專利名稱：一種瘧疾疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種瘧疾疫苗及其制備方法，尤其涉及瘧疾疫苗制備中的重組質粒和重組病毒的制備，屬于生物醫藥技術領域。
背景技術：
據世界衛生組織統計，全球大約有3. 2億人口生活在瘧疾流行的地區，每年奪去大約100萬人的性命并導致4億人感染，而每年各國用于瘧疾預防和治療的資金也達到了 10億美元。由于疫區感染人口的流動性和血液傳播等新的傳播方式的出現使得瘧疾疫情的控制面臨更加嚴峻的挑戰。每年感染瘧疾致死的人群中，擬％為五歲以下的兒童。因而瘧疾疫苗的研制勢在必行，并已成為瘧疾防治中的重要內容。瘧原蟲生活史有多個時期，每個生活時期具有多種抗原，而且每種抗原具有多個表位，而不同宿主的免疫反應也不相同，所有的這些因素使得瘧疾疫苗的研究變得異常困難。傳統的瘧疾治療主要依賴于藥物治療，氯喹是一種使用方便、療效好且經濟的紅內期抗瘧藥物，氯喹可以與惡性瘧原蟲體內的血紅蛋白降解產物高鐵血紅素結合從而影響惡性瘧原蟲的解毒，來達到殺滅瘧原蟲的目的。任何一種藥物經過長時間的使用之后都會使其作用受體對其產生一定的耐受性，由于藥劑量不足、治療不徹底、藥物半衰期長、瘧疾傳播密度高等都有可能致使惡性瘧原蟲對氯喹產生抗性，因此藥物療措施已面臨著嚴重的挑戰。瘧疾的臨床癥狀主要發生在瘧原蟲裂殖子孢子在人體紅細胞內無性增殖階段，目前瘧疾疫苗研究的熱點主要是基于阻止此階段瘧原蟲的無性裂殖來預防瘧疾的感染。裂殖子表面膜蛋白IC-末端的19kD片段(MSP119。)在子孢子侵染紅細胞后仍然存在于裂殖子表面，可誘導機體T細胞和B細胞產生免疫應答，因此是當前最重要的瘧疾疫苗研制的候選抗原位點之一。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的是提供一種克服上述缺陷的瘧疾疫苗。本發明通過構建一種重組家蠶桿狀病毒，并運用桿狀病毒表面展示技術將惡性瘧原蟲裂殖子表面膜蛋白 IC-末端的19kD片段(MSPl19e)展示在家蠶桿狀病毒表面MSPl19e基因通過與GP64基因的跨膜(TM)基因與信號肽(SP)基因相連，通過信號肽(SP)基因的引導和跨膜(TM)基因的錨定，在病毒表達和復制過程中將MSPl19。蛋白展示于家蠶桿狀病毒的表面。以家蠶蛹作為生物反應器生產重組桿狀病毒，并以此重組桿狀病毒作為瘧疾疫苗原進行生產，相比于傳統瘧疾疫苗生產具有安全性好、生產成本低、產量高、易于操作、適用于大規模生產的特點。為了達到上述目的，本發明的技術方案如下
一種家蠶重組桿狀病毒BmNPV-gp64-MSPl19。，該病毒于2011年12月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心其簡稱為CGMCC(地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為家蠶核型多角體病毒{Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ), 1 ! ^% CGMCC No. 5602。
上述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-gp64_MSPl19。的制備方法，包括以下步驟
(1)由PCR擴增的方法獲得桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽基因序列和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，通過I和損οI/歷III雙酶切插入pFastBacI載體多克隆位點上下游兩端構建的表面展示載體pFastBaCI-gp64 ；
(2)由PCR擴增的方法獲得惡性瘧原蟲主要抗原基因MSPlw。序列，其5’和3’端分別引入FcMI和損ol酶切位點后，連接到步驟(1)所得表面展示載體pFastBaCI-gp64，構建成重組轉移質粒 pFastBacI-gp64-MSPl19C ；
(3)取步驟( 所得的重組轉移質粒pFastBaCI-gp64-MSPl19C轉化大腸桿菌DHlOBac 感受態細胞，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環素、X-gal和IPTG的LB培養板上進行藍白斑篩選，避光培養401Γ4 !后挑取白斑，培養20tT24h后用異丙醇抽提重組桿狀病毒基因組， 并用M13通用引物、MSPl19e引物做PCR鑒定；
(4)取步驟C3)所鑒定成功的重組病毒基因組通過脂質體介導法轉染家蠶BmN細胞，發病后獲得一代病毒懸液0°C、°C保存，提取病毒基因組用M13通用引物、MSPl19e引物做PCR 鑒定，獲得所述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-gp64-MSPl19c。本發明還提供上述重組桿狀病毒BmNPV-gp64_MSPl19。表達的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 10所示。上述抗原蛋白的制備方法，包括以下步驟
