專利名稱：一種重組人巨細胞病毒蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程、疫苗研制和診斷試劑等領域，具體地涉及一種人巨細胞病毒蛋白及其應用。
背景技術：
人巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus，簡稱HCMV)屬皰疹病毒β亞科，是一種DNA病毒，其感染在人群中廣泛存在，我國人群中HCMV感染相當嚴重。婦女在妊娠初期受HCMV原發感染是引起胎兒宮內感染和發育缺損的重要原因，在孕期原發性感染HCMV的胎兒和新生兒中，80%可導致智力低下、畸形和死亡[Middeldorp JM. Jongsma J，Haar AT, et al.Detection of immunoglobulin M and G antibodies against cytomegalovirus early and late antigend by enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin. Microbiol, 1984 ；20 (4) :763-771. ]。HCMV也是器官移植失敗和艾滋病病人并發感染死亡的主要原因之一。對非免疫缺陷者常導致長期隱性感染，甚至引起感染細胞的轉化、畸變或癌變等 [Huang ES.The pathogenicity of Human Cytomegalovirus. Springer-Vellag.Berin， 1993，1-45]。因此快速準確的診斷HCMV病毒感染具有十分重要的意義。目前巨細胞病毒感染診斷方法有脫落細胞及組織病理檢查、病毒分離、分子雜交試驗和血清學檢查，但由于前三種方法技術設備要求高，檢測周期長的局限性，無法廣泛使用，而血清學檢查具有簡便快速的特性使其在臨床上得到廣泛應用，目前大多檢測試劑采用盒用的HCMV蛋白質抗原主要是來源于病毒培養物或是重組表達的單一蛋白片段，或者由于蛋白質抗原純度低及特異性差，造成假陽性而降低檢測特異性；或者由于單一片段抗原蛋白所含抗原決定簇較少，所識別的抗體相應較少，易造成假陰性而降低檢測敏感性，雖然多種單一片段組合制備檢測試劑也可以避免上述問題，但必然要求多次進行提取純化過程，而且小分子蛋白質或多肽的提純技術要求更高，工作效率太低。另外，在全球范圍內，目前缺乏有效治療病毒感染藥物的情況下，通過接種疫苗預防病毒感染成為一種重要的醫學干預手段，HCMV疫苗的研制也是進行HCMV研究的重要領域之一，而疫苗研究的一個重要前提是其所用蛋白質抗原應具有高特異性、強免疫原性和盡量完整的抗原決定簇，因此開發一種多抗原決定簇串聯的重組蛋白質技術是十分必要的。

發明內容
(一)要解決的技術問題本發明的目的是提供一種重組人巨細胞病毒蛋白，本發明的另一目的是提供該重組人巨細胞病毒蛋白在制備檢測試劑盒中的應用。(二)本發明的技術方案本發明提供了一種編碼人巨細胞病毒蛋白的重組DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。同時提供了由該重組DNA序列編碼的人巨細胞病毒蛋白，其氨基酸序列如SEQ
3ID NO 2 所示。本發明還提供了一種人巨細胞病毒蛋白的表達載體pETj8a-HCMV，它是將SEQ ID NO 1所示所述的重組DNA序列插入到質粒pET-28a上得到的重組質粒，其質粒圖譜如附圖 2所示。將表達載體pET18a-HCMV導入大腸桿菌中，得到表達人巨細胞病毒蛋白的工程菌株。本發明利用SEQ ID NO :1所示核苷酸序列通過基因工程方法制備人巨細胞病毒蛋白可以通過如下步驟實現1)獲得具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；2)將該核苷酸序列導入質粒，優選pET_28a質粒；3)將該質粒導入原核宿主細胞，優選大腸桿菌宿主細胞，更優選BL21(DE3)菌株中；4)在有利于所述核苷酸序列表達的條件下培養所述宿主細胞；5)回收、純化及復性所表達的重組蛋白。本發明提供的檢測人巨細胞病毒感染的試劑盒，其組分中的抗原是本發明所述的重組人單純皰疹病毒蛋白。用于標記人巨細胞病毒蛋白的標記物選白自制膠體金、辣根過氧化物酶(HRP)。