專利名稱：一種c8:0/c10:0/c12:0/c14:0中鏈脂肪酸及其乙酯的生產方法
技術領域：
本發明屬于生物化工領域，特別涉及一種C8:0/C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸
及其乙酯的生產方法。
背景技術：
生物柴油作為化石能源的可替代品，具有安全、可生物降解、燃燒完全等優點，已受到許多國家的高度關注與重視。2010年，全球生物柴油產量約為1700萬噸，并呈現持續增長的趨勢。目前，生物柴油主要利用動、植物油脂、油脂精練后的下腳料、油泥以及城市潲水油、油炸食品后的廢油等，經改性處理，在催化劑催化下與短鏈醇如甲醇或乙醇等復合而成。生物柴油的主要成分是脂肪酸短鏈酯，如脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯等。原料成本和生產工藝是制約生物柴油生產的兩大因素。生物柴油的生產原料目前大多是采用植物油脂和少量動物油脂，如豆油(主要是美國采用)、菜籽油(歐洲采用)、棕櫚油(印度尼西亞)和廢油(日本)等。我國主要使用地溝油和酸化油作為原料生產生物柴油(譚天偉等，2002)。原料不足是制約生物柴油規模化生產的關鍵因素，原料成本已占生物柴油生產成本的75%以上，而且，大量種植含油植物存在與農業爭地、破壞生物多樣性等問題。自20世紀90年代以來，利用微生物或藻類發酵生產油脂成為燃料油脂研究的重要方向和熱點領域。清華大學吳慶余等利用氮限制培養異養微藻脂，油脂含量達到50%以上，但微藻培養存在生物量小(10-20g/L)、培養周期長等不足，而微生物具有代謝旺盛、培養周期短、易于實現大規模生產等優點。通過優化發酵工藝，微生物的油脂產量可達菌體干重的50-70% (施安輝等，2003 ;Papanikolaou S et al.，2004)。微生物油脂在脂肪酸組成上同植物油相似，是生產生物柴油的潛在原料。利用微生物培養生產油脂，是可持續發展的必然，也必將成為生物柴油合成的新方向(趙宗保，2005 ;黃英明等，2006 ；Eric J. Steen et al. , 2010)。目前國內生物柴油主要原料來自地溝油，主要組分是長鏈脂肪酸(C16:0-C18:0)， 低溫性能較差，不適合我國北方地區的冬季使用。添加部分中鏈脂肪酸乙酯可以有效改善生物柴油的低溫性能，擴大其使用范圍。另外，中鏈脂肪酸(C8:0-C14:0)亦用于化妝品、潤滑油基礎油等，應用范圍廣，市場前景大。但目前中鏈脂肪酸多為從植物種子提取，來源有限，而且價格較高。微生物油脂多為胞內產物，必須從組織、細胞中分離后，才能用于油脂原料及生物柴油生產，而且長鏈脂肪酸居多，這一過程關系油脂成分及生物柴油的質量與成本。隨著現代分子生物學尤其合成生物學的發展，通過基因工程的手段，調控脂肪酸合成的相關酶的表達，增加特異性鏈長脂肪酸的產量，進而合成脂肪酸乙酯，是微生物合成特定油脂及生物柴油的前沿技術。該方法既可以解決生物柴油的原料問題，又可以解決生產工藝步驟多、酶易失活等問題。與其它菌株相比，大腸桿菌具有遺傳背景清楚、易于改造、生長速度快、適合高密度發酵等優點，是微生物法合成化學品和燃料的理想菌株。利用大腸桿菌生產高附加值脂肪酸和生物柴油是不爭地、不靠天、可持續生產的新途徑。與公知技術相比，本發明具有以下優點(I)微生物油脂及生物柴油發酵生產周期短，不受場地、季節等因素的影響，不占用耕地資源，容易實現工業化生產。(2)脂肪酸及脂肪酸乙酯以游離方式分泌到細胞外，便于分離。(3)發酵液得到了高濃度的中鏈游離脂肪酸，克服了生物柴油生產中原料油脂的高成本、胞內油脂不易分離的問題。(4)直接發酵得到高濃度的脂肪酸乙酯，克服了生物柴油生產工藝復雜、成本高的問題。

發明內容
本發明的目的在于提供一種利用重組大腸桿菌(Escherichia coli)直接合成脂肪酸及其乙酯的可再生能源工藝路線，使微生物可以作為細胞工廠直接發酵生產脂肪酸及其乙酯。本發明首次采用三種植物萼距花屬植物(Cuphea hookeriana) /月桂樹 (Umbellularia californica)/ 香樟(Cinnamomum camphora)中具有不同特異性FAT (fatty acyl-acyl carrier protein thioesterase)家族中的硫酯酶基因 chFatB/ucFatB/ccFatB 來構建工程菌，即將基因chFatB/ucFatB/ccFatB克隆至表達載體pETDuet_l中，得到重組質粒pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB。