專利名稱：一種熒光定量rt-pcr檢測人類免疫缺陷病毒1型的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光定量RT-PCR檢測人類免疫缺陷病毒I型的試劑盒，特別是涉及以一步法實時熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)快速、定量檢測人類免疫缺陷病毒I型感染的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過本發(fā)明的試劑盒實現(xiàn)對血清或血漿樣本中人類免疫缺陷病毒I型核酸RNA進行定量檢測，適用于人類免疫缺陷病毒I型感染的輔助診斷和人類免疫缺陷病毒I型感染者藥物治療的療效監(jiān)測。
背景技術(shù)：
人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)是獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的病原體。HIV 是 1983 年法國巴斯德研究所Montagnier等首次從一例慢性淋巴結(jié)腫大的男性同性戀病人的血液中分離得到的一株新逆轉(zhuǎn)錄病毒。次年，美國Gallo等也從AIDS患者體內(nèi)分離得到相似的逆轉(zhuǎn)錄病毒，根據(jù)分子病毒學(xué)研究分析證明，二者是同一病毒的不同變種。1986年，國際病毒分類委員會將他們命名為HIV。HIV主要有兩型，包括HIV-1和HIV-2。兩型病毒的核苷酸序列相差超過40%。全世界的AIDS大多由HIV-1所引起，HIV-1起源于中非，以后擴散到地中海、歐美及亞洲地區(qū)，而HIV-2只在西非呈地區(qū)性流行。目前艾滋病已成為威脅全球，尤其是亞洲和非洲等廣大發(fā)展中國家人民生命健康安全的主要疾病之一。因此，早期檢測出HIV的感染對相關(guān)疾病的治療和預(yù)后有著重要的意義。HIV病毒株呈球形，直徑約100_120nm，電鏡下病毒內(nèi)部有一致密的圓柱狀核心。病毒外層為脂蛋白包膜，其中鑲嵌有g(shù)pl20和gp41兩種病毒特異的糖蛋白。病毒內(nèi)層為20面體對稱的核衣殼，由病毒結(jié)構(gòu)蛋白組成。病毒核心含有病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶和核衣殼蛋白。HIV的基因結(jié)構(gòu)與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基本相同，為RNA雙分子，由2條相同的正股RNA鏈在5’端通過部分堿基互補配對而 形成雙聚體。病毒基因組由9749個核苷酸組成，含有3組共9個基因(gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpu和vpr)。在病毒基因組的5，端和3，端各有一段相同的核苷酸序列，成為長末端重復(fù)序列(long terminal repeat, LTR),含有起始子、增強子、TATA序列，以及多個與病毒及細胞調(diào)節(jié)蛋白反應(yīng)的區(qū)域，對病毒基因組轉(zhuǎn)錄的調(diào)控起關(guān)鍵作用。聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署公布的《2008年全球艾滋病流行狀況報告》顯示，2008年全球大約有3340萬艾滋病病毒感染者，270萬新發(fā)感染者，200萬人死于艾滋病。其中，大約有43萬新生兒感染艾滋病病毒，15歲以下兒童艾滋病病毒感染者的總數(shù)達到210萬；年輕人占所有成年人(15歲以上)新發(fā)感染的40%。即使是隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)等發(fā)展使艾滋病傳播得到有效控制，但目前該病尚無法治愈，也無有效疫苗。艾滋病的廣泛流行，主要是由HIV病毒引起的。因此，HIV感染的實驗室診斷是艾滋病預(yù)防控制工作的重要組成部分，只有發(fā)現(xiàn)傳染源才能更有效地控制艾滋病傳播。艾滋病能通過血液、精液和宮頸分泌物傳播，其他體液如唾液、腦脊液、淚液、尿液、乳汁中曾分離到HIV，但不是主要的傳播途徑。典型AIDS病程一般1. 5 2. 5年，發(fā)燒、疲勞、淋巴結(jié)腫大、持續(xù)腹瀉、咳嗽、氣短、皮疹、淤血斑、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，各種感染，包括寄生蟲病、細菌、深部真菌、病毒。AIDS患者由于免疫功能缺陷而發(fā)生腫瘤、如卡波劑氏肉瘤、淋巴瘤等。HIV感染后經(jīng)5年有10%發(fā)展成AIDS，30%為AIDS相關(guān)綜合征，60 %為無癥狀帶毒者，這給AIDS的預(yù)防帶來困難，估計感染后10年有50%發(fā)展為AIDS，該病在5年內(nèi)死亡率均在90%，多在臨床癥狀出現(xiàn)后2年之內(nèi)死亡。HIV感染的病毒學(xué)診斷技術(shù)一般包括病毒分尚和病毒成份(如抗原、核酸)的檢測。