(1)將上述的重組桿狀病毒BmNPV-gp64-MSPl19e感染家蠶BmN細胞進行病毒擴增；
(2)針刺接種法接入家蠶蛹；
(3)收集表達的上述抗原蛋白。本發明進一步提供上述重組桿狀病毒BmNPV-gp64-MSPlli3。在瘧疾疫苗制備中的應用。本發明還提供上述蛋白在瘧疾疫苗制備中的應用。本發明實現的技術效果如下
1、世界上首次利用家蠶桿狀病毒表面展示技術高效表達惡性瘧原蟲抗原蛋白，制備瘧疾疫苗；
2、利用家蠶幼蟲、蛹作為生物反應器高效表達真核生物蛋白，可以達到蛋白的正確折疊，從而能保證完整的抗原性；
3、蠶蛹作為天然食品，且桿狀病毒對哺乳動物無感染，致熱源性少，疫苗安全性高；
4、本方法適用于大規模生產，降低了成本，且產量高，所生產的瘧疾疫苗應用價值大。


圖1顯示的是融合桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽和跨膜區的表面展示載體 pFastBacI-gp64 ；
圖2顯示的是含有PfMSPlli3。的重組基因結構示意圖；pPolh 多角體啟動子；SP :gp64 基因的信號肽序列；PfMSPl19。惡性瘧原蟲裂殖子表面膜蛋白IC-末端的19kD片段；TM: gp64基因的跨膜區序列；Poly (A)多腺苷酸化信號；
圖3顯示的是GP64信號肽SP基因的PCR擴增結果圖；Μ:101Λ DNA標記；1 信號肽SP 的PCR產物；圖4顯示的是GP64基因跨膜結構域TM基因的PCR擴增結果；M :10 DNA標記；1 ‘ 跨膜結構域TM的PCR產物；
圖5顯示的是MSPlwe基因的PCR擴增；M :10Kb DNA分子量標準；1 =MSPl19c基因擴增的 PCR產物；
圖6顯示的是重組質粒的鑒定；M :10Kb DNA分子量標準；1 :pFastBacI-gp64-MSPl19C 重組質粒的雙酶切產物；2 :PFastBacI-gP64-MSPl19C重組質粒的PCR產物；
圖7顯示的是Bacmid-gp64-MSPl19。的鑒定；M :10Kb DNA分子量標準；1 :M13上、下游引物PCR結果；2 =MSPl19c引物PCR結果；
圖8A顯示的是重組病毒在細胞中的PCR檢測結果(用M13通用引物鑒定)；M=IOKb DNA 分子標準量大小；1 :M13上、下游引物的PCR產物；
圖8B顯示的是重組病毒在細胞中的PCR檢測結果(用MSP119C基因引物鑒定);M IOKb DNA分子標準量大小；1 =MSPl19c引物的PCR產物；
圖9A顯示的是MSPl19e蛋白在蠶蛹中表達中的SDS-PAGE檢測結果；M 標記；1 正常蠶蛹上清；2 正常蠶蛹沉淀；3 發病蠶蛹上清；4 發病蠶蛹沉淀；
圖9B顯示的是MSPl19c蛋白在蠶蛹中表達中W^festern Blotting檢測結果；M 標記； 1 正常蠶蛹上清；2 正常蠶蛹沉淀；3 發病蠶蛹上清；4 發病蠶蛹沉淀；
圖IOA顯示的是離心過程均取樣的SDS-PAGE檢測結果；M 標記；1 超離上清；2 超離沉淀；3 :300kD超濾流出；4 :300kD超濾截留；5 :8000rpm上清；6 :8000rpm沉淀；7 15000rpm 上清；8 :15000rpm 沉淀；
圖IOB顯示的是離心過程均取樣的Wfestern Blotting檢測結果；M 標記；1 超離上清；2 超離沉淀；3 :300kD超濾流出；4 :300kD超濾截留；5 :8000rpm上清；6 :8000rpm沉淀；7 :15000rpm 上清；8 :15000rpm 沉淀。
具體實施例方式以下具體說明都是例示性的，旨在對本發明提供進一步的發明。除非另有說明，本文使用的所有科學和技術術語具有與本發明所屬技術領域人員通常理解的相同含義。本發明通過構建一種重組家蠶桿狀病毒，并運用桿狀病毒表面展示技術將惡性瘧原蟲裂殖子表面膜蛋白IC-末端的19kD片段(MSPl19c)展示在家蠶桿狀病毒表面(如圖2)， MSPl19c基因通過與GP64基因的跨膜(TM)基因與信號肽(SP)基因相連，通過信號肽(SP) 基因的引導和跨膜(TM)基因的錨定，在病毒表達和復制過程中將MSPl19c蛋白展示于家蠶桿狀病毒的表面。下面結合實施例詳細闡述本發明的具體內容。實施例1 重組轉移質粒pFastBacI-gp64_MSPl19。的構建
以桿狀病毒gp64序列為模板，分別用引物Pl (如SEQ ID NO=I所示)、P2 (如SEQ ID NO 2所示)和P3 (如SEQ ID NO 3所示)、P4 (如SEQ ID NO 4所示)進行PCR擴增gp64 的信號肽(SP)序列和跨膜區序列(TM)，PCR產物通過及麗TIjcoTP I和煬οI、歷III (均購自！^rmentas公司)雙酶切插入pFastBacI載體多克隆位點上下游兩端，構建展示載體 pFstBacI-gp64。以惡性瘧原蟲3D7標準株cDNA(由云南昆明科學院楊照青教授惠贈)為模板，用引物P5 (如SEQ ID NO 5所示)、P6 (如SEQ ID NO 6所示)進行PCR擴增惡性瘧