將重組質粒分別轉入大腸桿菌 BL21 (DE3)中，IPTG誘導重組質粒表達，表達的硫酯酶特異性水解特定鏈長的脂酰ACP，即可分別制得C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸，其中pETDuet-chFatB重組大腸桿菌所產C8:0和ClO: O脂肪酸所占比例為5. 42 %與12. 6 % ；PETDuet-ucFatB重組大腸桿菌所產 C12:0脂肪酸所占比例為34. 52% ；PETDuet-ccFatB重組大腸桿菌所產C14:0脂肪酸所占比例為32. 21%。再異源表達來自不動桿菌ADPl (Acinetobacter baylyi)中的高度非特異性高度非特異性的雙功能蠟酯合成酶(WS)/酰基輔酶A 二酰甘油酰基轉移酶，通過外源性流加乙醇的方式，催化脂肪酸代謝產物脂酰輔酶A與乙醇反應生成脂肪酸乙酯，即完成脂肪酸乙酯的生產新途徑。具體為將不動桿菌中酰基轉移酶基因atfA分別克隆至表達載體 pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB 中得到重組質粒 pETDuet-chFatB-atfA/pETDuet-ucFatB-atfA/pETDuet-ccFatB-atfA。將重組質粒分別轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導重組質粒表達，表達的硫酯酶特異性水解特定鏈長的脂酰ACP，分別得到C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸；這些中鏈脂肪酸會在胞內形成脂酰-CoA，共同表達的酰基轉移酶利用外源性流加的乙醇(1% -5% )與中鏈脂酰-CoA發生酰基轉移反應合成脂肪酸乙醇酯，得到利用重組大腸桿菌直接合成CS: 0-C10:0/C12:0/ C14:0中鏈脂肪酸乙醇酯的可再生資源工藝路線。本發明中硫酯酶特征在于通過特異性催化C8:0/C10:0/C12:0/C14:0脂酰ACP水
解來提高大腸桿菌體內脂肪酸的含量；高度非特異性酰基轉移酶的特性在于可催化脂酰 CoA與任意結構的醇類(包括乙醇)發生酰基轉移反應生成脂肪酸乙醇酯。本發明首次克隆并表達來自萼距花屬植物/月桂樹/香樟中的特異性硫酯酶基因生產中鏈脂肪酸及其乙酯，可以有效改善生物柴油的低溫性能，且發酵原料易得，可再生； 產物可直接分泌至胞外，產物提取工藝簡單，大大降低成本，簡化了生產工藝。


圖I :DNA瓊脂糖凝膠電泳。左側純化后的萼距花屬植物中硫酯酶基因PCR產物， 1248bp。右側為DNA大小標準品。圖2 :構建的重組載體pETDuet-chFatB的圖譜，chFatB基因克隆于pETDuet-Ι載體，基因兩端帶有NdeI和EcoRV位點。圖3 =DNA瓊脂糖凝膠電泳。右側純化后的月桂樹中硫酯酶基因PCR產物，1149bp。 左側為DNA大小標準品。圖4 :構建的重組載體pETDuet-ucFatB的圖譜，UcFatB基因克隆于pETDuet-Ι載體，基因兩端帶有NdeI和EcoRV位點。圖5 =DNA瓊脂糖凝膠電泳。右側純化后的香樟中硫酯酶基因PCR產物，1149bp。 左側為DNA大小標準品。圖6 :構建的重組載體pETDuet-ccFatB的圖譜，ccFatB基因克隆于pETDuet-Ι載體，基因兩端帶有NdeI和EcoRV位點。圖7 =DNA瓊脂糖凝膠電泳。左側純化后的不動桿菌中酰基轉移酶基因PCR產物， 1377bp。右側為DNA大小標準品。圖8 :構建的重組載體pETDuet-chFatB-atfA的圖譜，atfA基因克隆于 pETDuet-chFatB載體，基因兩端帶有NcoI和EcoRI位點。圖9 :構建的重組載體pETDuet-ucFatB-atfA的圖譜，atfA基因克隆于 pETDuet-ucFatB載體，基因兩端帶有NcoI和EcoRI位點。圖10 :構建的重組載體pETDuet-ccFatB-atfA的圖譜，atfA基因克隆于 pETDuet-ccFatB載體，基因兩端帶有NcoI和EcoRI位點。圖11、圖12、圖13 :分別表示含有重組質粒pETDuet-chFatB-atfA、 pETDuet-ucFatB-atfA、pETDuet-ccFatB-atfA三株工程大腸桿菌經誘導后，其培養液中脂肪酸乙酯的生產情況；C8:0表不Octanoic acid, ethyl ester ;C10:0表不Decanoic acid, ethyl ester ；C12:0 表不 Dodecanoic acid, ethylester ；C14:0 表不 Tetradecanoic acid, ethylester ;C16:0 表不 Hexadecanoic acid, ethylester ;C18:1 表不 Oleic acid, ethylester ;C18:0 表不 Octadecanoic acid, ethyl ester。
