專利名稱：一種惡性瘧疾疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種惡性瘧疾疫苗及其制備方法，尤其涉及惡性瘧疾疫苗制備中重組質粒和重組病毒的制備，屬于生物醫藥技術領域。
背景技術：
瘧疾是當今世界對人類危害最為嚴重的傳染性疾病之一。據WHO最新估計，全球每年發生3億-5億起急性感染病例，有100多萬人因這一疾病而死亡，其中大多數為非洲撒哈拉以南地區5歲以下的兒童。近年來，由于耐藥性瘧原蟲株和耐藥蚊媒的不斷產生和擴散，使瘧疾控制形勢更為嚴峻。因此，研制有效的瘧疾疫苗，成為控制瘧疾的發病率和病死率迫切需要解決的課題。在眾多的瘧疾疫苗候選抗原中，惡性瘧原蟲裂殖子頂端膜抗原Kapicalmembrane antigen-1, AMA-1)在裂殖子入侵宿主紅細胞過程中發揮重要作用，有希望的抗瘧原蟲感染的疫苗候選分子。隨著AMAl分子生物學研究的深入，人們開始研制AMAl亞單位疫苗，目前世界上生物技術常用的生物體是大腸桿菌和酵母，用大腸桿菌表達的AMAl蛋白無免疫原性和保護性，而酵母表達AMAl也不能產生有效的中和抗體。哺乳細胞表達系統(CHO)等表達系統雖然效果好，但因表達量低，同時需大量培養基和牛血清蛋白，成本高，不適合生產需要。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的是提供一種克服上述缺陷的惡性瘧疾疫苗。本發明通過構建一種家蠶重組桿狀病毒，并運用重組桿狀病毒表面展示技術構建表達惡性瘧原蟲主要抗原AMAl胞外域的重組桿狀病毒&iigp64AMAl，以家蠶蛹作為生物反應器生產重組桿狀病毒，并以此重組桿狀病毒作為瘧疾疫苗原生產疫苗，相比傳統疫苗生產具有安全性好、生產成本低、產量高、易于操作、適用于大規模生產的特點。為了達到上述目的，本發明的技術方案如下
一種家蠶重組桿狀病毒Bmgp64AMAl，該病毒于2011年12月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心其簡稱為CGMCC(地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為家蠶核型多角體病毒{Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ), 1 ! ^% CGMCC No. 5601。上述家蠶重組桿狀病毒aiigp64AMAl的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟
(1)由PCR擴增的方法獲得桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽基因序列和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，分別通過I和煬ο I /歷III雙酶切插入PFastBacI載體多克隆位點上下游兩端構建的表面展示載體pFaStBaCI-gp64 ；
(2)由PCR擴增的方法獲得惡性瘧原蟲主要抗原AMAl胞外域基因序列，其5’和3’端分別引入^I和I酶切位點后，連接到步驟⑴所得表面展示載體pi^StBaCI-gp64，構建成重組轉移質粒pFastBacI-gp64-AMAl ；
(3)取步驟( 所得的重組轉移質粒pFastBaCI-gp64-AMAl轉化大腸桿菌DHlOBac感受態細胞，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環素、X-gal和IPTG的LB培養板上進行藍白斑篩選，避光培養4(Γ4 !后挑取白斑，培養2(T24h后用異丙醇抽提重組桿狀病毒基因組，并用M13通用引物做PCR鑒定；
(4)取步驟C3)鑒定成功的重組病毒基因組通過脂質體介導法轉染家蠶BmN細胞，發病后獲得一代病毒懸液(T4°C保存，提取病毒基因組用M13通用引物進行PCR鑒定，獲得所述家蠶重組桿狀病毒&iigp64AMAl。本發明還提供上述家蠶重組桿狀病毒aiigp64AMAl表達的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 4 所示。上述蛋白的制備方法包括以下步驟
將上述家蠶桿狀病毒Bmgp64AMAl感染家蠶BmN細胞進行病毒擴增；針刺接種法接入家蠶五齡幼蟲或蠶蛹；收集表達的上述蛋白。本發明進一步提供上述重組桿狀病毒&iigp64AMAl在制備惡性瘧疾疫苗中的應用。本發明還提供上述蛋白在制備惡性瘧疾疫苗中的應用。本發明實現的技術效果如下