5原蟲裂殖子表面膜蛋白IC-末端的19kD抗原位點的DNA序列，PCR產物通過和IAoI (均購自！^ermentas公司)雙酶切插入展示載體pFastBacI_gp64 (見圖1)，構建重組轉移質粒pFastBaCI-gp64-MSPl19。。該重組轉移載體包括多角體啟動子(pPolh)、gp64信號肽 (SP)和跨膜區(TM)、惡性瘧原蟲裂殖子表面膜蛋白IC-末端19kD片段(PfMSPl19e),結構如圖2所示。將含有PfMSPl19e (融合有gp64 )的通過I和損ο I插入到多角體啟動子下，利用該多角體啟動子啟動PfMSPlli3。融合基因的表達，使融合蛋白N端具有信號肽(SP)， C端具有跨膜區(TM)，由于該啟動子屬于極晚期基因啟動子且為強啟動子，即使融合蛋白是對桿狀病毒和宿主細胞有毒性的蛋白，由于以該啟動子啟動融合基因表達時病毒粒子已經形成，所以融合蛋白也可以得到高效、大量地表達。惡性瘧原蟲裂殖子表面膜蛋白IC-末端19kD片段(PfMSPl19e)通過桿狀病毒囊膜蛋白gp64的信號肽(SP)引導和跨膜區(TM)錨定展示于桿狀病毒表面，形成刺猬狀(偽病毒)，末端的多腺苷酸化信號PolyA對融合蛋白的翻譯有重要作用。引物序列設計如下
權利要求
1.一種家蠶重組桿狀病毒BmNPV-gp64-MSPl19。，該病毒保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5602。
2.—種權利要求1所述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-gp64-MSPl19。的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)由PCR擴增的方法獲得桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽基因序列和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，通過I/EcoR I和損ol/歷/ /ΙΠ雙酶切插入pFastBacI載體多克隆位點上下游兩端構建的表面展示載體pFastBaCI-gp64 ；(2)由PCR擴增的方法獲得惡性瘧原蟲主要抗原基因MSPlw。序列，其5’和3’端分別引入FcMI和損ol酶切位點后，連接到步驟(1)所得表面展示載體pFastBaCI-gp64，構建成重組轉移質粒 pFastBacI-gp64-MSPl19C ；(3)取步驟( 所得的重組轉移質粒pFastBaCI-gp64-MSPl19C轉化大腸桿菌DHlOBac 感受態細胞，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環素、X-gal和IPTG的LB培養板上進行藍白斑篩選，避光培養4(Γ4 !后挑取白斑，培養2(T24h后用異丙醇抽提重組桿狀病毒基因組，并用M13通用引物、MSPlwe引物做PCR鑒定；(4)取步驟C3)所鑒定成功的重組病毒基因組通過脂質體介導法轉染家蠶BmN細胞，發病后獲得一代病毒懸液0°C、°C保存，提取病毒基因組用M13通用引物、MSPl19e引物做PCR 鑒定，獲得所述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-gp64-MSPl19c。
3.種權利要求1所述的重組桿狀病毒BmNPV-gp64-MSPlli3。表達的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 10所示。
4.一種權利要求3所述抗原蛋白的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)將權利要求1所述的重組桿狀病毒BmNPV-gp64-MSPl19e感染家蠶BmN細胞進行病毒擴增；(2)針刺接種法接入家蠶蛹；(3)收集表達的權利3所述抗原蛋白。
5.一種權利要求1所述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-gp64-MSPl19。在瘧疾疫苗制備中的應用。
6.一種權利要求3所述的蛋白在瘧疾疫苗制備中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種瘧疾疫苗及其制備方法，屬于生物醫藥技術領域。本發明通過構建一種重組家蠶桿狀病毒，并運用桿狀病毒表面展示技術將惡性瘧原蟲裂殖子表面膜蛋白1C-末端的19kD片段(MSP119C)表達于家蠶桿狀病毒表面，以家蠶蛹作為生物反應器生產重組桿狀病毒，并以此重組桿狀病毒制備瘧疾疫苗。相比于傳統的瘧疾疫苗生產具有安全性好、生產成本低、產量高、易于操作、適用于大規模生產的特點。
文檔編號C12N7/01GK102533677SQ20121000557
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者吳昕昕, 張耀洲, 舒特俊, 陳劍清 申請人:特菲(天津)生物醫藥科技有限公司