具體實施例方式本發明提供的一種利用重組大腸桿菌直接合成脂肪酸乙酯的可再生能源工藝路線，使脂肪酸得到有效利用。本發明通過以下技術方案解決這一技術問題先針對來自萼距花屬植物中的硫酯酶基因(ChFatB)/月桂樹中的硫酯酶基因(UcFatB)/香樟中的硫酯酶基因(ccFatB)進行密碼子優化,然后利用全基因合成方法分別合成chFatB/ucFatB/ccFatB 基因，并以不動桿菌基因組DNA為模板，分別設計相應的引物并添加特殊的酶切位點，PCR 擴增后瓊脂糖凝膠回收獲得目的基因DNA片段，酶切后連接至雙啟動子pET載體上，轉化到大腸桿菌中，篩選獲得陽性重組質粒，質粒經純化、電泳檢測、測序鑒定目的基因。重組質粒在大腸桿菌中誘導表達與外源性流加乙醇后，繼續培養，在重組大腸桿菌體內和發酵液中均可獲得中鏈脂肪酸乙酯。本發明提供的方法，大腸桿菌中表達特異性調控中鏈脂肪酸合成及酰基轉移反應的關鍵酶基因，可高密度發酵且生長速度快，為高品質的中鏈脂肪酸乙酯合成開辟途徑。實驗步驟I)采用的菌種不動桿菌ADPl (Acinetobacter baylyi ；ATCC :33305)大腸桿菌BL21 (DE3)2)采用的培養基LB培養基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，121°C濕熱滅菌20min)， 若配制平板培養基，則需加入I. 5%瓊脂粉；選擇性LB培養基50ml的LB培養基中加入 50 μ L左右O. I %的氨芐青霉素溶液；腦心浸液培養基(心提取物5. Og/L,腦提取物12. 5g/L，示胨10. Og/L,葡萄糖
2.0g/L,NaCl 5. 0g/L,Na2HP04 2. 5g/L，pH7. 4，115°C濕熱滅菌 20min)，若配制平板培養基， 則需加入I. 5%瓊脂粉。3)實驗方法分別以全基因合成技術所合成的一個來自萼距花屬植物(Cuphea hookeriana)/ 月桂樹(Umbellularia californica)/ 香樟(Cinnamomum camphora)中的硫酯酶基因 DNA [acyl-acyl carrier protein (ACP) thioesterase]和利用博邁德試劑盒法所提取的不動桿菌ADP I (Acinetobacter baylyi)基因組DNA為模板，PCR擴增獲得帶有特殊酶切位點的硫酯酶基因和高度非特異性的雙功能蠟酯合成酶(WS) /酰基輔酶A 二酰甘油酰基轉移酶(wax ester synthase/acy I-CoA: diacy I glycerol acy I transferase)基因。用膠回收試劑盒回收目的片段，用相應的限制性內切酶分別酶切硫酯酶基因 chFatB/ucFatB/ccFatB片段和雙啟動子的原核表達載體pETDuet-Ι，并于16°C過夜連接， 即為構建好的原核表達載體pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB ;將構建好的重組質粒利用化學轉化方法(即42°C熱擊法)轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，即可獲得產硫酯酶的工程大腸桿菌。將工程大腸桿菌按I %的接種量接種到50mL LB液體培養基中，37°C快速振蕩培養，在培養液中加入誘導劑后繼續在37°C快速振蕩培養 3-5h，誘導表達目的蛋白；提取發酵液中脂肪酸，測定C8:0/C10:0/C12:0/C14:0特異性脂肪酸所占比例，即為制備好的中鏈脂肪酸。再利用相應的限制性內切酶分別酶切酰基轉移酶基因atfA片段和雙啟動子的原核表達載體 pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB,并于 16°C過夜連接，即為構建好的原核表達載體pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB ；將構建好的重組質粒利用化學轉化方法(即42°C熱擊法)轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中， 即可獲得產硫酯酶與酰基轉移酶的工程大腸桿菌。