本發明所述的采用膠體金標記抗原的試劑盒中，抗人IgG抗體劃線包被濃度為 2. Omg/ml,HCMV抗原膠體金復合物在濃縮原液到稀釋一倍之間包被載金墊?？谷薎gG抗體劃線量為1. 0μ 1/cm，膠體金結合物噴點量為25. 0μ 1/cm。兔抗巨細胞病毒抗體包被量為 1. 0 μ 1/cm,包被濃度為 5. Omg/ml。以下將更詳細的描述本發明的技術方案本發明公開了一種編碼人巨細胞病毒蛋白的如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列， 利用該核苷酸序列制備人巨細胞病毒蛋白的方法，由該方法制備的包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的人巨細胞病毒蛋白，以及包含該蛋白的組合物和試劑盒，同時還公開了它們在檢測人巨細胞病毒感染的應用。SEQ ID NO :1所示核苷酸序列可以通過本領域常規的方法制備，優選根據目的片段的DNA序列，即HCMV ppl50和pp65上目的肽段的cDNA序列和質粒上的酶切位點，設計兩對PCR引物(P1，P2)和(P3，P4)。pi和p2用于擴增ppl50第1447位到第2046位核苷酸， P3和p4用于擴增pp65第1069位到第1635核苷酸；引物pi和p4分別帶有NdeI和XhoI 的酶切位點，引物P2和p3順序互補，并共同對應于ppl50上述片段的3’末端和pp65上述片段的5’末端序列。引物序列如下Pl:ATCGCATATGGGTGACGGGCGGTTTGGCGP2 GAAGAGGAAAAGCGTCGCGAGCGGCAGP3 :TCGCGACGCTTTTCCTCTTCGTCGTAGCAAACCAGCTCGTP4 :ATCGCTCGAGTTAGGGCACGTGCTGATAGCCGTGTTT以人巨細胞病毒培養物為模板，以引物Pl和P2擴增ppl50片段，以引物P3和P4 擴增pp65片段；再以第一輪PCR擴增得到的ppl50片段和pp65片段為模板，加入引物Pl 和P4，擴增pp 150pp65片段；得到串聯的目的基因重組片段pp 150pp65。
本發明對上述核苷酸序列的核酸分子采用適當載體和宿主細胞表達時可以大大提高表達產率。本發明的一個實施方案涉及應用如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列制備人巨細胞病毒蛋白的方法。根據常規方法，可將含編碼人巨細胞病毒蛋白的如SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的核酸分子連接到一個表達載體中，然后通過常規方法轉化細胞。通常，優選原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本發明的載體構建。例如，大腸桿菌等腸科桿菌。編碼本發明蛋白的核酸與pET_28a形成的雜合質粒具有高度的穩定性，有利于本發明的蛋白的表達。在本發明的一個實施方案中，如圖2所示，制備含有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的核酸分子和pETj8a質粒的表達構建體，并將該構建體轉化BL21 (DE3)，經IPTG誘導培養后，收集菌體?？刹捎贸Ｒ幍募兓椒兓玫降牡鞍?。本發明的一個實施方案涉及用上述方法制備、純化的人巨細胞病毒蛋白，該蛋白具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列。本發明的一個實施方案涉及包含本發明人巨細胞病毒蛋白的組合物和試劑盒。所述組合物或試劑盒可制備成檢測人單純皰疹病毒感染的試劑或試劑盒形式，在臨床上用于方便、快速和準確的巨細胞病毒感染。任何生物學樣品，只要它們含有人巨細胞病毒抗體， 就可用本發明蛋白，包含該蛋白的組合物或試劑盒來檢測。本文所述“試劑盒”是指利用本發明蛋白完成人巨細胞病毒感染檢測而組配制成的成套試劑。該試劑盒用于診斷人巨細胞病毒感染。本發明試劑盒可包括其它多個容器， 其中可分別含有檢測所用的標準品，抗體或經過標記的抗體、酶，底物或緩沖液等。在該試劑盒中，還包括標簽和包裝插頁用以提供試劑盒的使用說明。還可包括符合用戶需要的其它材料，如微量滴定板等。在用于人巨細胞病毒感染檢測的試劑盒中，本發明的人巨細胞病毒蛋白也可以是經過標記的。