專利名稱：一種從源頭上降低發酵抑制物的方法
技術領域：
本發明涉及一種降低木質纖維素來源的發酵抑制物的方法，特別涉及以蒸汽爆破技術為核心的預處理方法。
背景技術：
木質纖維素的結構與組成復雜，其中，主要以葡萄糖基組成的纖維素結構致密， 較難水解，而以多種雜糖基組成的半纖維素，結構比較松散，預處理可以被水解成單糖。 目前正在研究的有多種木質纖維素原料預處理方法，例如酸水解、蒸汽爆破、氨纖維爆破及濕氧化法等。各種不同的預處理過程都產生多種化合物，其種類及含量隨纖維素原料性質及預處理條件的不同而不同，主要形成3類微生物生長抑制物1)弱酸乙酸、甲酸、乙酰丙酸等。乙酸由半纖維素脫乙酰生成，甲酸和乙酰丙酸是5-羥甲基糠醛(HMF， 5-Hydroxymethylfurfural)的降解產物，同時甲酸也可由糠醒在酸性環境下降解產生；2) 呋喃醛類主要是糠醛(Furfural)和HMF，分別由戊糖和己糖在酸性環境下脫水生成；3) 酚類化合物主要由木素降解形成。蒸汽爆破技術被認為是植物纖維預處理的一項最具前景和最經濟高效的技術。原料用蒸汽加熱至180-235°C，維壓一定時間，在突然減壓噴放時，體積猛增，受機械力的作用，其固體物料結構被破壞。蒸汽爆碎的幾個優點可歸納如下(I)可應用于各種植物生物質，預處理條件容易調節控制。(2)半纖維素、木質素和纖維素三種組分會在三個不同的流程中分離，分別為水溶組分、堿溶組分和堿不溶組分。(3)纖維素的酶解轉化率可達到理論最大值。(4)經過蒸汽處理后的木質素仍能夠用于其他化學產品的轉化。(5)半纖維素產生的糖可以被全利用，轉化為液體燃料。(6)汽爆過程中產生的發酵抑制物可通過控制汽爆條件而大大降低。該預處理方法適用于硬木、軟木、農業廢棄物，如蔗渣、麥草、稻草、玉米秸桿和其他非纖維素原料等各種植物生物質，而且正在這方面發揮越來越大的作用。但是，蒸汽爆破預處理技術最大的缺點就是仍會產生一些含量相對其他預處理技術少的發酵抑制物。這些抑制物對隨后發酵微生物的抑制，已成為木質纖維素生物加工過程的主要瓶頸之一。須采取必要的應對抑制物的措施以減少或消除其抑制作用。人們嘗試了多種方法對木質纖維素水解液進行發酵前的脫毒處理，包括生物學、物理及化學方法等及不同措施組合使用。生物學方法包括利用特定酶(例如漆酶laccase)或微生物對水解液進行脫毒處理。漆酶是一類含銅氧化還原酶，專一性地對酚類底物分子進行單電子氧化，生成相應的活性自由基，活性的中間物隨后轉變為二聚體、寡聚體和高聚物。在這一過程中小分子量酚類化合物發生了氧化聚合反應，生成了毒性較低的高分子量化合物，從而減少了木質纖維素預處理液中酚類物質的毒性。Mussatto等用只能利用乙酸生長的釀酒酵母突變株處理水解液，使其中的乙酸濃度由6. 8g/L降低至O. 4g/L。物理方法有真空干燥濃縮、蒸煮、活性炭吸附、離子交換吸附及溶劑萃取等，真空濃縮及蒸煮可以使揮發性抑制物大量減少，離子交換及溶劑萃取可有效降低乙酸、呋喃醛及酚類化合物含量；化學方法包括利用各種堿 (NH40H、NaOH, Ca (OH) 2等)及過量石灰法等對水解液處理，其中NH40H能有效去除呋喃醛類物質，過量石灰處理可以有效提高水解液中單糖利用率。另外，水洗預處理原料也是一種簡單的脫毒過程。將2種或多種方法聯合使用可以達到更好的脫毒效果。但是，脫毒步驟無疑增加了生物基產品的發酵成本，使工藝過程更為復雜，同時也導致一部分可發酵性糖的損失，所以在發酵過程中須盡量減少發酵前的脫毒環節。可行的方法有選育高抗性菌株，提高其自身內在的耐受能力，或者從源頭上優化水解工藝控制抑制物的產生，降低其含量。木質纖維素原料具有復雜的、不均一的多級結構。從化學成分上看，木質纖維原料的化學成分包括纖維素、半纖維素和木質素。從細胞組成上看，包括纖維狀的纖維細胞和雜細胞(包括導管、薄壁細胞、表皮細胞等)。纖維細胞是植物纖維原料中最主要、最基本的細胞，是植物原料的支持組織，纖維細胞一般具有發達的次生壁(即厚度較大)。