將工程大腸桿菌按I %的接種量接種到 50mL LB液體培養基中，37°C快速振蕩培養，在培養液中加入誘導劑與外源性流加乙醇后， 繼續在37°C快速振蕩培養3-5h，誘導表達目的蛋白；提取發酵液中脂肪酸乙酯，測定C8:0/ C10:0/C12:0/C14:0特異性脂肪酸乙酯所占比例，即為制備好的中鏈脂肪酸乙酯。下面結合實施例對本發明的具體方法做進一步的說明
實施例II脂肪酸調控相關基因-萼距花屬植物中硫酯酶的克隆與重組載體的構建I. I萼距花屬植物中硫酯酶基因的克隆利用全基因合成的方法合成萼距花屬植物(Cuphea hookeriana)中的硫酯酶基因 DNA (acy I-acy I carrier protein (ACP) thioesterase)。萼距花屬植物中 chFatB 編碼硫酯酶基因，該基因可特異性地將CS: 0-C10:0脂酰ACP水解為脂肪酸，即可在重組大腸桿菌體內獲得中鏈脂肪酸。以上述合成的萼距花屬植物中硫酯酶基因DNA為模板，根據GenBank序列設計引物，并添加相應的酶切位點(Nde I和EcoR V)與保護堿基，PCR擴增硫酯酶基因chFatB所用引物如下上游引物5，-GGAATTCCATATGGTTGCTGCGGCTGCCAGC-3’下游引物5’ -CGGGATATCTTAGCTAACGCTGTTACCG-3 ’PCR 反應體系含有 I μ L 基因組 DNA，10 μ L 2 XPfu Master Mix 引物各 O. 5 μ L，加雙蒸水補至20 μ L。反應條件為預變性94度3min，94度變性30s，退火55度30s，延伸72 度2min50s，循環30次，72度10min，4度保存。這樣就PCR擴增克隆到目的硫酯酶基因chFatB 該基因序列長度為1248bp，PCR擴增結束后對PCR產物進行I %的瓊脂糖凝膠電泳，所得到目的DNA條帶為1248bp(如圖I所示)，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因。I. 2 pETDuet-chFatB 重組載體的構建將克隆的chFatB基因與pETDuet-Ι載體(購于Novagen公司)用相同的酶(NdeI 和EcoRV)進行酶切，載體與外源基因片段按摩爾比I : 3-1 10的比例，16°C連接過夜， 對長出的單菌落進行菌落PCR與質粒酶切驗證，測序結果正確即獲得陽性重組載體。測定其序列如序列I所示，編碼如序列2所示的氨基酸序列。所構建的重組載體pETDuet-chFatB的圖譜(見圖2)。2含有萼距花屬植物硫酯酶基因chFatB工程大腸桿菌的構建將構建好的含有硫酯酶基因ChFatB重組載體42 °C熱擊轉化到大腸桿菌 BL21 (DE3)感受態細胞中，經菌落PCR鑒定、酶切鑒定、和測序鑒定篩選獲得陽性重組工程菌，即獲得了含有底物特異性的硫酯酶基因工程大腸桿菌，_80°C保存該菌株。實施例2I脂肪酸調控相關基因-月桂樹中硫酯酶的克隆與重組載體的構建I. I月桂樹中硫酯酶基因的克隆利用全基因合成的方法合成月桂樹(Umbellularia californica)中的硫酯酶基因 DNA (acy I-acy I carrier protein (ACP) thioesterase)。月桂樹中 UcFatB 編碼硫酯酶基因，該基因可特異性地將C12:0脂酰ACP水解為脂肪酸，即可在重組大腸桿菌體內獲得單一的中鏈脂肪酸。以上述合成的月桂樹中硫酯酶基因DNA為模板，根據GenBank序列設計引物，并添加相應的酶切位點(Nde I和EcoR V)與保護堿基，PCR擴增硫酯酶基因UcFatB所用引物如下