具體可使用酶、金屬螯合物等標記。優選的標記性酶例如，辣根過氧化物酶， 過氧化物酶，堿性磷酸酶等。優選的金屬物質有膠體金等。與上述標記物結合的方法是已知的。當標記物為酶時，其底物和顯色劑可用于測定其活性。當使用過辣根過氧化物酶時，以3' ,3' ,5' ,5'，-四甲基聯苯胺作為底物溶液，并使用TMB顯色系統。當使用過氧化物酶時，以H2O2作為底物溶液，并以鄰苯二胺、4-氨基氨替比林等作為顯色劑。當使用堿性磷酸酶時，可用鄰硝基苯磷酸、對硝基苯磷酸等作為底物。(三)有益效果采用本發明提供的重組人巨細胞病毒蛋白制備的診斷試劑盒，與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強、靈敏度高等優點，很好的滿足了人巨細胞病毒感染臨床診斷的需要。本發明提供的HCMV蛋白抗原具有高特異性、強免疫原性和盡量完整的抗原決定簇，在 HCMV疫苗研制領域具有實際應用價值。


圖IPCR擴增產物的凝膠電泳圖；圖2是表達質粒pETj8a-HCMV的構建流程圖3是誘導后菌體12% SDS-PAGE電泳圖，其中M表示Marker，1表示目的蛋白。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的保護范圍。實施例1巨細胞病毒蛋白的制備1. 1巨細胞病毒蛋白抗原表位篩選及目的基因克隆通過計算機分析巨細胞病毒的全部氨基酸序列篩選出巨細胞病毒蛋白的強抗原表位，所述的重組蛋白質從N-末端到C-末端依次含有HCMV ppl50從N-末端第483位到第682位的200個氨基酸和pp65從N-末端第357位到545位的189個氨基酸。其中上述重組蛋白質的DNA序列如SEQ ID No. 2所示，所述的ppl50目的肽段DNA序列是第1447位到第2046位核苷酸，pp65目的肽段DNA序列是第1069位到第1635位核苷酸。根據目的片段的DNA序列，即HCMV ppl50和pp65上目的肽段的cDNA序列和質粒上的酶切位點，設計兩對PCR引物(PI, P2)和(P3，P4)。pi和p2用于擴增ppl50第1447 位到第2046位核苷酸，p3和p4用于擴增pp65第1069位到第1635核苷酸；引物pi和p4 分別帶有NdeI和B10I的酶切位點，引物p2和p3順序互補，并共同對應于ppl50上述片段的3’末端和pp65上述片段的5’末端序列。引物序列如下Pl:ATCGCATATGGGTGACGGGCGGTTTGGCGP2 GAAGAGGAAAAGCGTCGCGAGCGGCAGP3 :TCGCGACGCTTTTCCTCTTCGTCGTAGCAAACCAGCTCGTP4 :ATCGCTCGAGTTAGGGCACGTGCTGATAGCCGTGTTT上述引物由(華美生物技術有限公司)合成。以人巨細胞病毒培養物(中國預防醫學科學院病毒研究所贈)為模板，以引物Pl 和P2擴增ppl50片段，以引物P3和P4擴增pp65片段；再以第一輪PCR擴增得到的ppl50 片段和pp65片段為模板，加入引物Pl和P4，擴增ppl50pp65片段；得到串聯的目的基因重組片段ppl50pp65 ；擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如附圖1所示。切割含目的DNA 條帶的膠塊，用DNA快速純化試劑盒(購自六合通-北京TAKARA公司，產品名稱=TAKARA MiniBEST Plasmid purification)回收目的DNA，操作按產品說明書進行。1. 2表達載體pET18a-HCMV的構建及鑒定pET_28a載體(購自華美生物技術有限公司)與PCR擴增產物目的DNA片段經 NdeI 和 XhoI 雙酶切，產物純化(采用 TAKARA MiniBEST Plasmid purification 試劑盒， 購自六合通-北京TAKARA公司)后經T4DNA連接酶與載體連接，連接產物轉化入大腸桿菌 BL2KDE3)感受態(購自華美生物技術有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培養過夜，次日挑選平板上生長的菌落，堿裂解法抽提質粒，瓊脂糖凝膠電泳選擇可疑重組質粒作為模板進行PCR擴增，對有擴增產物的重組子質粒經內切酶NdeI和B10I雙酶切、 鑒定，其中有3個重組子為陽性重組子。從3個陽性重組子中選一個陽性重組子送賽百勝公司測序鑒定，結果表明該質粒上確實插入了目的基因，且插入方向正確，將此重組質粒命名為表達質粒pET-28a-HCMV。1. 3表達人巨細胞病毒蛋白的工程菌的構建
