物命名為 pHDRZl ；
2)第二步PCR以pHDRZl為模板，以DNA3HDRZ2和DNAIBB為引物。PCR程序是95°C5min ； 98°C 10s，55°C 15s，72°C 4min，30 個循環；72°C IOmin0 得到的 PCR 產物命名為 pHDRZ2 ；
3)第三步PCR以pHDRZ2為模板，以DNA3HDRZ3和DNAIBB為引物。PCR程序是95°C5min ； 98°C 10s，59°C 15s，72°C 4min，30 個循環；72°C IOmin0 得到的 PCR產物命名為 pCDNA-HDRZ ；
膠回收pCDNA-HDRZ連接pMD18_T載體，轉化，挑單菌落，鑒定陽性克隆，送hvitrogen 測序。陽性質粒命名為pMD-pCDNA-HDRZ。pHDRZ 1、pHDRZ2、pCDNA-HDRZ 的電泳圖如圖 3所示。圖中，1 3 為 PCR產物pHDRZ 1、 pHDRZ2、pCDNA-HDRZ，M 為 Marker。全基因組真核表達載體的構建
用NotI和SacI處理pMD-pCDNA-HDRZ，得到含有NotI和SacI兩個酶切位點的 pCDNA-HDRZ表達載體，純化后-20 °C保存備用，用Hind III處理用I^rime STAR HS DNA Polymerase擴增得到的FCV全長片段，FCV變成前后兩個片段FCVqian(3. 2k)和 FCVhou (4. 7k)，FCVqian 再用 Sac I 和 Hind III 處理，FCVhou 用 Hind III 和 Not I 處理， 分別純化后與之前經Not I和Sac I處理過的ρ⑶NA-HDRZ載體，連接、轉化、鑒定，陽性命名為 pCDNA-HDRZ-FCV。得到的載體ρ⑶NA-HDRZ-FCV可用于外源蛋白的表達。病毒的拯救
因為FCV可以在細胞上培養，所以可以直接在敏感的細胞系中拯救病毒。方法采用脂質體轉染法將FCV全基因組真核表達載體ρ⑶NA-HDRZ-FCV轉染F81細胞。感染性克隆的鑒定轉染敏感細胞
轉染后繼續培養，觀察細胞病變的出現情況。至少盲傳三代，若出現典型的細胞病變則繼續傳代。盲傳三代后收獲出現CPE的細胞培養物，反復凍融三次后，抽提病毒總RNA，然后用特異引物進行RT-PCR，如果能擴增到特異性條帶，則證明被檢細胞中含有拯救的病毒。拯救病毒與親本病毒的區別鑒定
由于在構建感染性克隆的時候，預先在病毒的cDNA序列中插入了 ー個“遺傳標志”(genetic marker)即分子標簽-限制性內切酶Mlu I，該酶切位點。通過對該分子標簽的檢測，將由感染性克隆衍生的病毒與野生型病毒區分開來。首先用特異性引物將含有該酶切位點的片段擴增出來，然后用Mlu I消化此片段，結果預期可產生兩個片段。而野生型病毒的相應擴增片段中不含有Mlu I酶切位點，則不能被切割，從而將兩者區別開來。將拯救出來的病毒命名為rmFCV。拯救毒與親本毒復制動力學比較
按常法滴定拯救毒rmFCV和親本毒FCV的TCID5tl效價，然后做病毒復制動力學實驗，具體步驟如下
①F81鋪滿單層時，棄去培養液，用PBS液洗三次，將拯救毒rmFCV和親本毒FCV分別接種，接種量為IOOTCID5q 100 μ L，置37°C、5 % CO2孵育Ih后，棄去病毒液，再用PBS液洗三次，加入8mL細胞維持液(含1 % FBS和100U/mL雙抗的1640)，置37°C CO2培養箱中培
芥；
②于8h，16h，24h,32h,40h,48h分別取細胞上清200 μ L，滴定其TCID5tl效價；
③接毒、取樣、TCID5tl效價測定均重復3次，統計分析后，繪制病毒復制動力曲線圖。其動カ曲線圖如圖4所示。由圖可知，拯救毒rmFCV與親本毒FCV具有基本一致的復制動力學曲線。
權利要求
1.貓杯狀病毒感染性克隆，通過在FCV病毒的全長cDNA的兩端連接酶切位點，之后將序列連接到表達載體中得到。
2.根據權利要求1所述的貓杯狀病毒感染性克隆，其特征在于表達載體為去除了fl、 ori、SV40、neo、plyA序列的商品化質粒pcDNA3。
3.根據權利要求1或2所述的貓杯狀病毒感染性克隆，其特征在于表達載體的3’端連接有核酶。
4.根據權利要求3所述的貓杯狀病毒感染性克隆，其特征在于核酶為自剪切型核酶。
5.貓杯狀病毒感染性克隆的構建方法，包括以下步驟1)使用PCR法擴增FCV全長cDNA，并在兩端引入酶切位點；2)將商品化質粒pcDNA3的fl、ori、SV40、neo、plyA序列去除，得到改造質粒；3)在改造質粒上引入核酶序列；4)克隆出FCV全長基因組并連接到真核表達載體ρ⑶NA中，得到貓杯狀病毒感染性克隆。
6.根據權利要求5所述貓杯狀病毒感染性克隆的構建方法，其特征在于引入核酶序列時包括如下步驟1)以pCDNA3為模板以DNA3HDRZ1和DNAIBB為引物，進行PCR，PCR程序是95°C5min ； 98°C 10s，55°C 15s，72°C 4min，30 個循環；72°C lOmin，得到 PCR 產物 pHDRZl ；2)以pHDRZl 為模板，以 DNA3HDRZ2 和 DNAiBB 為引物，PCR程序是:95°C 5min ；98°C 10s, 55°C 15s，72°C 4min,30 個循環；72°C lOmin，得到的 PCR 產物命名為 pHDRZ2 ；3)以pHDRZ2 為模板，以 DNA3HDR^3 和 DNA;3B 為引物，PCR程序是95°C 5min ；98°C 10s, 59°C 15s，72°C 4min，30 個循環；72°C lOmin，得到的 PCR 產物命名為 pCDNA-HDRZ ；4)膠回收ρ⑶NA-HDRZ連接pMD18_T載體，轉化，得到改造載體； 其中，引物的序列為DNA3HDRZ1 5 ‘ -GGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGCTGATCAGCCTCGACTGTGC 3' ；(SEQ ID NO 1) DNA3HDRZ2 5 ‘ -TCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTC CACTCG-3 ‘ ；(SEQ ID NO 2)DNA3HDRZ3 5' -ATTTAAATGCGGCCGCGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTC-3' (SEQ ID NO 3) DNA3B 5' - TTAATTAAGCTAGCAGTTAGCCAGAGAGCTCTGC-3’ (SEQ ID NO :4)。
7.權利要求2所述貓杯狀病毒感染性克隆在表達外源蛋白的應用。
全文摘要
本發明公開了貓杯狀病毒感染性克隆，通過在FCV病毒的全長cDNA的兩端連接酶切位點，之后將序列連接到表達載體中得到。實驗結果表明，使用本發明克隆生產得到的FCV，與親本毒具有相似的特性，具有很好地感染性，可使細胞明顯變性，滴度高，傳代穩定。
文檔編號C12N15/66GK102559757SQ20121000485
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月6日 優先權日2012年1月6日
發明者向華, 徐敏, 陳晶, 黃元 申請人:廣東省農業科學院獸醫研究所