上游引物5’-GGAATTCCATATGGCTACCACCTCTCTGGCCAG-3’下游引物5，-CGGGATATCTTAAACACGCGGTTCCGC-3，PCR 反應體系含有 I μ L 基因組 DNA，10 μ L 2 XPfu Master Mix 引物各 O. 5 μ L，加雙蒸水補至20 μ L。反應條件為預變性94度3min，94度變性30s，退火55度30s，延伸72 度2min30s,循環30次,72度IOmin, 4度保存。這樣就PCR擴增克隆到目的硫酯酶基因UcFatB 該基因序列長度為1149bp，PCR擴增結束后對PCR產物進行I %的瓊脂糖凝膠電泳，所得到目的DNA條帶為1149bp (如圖3所示)，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因。I. 2 pETDuet-ucFatB 重組載體的構建將克隆的UcFatB基因與pETDuet_l載體(購于Novagen公司)用相同的酶(Nde I和EcoR V)進行酶切，載體與外源基因片段按摩爾比I : 3-1 10的比例，16°C連接過夜，對長出的單菌落進行菌落PCR與質粒酶切驗證，測序結果正確即獲得陽性重組載體。測定其序列如序列3所示，編碼如序列4所示的氨基酸序列。所構建的重組載體pETDuet-ucFatB的圖譜(見圖4)。2含有月桂樹中硫酯酶基因UcFatB工程大腸桿菌的構建將構建好的含有硫酯酶基因UcFatB重組載體42 °C熱擊轉化到大腸桿菌 BL21 (DE3)感受態細胞中，經菌落PCR鑒定、酶切鑒定、和測序鑒定篩選獲得陽性重組工程菌，即獲得了含有底物特異性的硫酯酶基因工程大腸桿菌，_80°C保存該菌株。實施例3I脂肪酸調控相關基因-香樟中硫酯酶的克隆與重組載體的構建I. I香樟中硫酯酶基因的克隆利用全基因合成的方法合成香樟(Cinnamomum camphora)中的硫酯酶基因 DNA (acy I-acy I carrier protein (ACP) thioesterase)。香樟中 ccFatB 編碼硫酯酶基因，該基因可特異性地將C14:0脂酰ACP水解為脂肪酸，即可在重組大腸桿菌體內獲得中鏈脂肪酸。以上述合成的香樟中硫酯酶基因DNA為模板，根據GenBank序列設計引物，并添加相應的酶切位點(Nde I和EcoR V)與保護堿基，PCR擴增硫酯酶基因ccFatB所用引物如下上游引物5’ -GGAATTCCATATGGCCACTACCAGCCTGGCCA-3 ’下游引物5’-CGGGATATCTTACACGCTGCTTTCCGCCG-3’PCR 反應體系含有 I μ L 基因組 DNA，10 μ L 2 XPfu Master Mix 引物各 O. 5 μ L，加雙蒸水補至20 μ L。反應條件為預變性94度3min，94度變性30s，退火55度30s，延伸72 度2min30s,循環30次,72度IOmin, 4度保存。這樣就PCR擴增克隆到目的硫酯酶基因ccFatB 該基因序列長度為1149bp，PCR擴增結束后對PCR產物進行I %的瓊脂糖凝膠電泳，所得到目的DNA條帶為1149bp (如圖5所示)，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因。I. 2 pETDuet-ccFatB 重組載體的構建
將克隆的ccFatB基因與pETDuet-Ι載體(購于Novagen公司)用相同的酶(Nde I和EcoR V)進行酶切，載體與外源基因片段按摩爾比I : 3-1 10的比例，16°C連接過夜，對長出的單菌落進行菌落PCR與質粒酶切驗證，測序結果正確即獲得陽性重組載體。測定其序列如序列5所示，編碼如序列6所示的氨基酸序列。所構建的重組載體pETDuet-ccFatB的圖譜(見圖6)。2含有香樟中硫酯酶基因ccFatB工程大腸桿菌的構建將構建好的含有硫酯酶基因ccFatB重組載體42 °C熱擊轉化到大腸桿菌 BL21 (DE3)感受態細胞中，經菌落PCR鑒定、酶切鑒定、和測序鑒定篩選獲得陽性重組工程菌，即獲得了含有底物特異性的硫酯酶基因工程大腸桿菌，_80°C保存該菌株。實施例4中鏈脂肪酸的合成、提取與氣相檢測I游離中鏈脂肪酸的合成將工程大腸桿菌pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB 按 I % 的接種量接種到500mL LB液體培養液中(內含50 μ g .mr1的氨芐青霉素)，37°C，200rpm振蕩培養(約3h)，當0D600約為O. 4-0. 6時，在菌液中加入4mM誘導劑IPTG至終濃度Immol Γ1, 繼續在30°C條件下振蕩培養24h，培養液在SOOOrpm條件下，離心lOmin，取含有游離脂肪酸的上清液保存，為后續檢測工作做準備。2游離中鏈脂肪酸的提取提取20ml發酵液中游離脂肪酸，先加入2mL HCl充分混勻酸化，再加入20ml乙酸乙酯，在振蕩儀上振蕩15s，充分進行萃取，在提取過程中遵循少量多次的原則，5000r離心 lOmin，分離并收集有機層。再重復添加乙酸乙酯進行二次萃取。