早期對HIV的診斷主要是通過血清學(xué)試驗檢測抗HIV的抗體，間接地診斷HIV感染，目前國外用于HIV抗體篩查的方法很多，根據(jù)檢測原理不同分為酶聯(lián)免疫吸附法、凝集法和層析法，可對血液、唾液和尿液標(biāo)本進行常規(guī)或快速檢測。在實際工作中常用的有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、明膠凝集試驗和各種快速診斷試劑。近幾年，分子生物學(xué)方法不斷被應(yīng)用到HIV的檢測中，HIV的實驗室診斷方法取得了很大的進展，HIV核酸定性檢測可用于HIV感染的輔助診斷，如窗口期輔助診斷、病程監(jiān)控、指導(dǎo)治療方案及療效測定、預(yù)測疾病進程等。核酸檢測已經(jīng)成為了 HIV實驗室診斷的發(fā)展方向。實時熒光PCR技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的一種核酸檢測技術(shù)，使用一種帶有核電偶聯(lián)裝置(CCD)的PCR擴增儀，通過檢測熒光信號的動態(tài)變化實時反映PCR的每個循環(huán)的擴增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測熒光信號，并通過軟件分析匯總到工作站得到擴增曲線。一步法實時熒光RT-PCR技術(shù)是實時突光 PCR 的一種(Yuqi Z, Min Y, Johann WM, et al. 2002. Quantification ofHuman Immunodeficiency Virus Type IProviral DNA by Using TaqMan Technology. JCli Microbiol. 40(2) :675-678 ；Drosten C, Seifried E, Roth WK, et al. 2001，TaqMan5_-nuclease human immunodeficiency virus type I PCR assay with phage-packagedcompetitive internal control for high-throughput blood donor screening.JClin Microbiol, 39 :4302-4308 ；Schuurman R, Descamps D, Weverling GJ, et al. 1996，Multicenter comparison of three commercial methods for quantification of humanimmunodeficiency virus type I RNA in plasma. J Clin Microbiol, 34 :3016-3022 ;Christopherson C,Kidane Y,Conway B et al. 2000. PCR-based assay to quantify humanimmunodeficiency virus type I DNA in peripheral blood mononuclear cells. J ClinMicrobiol, 38 :630-634.)，它是一種直接快速檢測RNA的方法，與檢測DNA的實時熒光PCR相比，不同之處在于前者在反應(yīng)體系中增加了逆轉(zhuǎn)錄酶，同時多了一個逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟；相同之處在于兩者在反應(yīng)體系中均有一條兩端分別標(biāo)記熒光報告基團和淬滅基團的探針，探針結(jié)構(gòu)完整時，熒光報告基團發(fā)出熒光的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)。如果擴增過程中有靶序列的存在，擴增的過程中探針分子逐漸被水解切斷，熒光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報告基團發(fā)出熒光信號。隨著擴增的進行，熒光信號隨著目的片段的擴增而呈現(xiàn)線性增強。實時熒光定量法首先對HIV-1靶核酸RNA逆轉(zhuǎn)錄(RT)，然后對其產(chǎn)物cDNA進行PCR擴增。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了 PCR從半定量到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性強、自動化程度高、有效解決了 PCR污染問題等特 本試劑盒采用TaqMan熒光探針技術(shù)，選取HIV基因組編碼區(qū)的相對保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計特異性引物及熒光探針，其中熒光探針5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團FAM，3’端標(biāo)記非熒光淬滅基團BHQ1，利用熒光PCR檢測儀可在FAM通道檢測熒光信號。同時設(shè)置了內(nèi)標(biāo)質(zhì)控系統(tǒng)，用于整個反應(yīng)體系的質(zhì)量控制。