利用家蠶幼蟲、蛹作為生物反應器，家蠶桿狀病毒表達系統高效表達具有極高臨床應用價值瘧疾疫苗的方法，本方法適用于大規模生產，降低了成本，且產量高，所生產的瘧疾疫苗應用價值大；
瘧疾疫苗尚無利用桿狀病毒表面展示技術生產，家蠶桿狀病毒表達系統是真核表達，具有翻譯后修飾功能。AMAl胞外域蛋白的免疫原性與其正確構型有關，利用真核表達可以具備較好的免疫原性。


圖1 融合桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽和跨膜區的表面展示載體pFastBacI-gp64 ；
圖2 含有PfAMAl ectodomain的融合基因結構示意pPolh 多角體啟動子；SP :gp64基因的信號肽序列；PfAMAl ectodomain 惡性瘧原蟲頂端膜抗原胞外域；TM :gp64基因的跨膜區序列；Poly (A)多腺苷酸化信號；Stu I 酶切位點；》ιο I 酶切位點。
具體實施例方式應該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發明提供進一步的發明。除非另有說明，本文使用的所有科學和技術術語具有與本發明所屬技術領域人員通常理解的相同含義。本發明所述惡性瘧疾疫苗的制備方法，通過PCR的方法獲得惡性瘧原蟲主要抗原AMAl胞外域基因序列(惡性瘧原蟲頂端膜抗原胞外域)，將其插入融合gp64信號肽和跨膜區的表面展示載體pFastBacI-gp64中，獲得pFastBacI-gp64_AMAl重組質粒，轉化大腸桿菌DHlOBac感受態細胞，通過轉座獲得重組Bacmid-AMAl，將其轉染家蠶BmN細胞，在細胞內裝配形成重組桿狀病毒&iigp64AMAl，并復制擴增，用第三代aiigp64AMAl接種家蠶幼蟲，蛹，經5-7天后收集幼蟲體液和蛹體，勻漿、離心、分離純化，冷凍干燥，無菌條件下制成惡性瘧疾疫苗凍干粉實現。下面結合實施例詳細闡述本發明的具體內容。實施例1 重組轉移質粒pFastBacI-gp64_AMAl的構建
以桿狀病毒gp64序列為模板，分別用引物PI、P2和P3、P4進行PCR擴增gp64的信號肽(SP)序列和跨膜區序列01)』0 產物通過及 !! I/EcoR I和煬ο I /Λ /7 /ΙΙΙ雙酶切插入PFastBacI載體多克隆位點上下游兩端，構建展示載體pFStBaCI-gp64(載體結構如圖1所示)。然后以惡性瘧原蟲3D7標準株cDNA為模板，用引物P5、P6進行PCR擴增惡性瘧原蟲頂端膜抗原胞外域AMAl ectodomain，PCR產物通過Sto I和ZAo I雙酶切插入表面展示載體pFastBacI-gp64，構建重組轉移載體pFastBacI-gp64-AMAl。該重組轉移載體包括多角體啟動子(pPolh)、gp64信號肽(SP)和跨膜區(TM)、惡性瘧原蟲頂端膜抗原AMAl胞外域(PfAMAl ectodomain)，結構如圖 2 所示，將含有 PfAMAl ectodomain (融合有 gp64 )的通過Mu I和B10 I插入到多角體啟動子下，利用該多角體啟動子啟動AMAl融合基因的表達，使融合蛋白N端具有信號肽(SP)，C端具有跨膜區(TM)，由于該啟動子屬于極晚期基因啟動子且為強啟動子，即使融合蛋白是對桿狀病毒和宿主細胞有毒性的蛋白，由于以該啟動子啟動融合基因表達時病毒粒子已經形成，所以融合蛋白也可以得到高效、大量地表達。惡性瘧原蟲頂端膜抗原胞外域(PfAMAl)通過桿狀病毒囊膜蛋白gp64的信號肽(SP)引導和跨膜區(TM)錨定展示于桿狀病毒表面，形成刺猬狀(偽病毒)，末端的多腺苷酸化信號PolyA對融合蛋白的翻譯有重要作用。引物序列設計如下
Psp 1CGC.GGATCC ATGGTAGGCGCTATTGTTTXATAC'GTG
CTTTTGGC'CjGC" GGfsp 1 -40)
Psp2C GAC GTAGGCCTTTGAATTCTfba C4054-40DCGC. CG
Panxa6 CCGC"TC'GAGTTT€ATTTTATCAX4ACt(l)gp64信號肽(SP)的擴增以gp64 DNA為模板，PCR反應參數設計為，94°C預變性3min，94°C變性30s，68°C復性延伸30s, 30個循環，68°C延伸5min。
在一個無菌的0. 5ml離心管中，混合下列成分IOXPCR Buffer10 μ 125mmol MgCl28μ 1
2. 5 mmol dNTPs8μ 1
Pspl1 μ 1
Psp21 μ 1
模板1 μ 1
KOD-Plus DNA 聚合酶 1 μ 1 加無菌雙蒸水至100 μ 1
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應參數設計30個循環。待反應結束后，電泳鑒定擴增片斷，同時切膠回收目的片斷。(2) gp64跨膜域(TM)的擴增