利用乙酸乙酯的易揮發性對萃取的脂肪酸進行濃縮。這樣即獲得一定濃度的游離中鏈脂肪酸。3游離中鏈脂肪酸的氣相檢測對乙酸乙酯所萃取的脂肪酸利用甲酯化試劑(三氟化硼/甲醇VBF3/V甲醇 =12.88)甲酯化之后進行氣相色譜分析，氣相色譜條件如下=RTX-WAX毛細管色譜柱 (30mX0. 32mmX0. 25 μ m)，載氣高純氦氣(99. 999%)，進樣器溫度220°C，檢測器溫度 250°C，載氣柱頭壓10psi ;程序升溫起始50°C，維持O. 5min ；25°C /min升溫至150°C， 保持Imin ;3°C/min升溫至220°C，保持lOmin。(結果見圖11，12，13)從最終氣相圖譜中可分析得出pETDuet-chFatB重組大腸桿菌所產特異性C8:0和ClO:O脂肪酸所占比例為5. 42%與12. 6%，其余的脂肪酸C12:0、C14:0、C16:0、C18:0和C18:1所占比例為 18. 77 %、17. 71 %,27. 41%,10. 7%111 % ;pETDuet_ucFatB 重組大腸桿菌所產特異性 C12:0脂肪酸所占比例為34. 52%，其余的脂肪酸C14:0、C16:0、C18:0和C18:1所占比例為24. 07%,27. 21%、10· 8%和 O. 76% ；pETDuet-ccFatB 重組大腸桿菌所產特異性 C14:0 脂肪酸所占比例為32. 21%，其余的脂肪酸C12: O、C16:0、C18:0和C18:l所占比例為 22. 36%,31. 48%、12. 01%和 I. 2% 0實施例5I酰基轉移酶基因的克隆與重組載體的構建I. I不動桿菌ADPl中酰基轉移酶基因的克隆與序列測定不動桿菌ADPl (Acinetobacter baylyi)購買自美國標準生物品收藏中心(ATCC33305)。利用腦心浸液瓊脂培養基活化菌種后，按I %的接種量接種于4ml LB液體試管培養基中，在37攝氏度搖床中培養12小時后，12000rpm離心Imin收集菌體。基因組DNA提取采用北京博邁德科技發展有限公司提供的細菌基因組提取試劑盒(具體方法參見說明書)。以上述所提取的不動桿菌基因組DNA為模板，根據GenBank序列設計引物，并添加相應的酶切位點與保護堿基，PCR擴增酰基轉移酶基因所用引物如下上游引物5，-CATGccatggGCCGCCCATTACATCCGATT-3’下游引物5’ -CCGgaattcTTAATTGGCTGTTTTAATATC-3 ’PCR 反應體系含有 I μ L 基因組 DNA，10 μ L 2 XPfu Master Mix 引物各 O. 5 μ L，加雙蒸水補至20 μ L。反應條件為預變性94度3min，94度變性30s，退火55度30s，延伸72 度3min,循環30次,72度IOmin, 4度保存。這樣就PCR擴增克隆到目的酰基轉移酶atfA基因該基因序列長度為1377bp，PCR擴增結束后對PCR產物進行I %的瓊脂糖凝膠電泳，所得到目的DNA條帶為1377bp (如圖7所示)，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因。I. 2 pETDuet-chFatB-atfA 重組載體的構建將克隆的atfA基因與測序驗證正確的pETDuet-chFatB載體(購于Novagen公司)用相同的酶(Nco I和EcoR I)進行酶切，37°C酶切3小時。載體與外源基因片段按摩爾比I : 3-1 10的比例，利用Fermentas的T4連接酶16°C連接過夜，用該連接產物轉化大腸桿菌ToplO感受態細胞，涂布帶有氨芐抗性LB瓊脂平板，37度過夜培養后，挑取適量單菌落，在LB培養基中過夜培養，用試劑盒提取質粒，測序驗證插入片段，并測定其序列如序列7所示，編碼如序列8所示的氨基酸序列。測序結果正確即獲得陽性重組載體。所構建的重組載體pETDuet-chFatB-atfA原理圖譜如圖8所示。I. 3 pETDuet-ucFatB-atfA 重組載體的構建將克隆的atfA基因與測序驗證正確的pETDuet-ucFatB載體(購于Novagen公司)用相同的酶(Nco I和EcoR I)進行酶切，37°C酶切3小時。載體與外源基因片段按摩爾比I : 3-1 10的比例，利用Fermentas的T4連接酶16°C連接過夜，用該連接產物轉化大腸桿菌ToplO感受態細胞，涂布帶有氨芐抗性LB瓊脂平板，37度過夜培養后，挑取適量單菌落，在LB培養基中過夜培養，用試劑盒提取質粒，測序驗證插入片段，并測定其序列如序列7所示，編碼如序列8所示的氨基酸序列。