內(nèi)標(biāo)靶區(qū)域選取與HIV目標(biāo)區(qū)域一致，并在探針位置人工合成了一段寡核苷酸，設(shè)計特異性熒光探針，與任何物種均無交叉反應(yīng)，其中熒光探針5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團HEX,并與內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒共同組成內(nèi)標(biāo)質(zhì)控體系,可在VIC通道檢測熒光。對于待檢物而言，若檢測結(jié)果顯示典型的S型熒光增長曲線，則為陽性標(biāo)本，反之則為陰性。通過簡單易操作的核酸提取系統(tǒng)，結(jié)合實時熒光PCR檢測系統(tǒng)運行一步法RT-PCR擴增程序，本試劑盒實現(xiàn)了檢測的高效率、高靈敏和高特異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種熒光定量RT-PCR檢測人類免疫缺陷病毒I型的試劑盒，特別是涉及以一步法實時熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)快速、定量檢測人類免疫缺陷病毒I型感染的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過本發(fā)明的試劑盒實現(xiàn)對血清或血漿樣本中人類免疫缺陷病毒I型核酸RNA進行定量檢測，適用于人類免疫缺陷病毒I型感染的輔助診斷和人類免疫缺陷病毒I型感染者藥物治療的療效監(jiān)測。其基本原理是利用熒光PCR技術(shù)，以HIV基因中相對保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計特異性引物及熒光探針，在樣本核酸純化之后，通過含有逆轉(zhuǎn)錄酶(RT酶)、熱啟動Taq酶、RNA酶抑制劑(RNasin)的一步法RT-PCR對HIV-1RNA進行快速定量檢測。同時，試劑盒還帶有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，用于對核酸提取的整個過程進行監(jiān)控，減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。并檢測熒光信號，儀器軟件系統(tǒng)自動繪制出實時擴增曲線，根據(jù)閾循環(huán)值(CT值)實現(xiàn)對未知樣本的定量檢測。為了實現(xiàn)本發(fā)明，我們采用了以下技術(shù)方案I)使用適當(dāng)?shù)暮怂岱治鲕浖謩e對已知的Hiv-1基因的核苷酸序列進行同源性比較，在找出同源區(qū)段的基礎(chǔ)上，進一步使用適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計軟件選擇并設(shè)計寡核苷酸引物和探針。由于所設(shè)計的引物和探針均具有互補于Hiv-1基因的序列，而且與其他病原體的核苷酸序列沒有同源性，也不包括任何常見的核酸內(nèi)切酶的酶切位點，所以避免了人類免疫缺陷病毒I型檢測的假陰性和假陽性，提高了檢測的可靠性和準(zhǔn)確度。同時設(shè)置了內(nèi)標(biāo)質(zhì)控系統(tǒng)，用于整個反應(yīng)體系的質(zhì)量控制。內(nèi)標(biāo)靶區(qū)域選取與HIV目標(biāo)區(qū)域一致，并在探針位置人工合成了一段寡核苷酸，設(shè)計特異性熒光探針，與任何物種均無交叉反應(yīng)。2)使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物和探針，用分子篩和快速蛋白質(zhì)液相層析法(FPLC)純化后進行氨解處理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理后分別在其5’端標(biāo)記作為熒光發(fā)生基團(報告基團)的6-FAM amidite和HIX，并在其3’端標(biāo)記借助活性連接臂偶聯(lián)上作為熒光淬滅或抑制基團的BHQ1。以FPLC層析法純化熒光標(biāo)記的探針。然后，使用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20%)電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針。3)適宜于一步法RT-PCR擴增的反應(yīng)體系。反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動Taq酶、2’-脫氧核苷三磷酸、RNA酶抑制劑(RNasin)、能夠與 雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物、能夠與靶多聚核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針、能夠與內(nèi)標(biāo)核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的檢測內(nèi)標(biāo)的寡核苷酸探針、含有鎂離子的緩沖液。同時設(shè)置了內(nèi)標(biāo)質(zhì)控系統(tǒng)，用于整個反應(yīng)體系的質(zhì)量控制。