以gp64 DNA為模板，PCR反應參數設計為，94°C預變性3min，94°C變性30s，68°C復性延伸30s, 30個循環，68°C延伸5min。100 μ 1的反應體系同上，所用引物為Ptm3和Ptm4，各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應參數設計30個循環。待反應結束后，電泳鑒定擴增片斷，同時切膠回收目的片斷。(3) AMAl ectodomain 基因的擴增
以惡性瘧原蟲3D7標準株cDNA為模板，PCR反應參數為94°C預變性5min，94°C變性45s，53°C退火30s，68°C復性延伸90s, 35個循環，68°C延伸IOmin。在一個無菌的0. 5ml離心管中，混合下列成分10XPCR Buffer5μ 1
2. 5mmol MgSO42μ 1
2.5 mmol dNTPs5 μ 1
Pamal1. 5 μ 1
Pama21. 5 μ 1
模板1 μ 1
KOD-Plus DNA 聚合酶 1 μ 1加無菌雙蒸水至50 μ 1
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應參數設計35個循環。待反應結束后，電泳鑒定擴增片斷，同時切膠回收目的片斷。(4)重組轉移質粒構建
將上述PCR擴增獲得的gp64的信號肽(SP)序列和跨膜區序列(TM)分別通過BamHI、EcoR I和Xho I、HindIII (購自Fermentas公司)雙酶切插入pFastBacI載體(購自hvitrogen公司)多克隆位點上下游兩端，構建展示載體pFstBaCI-gp64。然后將AMAlectodomain的PCR產物通過Mu I和Β ο I (購自！^ermentas公司)雙酶切插入展示載體pFastBacI-gp64,構建重組轉移質粒pFastBacI-gp64_AMAl。通過酶切分析、雙向測序鑒定基因序列正確。實施例2 家蠶重組桿狀病毒aiigp64AMAl的獲得
鑒定重組成功的重組轉移質粒pFastBacI-gp64-AMAl轉化大腸桿菌DHlOBac感受態細胞(購自hvitrogen公司)，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環素、X_gal和IPTG的LB培養板(購自上海生工生物公司)上進行藍白斑篩選，避光培養4 后挑取白斑，培養24h后用異丙醇抽提重組桿狀病毒基因組，并用M13通用引物做PCR鑒定。鑒定成功的重組病毒基因組通過脂質體介導法轉染家蠶BmN細胞(購自hvitrogen公司)(方法參照hvitrogen 公司脂質體轉染試劑Cellfectin II Reagent說明書)，發病后(顯微鏡觀察)獲得一代病毒懸液4°C保存，提取病毒基因組用M13通用引物鑒定，獲得所述家蠶重組桿狀病毒株 Bmgp64AMAl0實施例3 =AMAl融合蛋白在家蠶5齡幼蟲和蛹中的表達
將家蠶重組桿狀病毒&iigp64AMAl以10M0I病毒感染BmN細胞進行病毒擴增，按 IX 10PFU/條針刺接種法接入家蠶五齡幼蟲或蠶蛹(購自浙江中奇生物藥業股份有限公司)，感染5-7天后，采取幼蟲體或蛹體勻漿，經高速離心(12000rpm，30min)，取上清，檢測重組蛋白的表達。高速離心后的上清加入等體積的2X蛋白質上樣緩沖液(IOOMm Tris HC1，4%SDS，0. 15% 溴酚藍，10% 甘油)，100°C加熱 IOmin,取 20 μ 1 進行 SDS-PAGE 分析，結果表明，該家蠶重組桿狀病毒已表達AMAl融合蛋白，蛋白測序結果顯示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4 所示。實施例4 惡性瘧疾疫苗的獲得
(1)從蠶蛹中分離純化AMAl融合蛋白(惡性瘧疾疫苗)
a.取500g經&iigp64AMAl感染的蠶蛹樣品，4°C解凍后，與IL滅菌ddH20混合，勻漿至漿液細致均勻即可；
b.將約1.3L勻漿液加入500ml離心管中，配平，8000rpm離心30min，取上清，小心棄
去油脂；
c.將8000rpm離心上清液倒入50ml離心管，配平，12000rpm離心30_120min，取上清，
棄油脂；
d.將12000rpm離心上清液倒入50ml離心管，配平，15000rpm離心30_120min，取上清，
棄油脂；
e.將15000rpm離心上清液倒入50ml離心管，配平，18000rpm離心30_120min，取上清，
棄油脂；