測序結果正確即獲得陽性重組載體。所構建的重組載體pETDuet-ucFatB-atfA原理圖譜如圖9所示。1. 4 pETDuet-ccFatB-atfA 重組載體的構建將克隆的atfA基因與測序驗證正確的pETDuet-ccFatB載體(購于Novagen公司)用相同的酶(Nco I和EcoR I)進行酶切，37°C酶切3小時。載體與外源基因片段按摩爾比I : 3-1 10的比例，利用Fermentas的T4連接酶16°C連接過夜，用該連接產物轉化大腸桿菌ToplO感受態細胞，涂布帶有氨芐抗性LB瓊脂平板，37度過夜培養后，挑取適量單菌落，在LB培養基中過夜培養，用試劑盒提取質粒，測序驗證插入片段，并測定其序列如序列7所示，編碼如序列8所示的氨基酸序列。測序結果正確即獲得陽性重組載體。所構建的重組載體pETDuet-ccFatB-atfA原理圖譜如圖10所示。2含有硫酯酶基因UcFatB與酰基轉移酶基因atfA工程大腸桿菌的構建將構建好的含有硫酯酶基因UCFatB與酰基轉移酶基因atfA重組表達載體42°C熱擊轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞中，即獲得了含有底物特異性硫酯酶基因和催化酰基轉移反應的酰基轉移酶基因的工程大腸桿菌，_80°C保存該菌株。實施例6I乙酸乙酯的合成、提取與氣相質譜檢測將工程大腸桿菌pETDuet-chFatB-atfA/pETDuet-ucFatB-atfA/ pETDuet-ccFatB-atfA按I %的接種量接種到500mL LB液體培養液中(內含50 μ g · πιΓ1 的氨芐青霉素)，37°C，200rpm振蕩培養(約3h)，當0D600約為O. 4-0. 6時，在菌液中加入誘導劑IPTG至終濃度Immol · L—1，再外源性流加2% (1% -5% )的乙醇至終濃度為
O.1% -O. 2%，繼續在25°C條件下振蕩培養24h。在上述發酵液中加入充足的乙酸乙酯，振蕩15s，進行充分萃取，50001■離心 lOmin，分離并收集有機層。對乙酸乙酯萃取的脂肪酸乙酯樣品進行GC檢測，氣相色譜條件為RTX-WAX毛細管色譜柱(30mXO. 32mmXO. 25 μ m)，載氣高純氦氣(99. 999%),進樣器溫度220°C,檢測器溫度250°C，載氣柱頭壓IOpsi ;程序升溫起始50°C，維持O. 5min ；25°C /min升溫至 150°C，保持lmin;3°C/min升溫至220°C，保持lOmin。(結果見圖11，12，13)從最終氣相圖譜中可分析得出pETDuet-chFatB-atfA重組大腸桿菌所產特異性C8:0和ClO:O脂肪酸乙酯所占比例為5. 42%與12. 6%，其余的C12:0、C14:0、C16:0、C18:0和C18:l脂肪酸乙酯所占比例為18. %Λ . 71%,27. 41%,10. 7%I. 11% ；pETDuet-ucFatB-atfA 重組大腸桿菌所產特異性C12:0脂肪酸乙酯所占比例為34. 52%，其余C14:0、C16:0、C18:0和 C18:1 脂肪酸乙酯所占比例為24. 07%,27. 21%,10. 8%和 O. 76% ；pETDuet-ccFatB-atfA 重組大腸桿菌所產特異性C14:0脂肪酸乙酯所占比例為32. 21 %，其余C12:0、C16:0、 C18:0和C18:1脂肪酸乙酯所占比例為22. 36%,31. 48%U2. 01%和I. 2%0
權利要求
1.一種C8:0/C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸及其乙酯的生產方法，其特征在于，包括步驟I、分別將萼距花屬植物/月桂樹/香樟中來自脂酰酰基轉運蛋白硫酯酶(FAT)家族中具有不同特異性硫酯酶基因chFatB/ucFatB/ccFatB克隆至原核表達載體,得到重組質粒轉至BL21 (DE3)中，經IPTG誘導表達生產中鏈脂肪酸。步驟2、再將不動桿菌中高度非特異性的雙功能蠟酯合成酶/酰基輔酶A 二酰甘油酰基轉移酶基因atfA分別克隆至已連接硫酯酶基因chFatB/ucFatB/ccFatB的原核表達載體， 得到重組質粒轉至BL21 (DE3)中，經外源性流加乙醇與IPTG誘導表達后生產中鏈脂肪酸乙醇酯。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所表達的來自萼距花屬植物/月桂樹/ 香樟中FAT家族硫酯酶可特異性水解特定鏈長的脂酰ACP，分別得到C8:0-C10:0/C12:0/ C14:0中鏈脂肪酸。