選擇與HIV-1目的基因探針結(jié)合無關(guān)的序列(其他物種序列)作為內(nèi)標(biāo)設(shè)計的靶基因，在探針位置人工合成了一段寡核苷酸序列，應(yīng)用核酸分析軟件PC/GENE (瑞典PC/GENE公司出品)對上述檢索結(jié)果進行同源性比較，找出同源區(qū)段。4)從待測樣本中提取核酸RNA，分別加入前述的反應(yīng)體系中，直接經(jīng)一步法RT-PCR擴增，從熒光擴增曲線對未知樣本的核酸RNA進行定量檢測。基于以上技術(shù)方案發(fā)明的試劑盒包括(I)核酸提取試劑、HIV-1反應(yīng)液A、HIV-1反應(yīng)液B、HIV-1反應(yīng)液C、HIV-1內(nèi)標(biāo)溶液、陰性質(zhì)控品、HIV-1強陽性質(zhì)控品、HIV-1臨界陽性質(zhì)控品、HIV-1陽性定量參考品1-4，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中PCR反應(yīng)體系包括HIV-1反應(yīng)液A、HIV-1反應(yīng)液B和HIV-1反應(yīng)液C。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中HIV-1反應(yīng)液A (引物探針混合液)由正向引物、反向引物、目的的寡核苷酸探針、內(nèi)標(biāo)的寡核苷酸探針組成，其特征在于用于靶多核苷酸擴增的正向和反向引物分別是5’ -ATGGCAGTATTCATYCACAATT-3’ (SEQ ID NO 1)和5’-ATTATGTCTAYTATTCTTTCYCCTG-3’ (SEQ ID NO :2)。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其特征還在于用于靶多核苷酸擴增的寡核苷酸探針是 5’ -X-ACTGTAYCCCCCAATCCCCCCTT-Y-3’ (SEQ ID NO :3)，其中 X/Y 表示熒光標(biāo)記基團，包括能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其特征還在于用于靶多核苷酸擴增的引物探針濃度均為5 15pmol/人份,優(yōu)選引物濃度為IOpmol/人份、探針濃度為5pmol/人份。

根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，引物探針混合液中用于內(nèi)標(biāo)多核苷酸擴增的寡核苷酸探針是 5’-X-TGACGGACCACACTGACCAGAG-Y-3’ (SEQ ID NO :4)，其中 X/Y 表示熒光標(biāo)記基團，包括能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其特征還在于引物探針混合液中用于內(nèi)標(biāo)多核苷酸擴增的探針濃度為3 IOpmol/人份，優(yōu)選探針濃度為5pmol/人份。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，HIV-1反應(yīng)液B由逆轉(zhuǎn)錄酶(c-MMLV酶)、熱啟動Taq酶、RNasin、dNTPs、酶稀釋液組成。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其特征還在于c-MMLV酶用量為1. 5 3. 5U/人份、熱啟動Taq酶用量為3 7U/人份、RNasin用量為15 25U/人份、dNTPs濃度為
0.20mmol/L，酶稀釋液為一般市售的酶系稀釋液。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，HIV-1反應(yīng)液C包括一步法RT-PCR反應(yīng)緩沖液和 DEPC 水，其中一步法 RT-PCR 反應(yīng)緩沖液包含 10mmol/L Tris-HCl (pH8. O)、150mmol/LKC1、3. OmmoI/L MgCl20根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，陰性質(zhì)控品為陰性血漿，HIV-1強陽性質(zhì)控品和HIV-1臨界陽性質(zhì)控品均為含有HIV-1目的片段的病毒樣顆粒，且濃度分別為5. OX IO6和5.0X103IU/ml ;HIV_1陽性定量參考品1_4均為含有HIV-1目的片段的重組質(zhì)粒，濃度為
1.OXlO4-L OX 107IU/ml ;質(zhì)粒和病毒樣顆粒均由上下游引物擴增的PCR產(chǎn)物通過市售的載體克隆構(gòu)建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中用于PCR擴增的最佳反應(yīng)溫度和時間為50°C逆轉(zhuǎn)錄 15min，I 個循環(huán)；95°C 15min, I 個循環(huán)；最后 94°C 15s, 55°C 45s, 45 個循