將表達質粒pET-28a-HCMV用化學轉化法((美)J.薩姆布魯克 (JosephSambrook),(美)D.W.拉塞爾(DavidW. Russell)著，黃培堂等譯.分子克隆實驗指南.科學出版社，2002.)轉入大腸埃希氏菌BL21(DE3)菌株(購自華美生物技術有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培養過夜，次日挑選平板上生長的菌落用含卡那霉素的LB培養基培養，用IPTG誘導表達5小時，誘導后的菌體用12% SDS-PAGE分析 (同上文獻)，結果如附圖3所示，確定表達人巨細胞病毒蛋白的菌株即為所需的工程菌株， 用甘油冷凍保存。1. 4重組人巨細胞病毒蛋白的表達制備及純化誘導培養已構建的表達人巨細胞病毒蛋白的大腸埃希氏菌，用IPTG誘導表達5小時，離心收集菌體，以1 10 (W/V)加入菌體裂解液(50mm pH 8. OTris-Cl, 50mm NaCl,50% 甘油)，加入磁力攪拌轉子攪拌30分鐘，經超聲破菌(冰浴，功率200W，超聲3秒，間隔5秒， 超聲80次)、組氨酸親和柱(300ml 200mm的NiC12過柱，流速5ml/min ；500ml平衡緩沖液洗注，流速lOml/min ；超聲離心后的沉淀用200ml平衡緩沖液稀釋后上樣，流速3ml/min， 500ml平衡緩沖液洗注，流速5ml/min ；用分別含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各IOOml的洗脫緩沖液洗脫，紫外檢測R^Onm檢測吸收值，收集洗脫峰；SDS-PAGE電泳檢測純化組分)得到純化的重組蛋白。1. 5 重組蛋白 1Western-Wot 驗證為驗證重組HCMV型蛋白質與抗HCMV抗血清反應性及重組目的基因獲得表達并具有抗原性，用Western-blot法進行了測試。陽性血清為10份兔抗HCMV抗體陽性血清(購自北京百安天地醫藥科技有限公司)和30份人抗HCMV抗體陽性血清(經ELISA法檢測證實)。陰性血清為10份對照正常兔血清和30份人抗HCMV抗體陰性血清(經ELISA法檢測證實)。結果如表1。表1重組蛋白Western-blot驗證結果
權利要求
1.一種編碼人巨細胞病毒蛋白核酸，如SEQ ID N0:1所示。
2.包含權利要求1所述核酸的人巨細胞病毒蛋白的表達載體，其特征在于它是將權利要求1所述的核酸插入到質粒pET-28a上得到的重組pETj8a-HCMV質粒。
3.—種人巨細胞病毒蛋白，其特征在于它由權利要求1所述的核酸編碼，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
4.一種重組人巨細胞病毒蛋白的制備方法，其特征在于應用權利要求1的重組DNA構建表達載體，并在該載體所適合的原核宿主細胞中表達權利要求1所述重組DNA編碼的重組人巨細胞病毒蛋白。
5.一種表達人巨細胞病毒蛋白的工程菌株，其特征在于它含有權利要求3所述的表達載體pETj8a-HCMV，宿主菌為大腸桿菌。
6.一種檢測人巨細胞病毒感染的試劑盒，其特征在于其組分中的抗原是根據權利要求 2所述的人巨細胞病毒蛋白。
7.根據權利要求2所述的人巨細胞病毒蛋白在制備檢測試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種人巨細胞病毒蛋白，還提供了該重組蛋白在制備檢測試劑盒中的應用。采用本發明提供的編碼人巨細胞病毒蛋白制備的診斷試劑盒，與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強、靈敏度高等優點，很好的滿足了人巨細胞病毒蛋白感染臨床診斷的需要。
文檔編號C12N15/38GK102533795SQ20121000491
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者張曉剛, 王健, 王志新, 陳廷友 申請人:英諾特(唐山)生物技術有限責任公司