f.ISOOOrpm離心后的上清，在超凈臺上分裝于滅菌的超離管中，用注射器趕走管內氣泡，平衡，放入日立CP70MX離心機中，35000rpm離心30_90min ；
(2)超濾
收集35000rpm離心后上清液(約500mL)，用截留分子量為300KD的中空纖維膜進行超濾，不斷加入無菌水，所用無菌水體積約為樣品的10倍，整個超濾過程均在4°C環境下操作。(3)疫苗效果
惡性瘧疾疫苗進行動物體中試驗，免疫動物為新西蘭雄兔(購自天津市奧臣實驗動物銷售有限公司，11周齡，2. 3kg)，皮下注射，注射劑量為0. l-50mg/kg，2-4周后檢測抗體效價，其保護抗體效價大于1 :150，攻毒試驗結果顯示該劑量(0. l-50mg/kg)疫苗能產生中和抗體并具有明顯抵抗病毒的效果。惡性瘧疾疫苗進行惡性瘧原蟲(云南昆明醫學院)侵染實驗，其保護抗體效價大于1 :150，并具有明顯抵抗瘧原蟲侵染的效果。以上所述，僅為本發明的優選實施例，應當指出，對于本技術中的普通技術人員來說，在不脫離本發明的核心技術特征的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些潤飾和改進也應屬于本發明的專利保護范圍。
權利要求
1.一種家蠶重組桿狀病毒angp64AMAl，該病毒保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5601。
2.—種權利要求1所述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64AMAl的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)由PCR擴增的方法獲得桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽基因序列和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，分別通過1/EcoR I和損οIII雙酶切插入PFastBacI載體多克隆位點上下游兩端構建的表面展示載體pFaStBaCI-gp64 ；(2)由PCR擴增的方法獲得惡性瘧原蟲主要抗原AMAl胞外域基因序列，其5’和3’端分別引入^I和I酶切位點后，連接到步驟(1)所得表面展示載體pFastBaCI-gp64，構建成重組轉移質粒pFastBacI-gp64-AMAl ；(3)取步驟( 所得的重組轉移質粒pFastBaCI-gp64-AMAl轉化大腸桿菌DHlOBac感受態細胞，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環素、X-gal和IPTG的LB培養板上進行藍白斑篩選，避光培養4(Γ4 !后挑取白斑，培養2(T24h后用異丙醇抽提重組桿狀病毒基因組，并用M13通用引物做PCR鑒定；(4)取步驟C3)鑒定成功的重組病毒基因組通過脂質體介導法轉染家蠶BmN細胞，發病后獲得一代病毒懸液(T4°C保存，提取病毒基因組用M13通用引物進行PCR鑒定，獲得所述家蠶重組桿狀病毒&iigp64AMAl。
3.—種權利要求1所述的家蠶重組桿狀病毒Bmgp64AMAl表達的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 4 所示。
4.一種權利要求3所述蛋白的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)將權利要求1所述的重組桿狀病毒Bmgp64AMAl感染家蠶BmN細胞進行病毒擴增；(2)針刺接種法接入家蠶五齡幼蟲或蠶蛹；(3)收集表達的權利3所述蛋白。
5.一種權利要求1所述重組桿狀病毒Bmgp64AMAl在制備惡性瘧疾疫苗中的應用。
6.一種權利3所述蛋白在制備惡性瘧疾疫苗中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種惡性瘧疾疫苗及其制備方法，屬于生物醫藥技術領域。本發明通過構建一種家蠶重組桿狀病毒，并運用重組桿狀病毒表面展示技術構建表達惡性瘧原蟲主要抗原AMA1胞外域的重組桿狀病毒，以家蠶蛹作為生物反應器生產該重組桿狀病毒，并以此重組桿狀病毒作為瘧疾疫苗原生產疫苗。相比傳統疫苗生產具有安全性好、生產成本低、產量高、易于操作、適用于大規模生產的特點。
文檔編號C12N15/866GK102559613SQ20121000557
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者張耀洲, 申俊, 舒特俊, 陳劍清 申請人:特菲(天津)生物醫藥科技有限公司