環(huán)收集突光信號。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中試劑盒的待檢樣品是血清或血漿等樣品。本發(fā)明提供的一步法實時熒光RT-PCR試劑盒可以檢測出人類免疫缺陷病毒I型的最低濃度為100IU/ml，說明本試劑盒具有非常好的靈敏度。本發(fā)明針對人類免疫缺陷病毒I型基因設(shè)計特異性引物和探針，檢測的線性范圍為250IU/ml 1. OX 108IU/ml，與感染部位相同或感染癥狀相似的其他病毒(丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、EB病毒、人類皰疹病毒等)無交叉反應(yīng)。試劑盒的靈敏度為99. 80%，特異性為97. 76%。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(I)使用一步法RT-PCR對HIV-1RNA進行快速定量檢測，靈敏度，特異性高。(2)全封閉反應(yīng)，提取病毒核酸RNA以后，直接用于RT-PCR檢測，避免了污染發(fā)生。(3)試劑盒帶有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，可以用于對核酸提取和PCR擴增的整個過程進行監(jiān)控，從而減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。


圖1顯示HIV-1強陽性質(zhì)控品、HIV-1臨界陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和HIV-1陽性定量參考品1-4的檢測結(jié)果。HIV-1強陽性質(zhì)控品、HIV-1臨界陽性質(zhì)控品擴增曲線有FAM檢測通路擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，呈典型S型擴增曲線，且HIV-1強陽性質(zhì)控品定值范圍在1.0X106 2.0X107IU/ml ;HIV_1臨界陽性質(zhì)控品定值范圍在1. OX IO3
2.OX 104IU/ml ;可明確判定為陽性。陰性質(zhì)控品FAM檢測通路擴增曲線無對數(shù)增長期，VIC檢測通路擴增曲線為對數(shù)增長期；可明確判定為陰性。HIV-1陽性定量參考品1-4FAM檢測通路擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，呈典型S型曲線，CT值< 37，且R2 ^ O. 97，均符合質(zhì)量控制判斷標(biāo)準(zhǔn)。圖2顯示HIV-1RNA特異性參考品的檢測結(jié)果。8份特異性參考品的擴增曲線平直或斜向下且與基線無交叉，沒有Ct值，可明確判定為陰性。8份特異性參考品分別為正常人的標(biāo)本及來自于其他血源性病原微生物標(biāo)本，分別為乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)。圖3顯示靈敏度參考品的檢測結(jié)果。6份靈敏度參考品中HIV-1RNA靈敏度參考品BI B3必須檢出，且BI B3檢出值必須在允許范圍內(nèi)，B4檢測呈陽性反應(yīng)，B6檢測呈陰性反應(yīng)。
具體實施例方式下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實施例1 :人類免疫缺陷病毒I型試劑盒的檢測方法(I)標(biāo)本采集、運送和保存標(biāo)本采集
血清-用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入無菌的干燥玻璃管，室溫(22 25°C)放置30 60分鐘，血標(biāo)本可自發(fā)完全凝集析出血清，或直接使用水平離心機，1500rpm離心5分鐘；吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至1. 5ml滅菌離心管。血漿-用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入含EDTA_2Na(乙二胺四乙酸二鈉)或枸櫞酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5 10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，5 10分鐘后即可分離出血漿，轉(zhuǎn)移至1. 5ml滅菌離心管。標(biāo)本保存和運送所采集的標(biāo)本可立即用于測試，_20°C保存期為3個月；-70°C以下長期保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)本運送采用o°c冰壺。(2)核酸提取將待測樣本與陰性質(zhì)控品、HIV-1強陽性質(zhì)控品、HIV-1臨界陽性質(zhì)控品進行同步處理。a).在1. 5ml的無菌離心管內(nèi)加入50 μ I的蛋白酶K ;b) ·取樣本200 μ I加入離心管中；c).再加入200 μ I的裂解工作液(即已含Carrier RNA的病毒裂解液)，蓋緊管蓋，漩渦振蕩15秒以充分混勻，高速離心10秒(防止溫育時產(chǎn)生氣泡)，72°C 10分鐘。同時可將洗脫液置于72°C預(yù)熱；d).再加入250 μ I無水 乙醇，蓋緊管蓋，振蕩15秒；e).將混合液全部吸至離心柱，室溫下12，OOOrpm離心I分鐘，將離心柱裝至新的