3.根據權利要求I所述方法，其特征在于，所表達的來自不動桿菌中高度非特異性的雙功能蠟酯合成酶/酰基輔酶A二酰甘油酰基轉移酶可催化外源性流加的乙醇(1% -5% ) 與胞內形成的中鏈脂酰-Cok發生酰基轉移反應合成特定的C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸乙醇酯。
4.根據權利要求I所述方法，其特征在于，所述chFatB/ucFatB/ccFatB基因克隆至雙啟動子原核表達載體pETDuet-Ι,得到重組質粒pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/ pETDuet-ccFatB。其中硫酯酶基因置于T7promoter 2下游，由T7啟動子驅動表達。
5.根據權利要求I所述方法，其特征在于，所述atfA基因克隆至雙啟動子原核表達載體 pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB,得到重組質粒 pETDuet-chFatB-atfA/pETDuet-ucFatB-atfA/pETDuet-ccFatB-atfA。其中酸基轉移酶基因置于T7promoter I下游，由T7啟動子驅動表達。
6.根據權利要求I所述方法，其特征在于，已轉入重組質粒pETDuet-chFatB/ pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB 的重組大腸桿菌，經添加 O. 2-0. 48mM IPTG 誘導硫酯酶表達后，可特異性水解特定鏈長的脂酰ACP，分別得到C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸，其中pETDuet-chFatB重組大腸桿菌所產C8:0和C10:0脂肪酸所占比例為5.42%% 12. 6% ；PETDuet-ucFatB重組大腸桿菌所產C12:0脂肪酸所占比例為34. 52% ； pETDuet-ccFatB重組大腸桿菌所產C14:0脂肪酸所占比例為32. 21%。
7.根據權利要求I所述方法，其特征在于，已轉入重組質粒pETDuet-chFatB-atfA/ pETDuet-ucFatB-atfA/pETDuet-ccFatB-atfA 的重組大腸桿菌，經添加 O. 2-0. 48mM IPTG 誘導硫酯酶和酰基轉移酶表達與外源性流加1% -5%乙醇后，可催化乙醇與相應的中鏈脂酰-Cok發生酰基轉移反應合成特定的C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸乙醇酯。
8.根據權利要求I所述方法，其特征在于，所述的來自萼距花屬植物/月桂樹/香樟中 FAT家族硫酯酶的核酸序列如序列1/3/5所示，各自所編碼氨基酸序列如序列2/4/6所示。
9.根據權利要求I所述方法，其特征在于，所述來自不動桿菌中高度非特異性的雙功能蠟酯合成酶/酰基輔酶A 二酰甘油酰基轉移酶的核酸序列如序列7所示，所編碼氨基酸序列如序列8所示。
全文摘要
本發明涉及一種利用工程大腸桿菌合成C8:0/C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸及其乙酯的生產方法。具體步驟為將萼距花屬植物/月桂樹/香樟中具有不同特異性硫酯酶基因chFatB/ucFatB/ccFatB克隆至表達載體pETDuet-1中得到相應重組質粒。將重組質粒轉入大腸桿菌BL21，IPTG誘導表達，表達的硫酯酶特異性水解特定鏈長的脂酰ACP得到中鏈脂肪酸；分別將不動桿菌中酰基轉移酶基因atfA克隆至表達載體pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB中得到相應重組質粒。將重組質粒轉入大腸桿菌BL21，IPTG誘導表達，共表達的酰基轉移酶利用外源性流加的乙醇與中鏈脂肪酸在胞內形成的脂酰-CoA發生酰基轉移反應合成脂肪酸乙酯，得到利用重組大腸桿菌直接合成中鏈脂肪酸及其乙酯的工藝路線。
文檔編號C12P7/62GK102586350SQ20121000479
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者劉軍鋒, 劉珞, 王芳, 范麗蘋, 譚天偉, 鄧利 申請人:北京化工大學