收集管；f).將500 μ I的抑制物去除液加入離心柱，室溫下12，OOOrpm離心I分鐘，將離心
柱裝至新的收集管；g).將500 μ I的去離子液加入離心柱，室溫下12，OOOrpm離心I分鐘，將離心柱裝
至新的收集管；h).再次將500 μ I的去離子液加入離心柱，室溫下12，OOOrpm離心I分鐘，將離心
柱裝至新的收集管；i).將離心柱-收集管于室溫下14，OOOrpm離心3分鐘以除去殘余的乙醇；j).將離心柱取出，放置于新的1. 5ml離心管。打開離心柱蓋子，72°C放置2分鐘(使用干式恒溫器，不能使用水浴鍋)；k).在離心柱的膜的正上方小心加入72°C預(yù)熱的洗脫液50 μ 1，蓋緊離心柱管蓋，室溫靜置I分鐘后，14，OOOrpm離心I分鐘。離心管內(nèi)即為病毒核酸溶液,建議立即使用，如需保存，置于_20°C。(3) PCR 檢測a)配制體系將2 μ I HIV-1反應(yīng)液Α，3 μ I HIV-1反應(yīng)液B，25 μ I HIV-1反應(yīng)液C充分混合，然后分裝30 μ I至每個PCR反應(yīng)管。b)加樣往上述HIV-1反應(yīng)管中分別加入提取后的待測樣本核酸、陰性質(zhì)控品、HIV-1強陽性質(zhì)控品、HIV-1臨界陽性質(zhì)控品和直接加入HIV-1陽性定量參考品20 μ I。蓋緊管蓋，8，OOOrpm離心數(shù)秒后轉(zhuǎn)移至PCR擴增儀。
擴增程序設(shè)置
ABI7300/7500熒光PCR擴增儀的參數(shù)設(shè)置如下
Reporter Dye FAM
Quencher Dye none
Passive Reference none
如使用Roche LightCycler和達安的DA 7600無需設(shè)定以上參數(shù)。
擴增溫度參數(shù)統(tǒng)一設(shè)置如下
50 0C 15 分鐘；
95 0C 15 分鐘；
45個循環(huán)(94°C 15秒一550C 45秒)，熒光檢測選擇在55°C 45秒這一環(huán)節(jié)；
保存文件，運行。
(4)結(jié)果分析
反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start值可以在3 15、End值可設(shè)在5 20，在Log圖譜窗口設(shè)置Threshold的Value值，使基線位于擴增曲線指數(shù)期，調(diào)整陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線)，點擊Analysis自動獲得分析結(jié)果，在Iteport界面察看結(jié)果，記錄未知樣本數(shù)值(C)。
(5)結(jié)果判定
如果FAM檢測通道無對數(shù)增長期，且在VIC檢測通道有對數(shù)增長期，則判樣品的HIV-1RN濃度小于檢測靈敏度。
如果FAM熒光信號增幅明顯，擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，呈典型S型曲線，且Ct值< 45，則按以下方法判斷
若樣品的2. 50E+002彡C彡1. 00E+008，則該樣品的HIV-1RNA濃度=C IU/ml ；
若樣品的Ol. 00E+008,則該樣品的HIV-1RNA濃度>1. OX 108IU/ml。如果需要精確定量結(jié)果，可將樣品用陰性質(zhì)控品稀釋到線性范圍后再檢測。則該樣品的HIV-1RNA濃度=(CX稀釋倍數(shù))IU/ml ；
若樣品的 C < 2. 50E+002，則該樣品的 HIV-1RNA 濃度< 2. 5X 102IU/ml。
實施例2 :人類免疫缺陷病毒I型試劑盒中質(zhì)控品及陽性定量參考品的使用
人類免疫缺陷病毒I型試劑盒中質(zhì)控品及陽性定量參考品包括HIV-1強陽性質(zhì)控品，HIV-1臨界陽性質(zhì)控品，陰性質(zhì)控品和HIV-1陽性定量參考品1-4，用于臨床試驗中質(zhì)量控制，操作方法同待檢樣本。
質(zhì)量控制
陰性質(zhì)控品FAM檢測通路擴增曲線無對數(shù)增長期，VIC檢測通路擴增曲線為對數(shù)增長期
HIV-1陽性質(zhì)控品FAM檢測通路擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，呈典型S型擴增曲線，且HIV-1強陽性質(zhì)控品定值范圍在1. OXlO6 2. 0X107IU/ml ;HIV_1臨界陽性質(zhì)控品定值范圍在1. OXlO3 2. 0X104IU/ml ；
HIV-1陽性定量參考品FAM檢測通路擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，呈典型S型曲線，CT 值< 37，且 R2 ^ O. 97 ； 9
以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。檢測結(jié)果(見附圖1):陰性質(zhì)控品的擴增曲線不呈S型，陽性質(zhì)控品的擴增曲線為明顯S型曲線，HIV-1陽性定量參考品1-4FAM檢測通路擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，呈典型S型曲線，陰、陽性質(zhì)控品和HIV-1陽性定量參考品1-4均符合試劑盒的質(zhì)控要求，因此待檢標(biāo)本的檢測結(jié)果是有效的。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施 只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種熒光定量RT-PCR檢測人類免疫缺陷病毒I型的試劑盒，試劑盒包括(1)核酸提取試劑、HIV-1反應(yīng)液A、HIV-1反應(yīng)液B、HIV-1反應(yīng)液C、HIV-1內(nèi)標(biāo)溶液、陰性質(zhì)控品、HIV-1強陽性質(zhì)控品、HIV-1臨界陽性質(zhì)控品、HIV-1陽性定量參考品1_4，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中PCR反應(yīng)體系包括HIV-1反應(yīng)液A、HIV-1反應(yīng)液B和HIV-1反應(yīng)液C，其特征在于HIV-1反應(yīng)液A(引物探針混合液)中用于靶多核苷酸擴增的正向和反向引物分別是5’-ATGGCAGTATTCATYCACAATT-3’ (SEQ ID NO:1)5’-ATTATGTCTAYTATTCTTTCYCCTG-3’ (SEQ ID NO 2) 用于靶多核苷酸擴增的寡核苷酸探針是5’ -X-ACTGTAYCCCCCAATCCCCCCTT-Y-3’ (SEQID NO :3)，其中X/Y表示熒光標(biāo)記基團，包括能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針； 用于內(nèi)標(biāo)多核苷酸擴增的寡核苷酸探針是5’ -X-TGACGGACCACACTGACCAGAG-Y-3’ (SEQID NO :4)，其中X/Y表示熒光標(biāo)記基團。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于正、反向引物的濃度均為IOpmol/人份，目的寡核苷酸探針、內(nèi)標(biāo)寡核苷酸探針的濃度均為5pmol/人份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，HIV-1反應(yīng)液B由逆轉(zhuǎn)錄酶(c-MMLV酶)、熱啟動Taq酶、RNasin、dNTPs、酶稀釋液組成，其中c-MMLV酶用量為1. 5 3. 5U/人份、熱啟動Taq酶用量為3 7U/人份、RNasin用量為15 25U/人份、dNTPs濃度為O. 20mmol/L,酶稀釋液為一般市售的酶系稀釋液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，HIV-1反應(yīng)液C包括一步法RT-PCR反應(yīng)緩沖液和DEPC水，其中一步法 RT-PCR 反應(yīng)緩沖液包含 10mmol/L Tris-HCl (pH8. O)、150mmol/L KCl,3.Ommol/L MgCl20
5.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR擴增的最佳反應(yīng)溫度和時間為50°C逆轉(zhuǎn)錄15min，l個循環(huán)；95°C 15min，I個循環(huán)；最后94°C 15s，55°C 45s，45個循環(huán)收集熒光信號。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于陰性質(zhì)控品為陰性血漿，HIV-1強陽性質(zhì)控品和HIV-1臨界陽性質(zhì)控品均為含有HIV-1目的片段的病毒樣顆粒，且濃度分別為5.O X IO6和5. O X 103IU/ml ;HIV_1陽性定量參考品1_4均為含有HIV-1目的片段的重組質(zhì)粒，濃度為1. OXlO4-L OX 107IU/ml ;質(zhì)粒和病毒樣顆粒均由上下游引物擴增的PCR產(chǎn)物通過市售的載體克隆構(gòu)建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于試劑盒的待檢樣品是血清或血漿等樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熒光定量RT-PCR檢測人類免疫缺陷病毒1型的試劑盒，特別是涉及以一步法實時熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)快速、定量檢測人類免疫缺陷病毒1型感染的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過本發(fā)明的試劑盒實現(xiàn)對血清或血漿樣本中人類免疫缺陷病毒1型核酸RNA進行定量檢測，適用于人類免疫缺陷病毒1型感染的輔助診斷和人類免疫缺陷病毒1型感染者藥物治療的療效監(jiān)測。
文檔編號C12Q1/70GK103045756SQ201210014378
公開日2013年4月17日 申請日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者李明, 丁渭, 陳華云 申請人:中山大學(xué)達安基因股份有限公司