植物原料中另一類比較重要的細胞是薄壁細胞，在植物生長中起著儲存營養的作用，薄壁細胞腔大、壁薄、長度短的特點。鑒于2類細胞的結構和形態上的差異，可知這2類細胞所要求的預處理條件不一樣。纖維細胞，細胞壁木質化程度高，結構致密，受熱過程中其傳質傳熱阻力大，且不易被撕裂；薄壁細胞，壁薄而腔大，即利于傳質傳熱，又利于水蒸汽閃蒸對其物理撕裂。不同原料中，這兩類細胞的含量、結構各不相同，這就從本質上決定了其所需的處理條件的差異。因此，可以針對不同組織細胞分別優化處理條件，從而達到各自最好的水解效果并且副反應程度控制在最小。本發明開發的二段汽爆分梳工藝，不同于傳統所指的二段汽爆工藝，這里是指采用較溫和的汽爆條件進行第一段汽爆，通過氣流分級裝置將第一段物料分級，得到薄壁組織和纖維組織，再將纖維組織在合適的條件下進行第二段汽爆。二段汽爆分梳工藝有效的針對其各組織的特征要求選擇性的進行預處理，既能保證纖維組織達到較好的預處理效果，又能避免薄壁組織的過度降解，從而提高纖維原料的酶解率的同時，又能有效控制副反應的發生，即降低抑制物含量，省去了脫毒單元操作的引入，簡化了工藝。另外，該工藝中， 纖維細胞和薄壁細胞的分離和選擇性預處理，為木質纖維原料的分層多級轉化和生物量權利用提供了新途徑，且二段汽爆分梳工藝還有助于纖維原料的復水均勻，降低了第二段物料的汽爆條件且減少了生料含量，提高了原料的利用率。

發明內容
本發明的目的是針對目前木質纖維素預處理過程中產生發酵抑制物已成為木質纖維素生物加工過程的主要瓶頸之一，而常采用的脫毒工序不僅增加了生物基產品的發酵成本，使工藝過程更為復雜，而且也導致一部分可發酵性糖的損失等問題，開發了新型的二段汽爆分梳工藝。這里的二段汽爆分梳工藝，不同于傳統所指的二段汽爆工藝，是指采用較溫和的汽爆條件進行第一段汽爆，通過氣流分級裝置將第一段物料分級，得到薄壁組織和纖維組織，再將纖維組織在合適的條件下進行第二段汽爆。本發明的技術方案如下本發明提供的從源頭上降低木質纖維素來源的發酵抑制物含量的新型二段汽爆分梳工藝，其包括以下步驟1)在壓力為O. 5 I. 5MPa,時間為I IOmin的汽爆條件進行對秸桿原料進行第一段蒸汽爆破處理；2)通過氣流分級裝置將第一段汽爆物料進行分級，得到薄壁組織和纖維組織；3)將分梳得到的纖維組織在壓力為O. 5 I. 5MPa，時間為I IOmin的條件下進行第二段蒸汽爆破處理；4)分別對第一段汽爆、分梳以及第二段汽爆后的物料進行酶解和發酵；5)分別測定秸桿原料、第一段汽爆物料、分梳后的薄壁組織和纖維組織以及第二段汽爆物料的含水率、水洗液中的抑制物含量、酶解率以及發酵產物的轉化率。 本發明中，酶解條件為汽爆稻桿與pH 4. 850mM朽1檬酸緩沖液的固液比為 I 10-1 30，加酶量為15IU/g-110/g底物，在50°C，150rpm的水浴搖床中酶解24-120h。 然后，離心過濾得酶解液。本發明的有益效果為(I) 二段汽爆分梳工藝有效的針對其各組織的特征要求選擇性的進行預處理，既能保證纖維組織達到較好的預處理效果，又能避免薄壁組織的過度降解，從而提高纖維原料的酶解率的同時，又能有效控制副反應的發生，即降低抑制物含量，省去了脫毒單元操作的引入，簡化了工藝。(2)該工藝中，纖維細胞和薄壁細胞的分離和選擇性預處理，為木質纖維原料的分層多級轉化和生物量權利用提供了新途徑。(3) 二段汽爆分梳工藝有助于纖維原料的復水均勻，降低了第二段物料的汽爆條件且減少了生料含量，提高了原料的利用率。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明做進一步說明。本發明實施例中使用的纖維素酶制劑購自夏盛公司，110FPA IU/ml，1200IU xylanase/ml。實施例I :稱取200g干玉米秸桿放入汽爆罐中，密閉后通入水蒸氣，使罐壓迅速升至I. IMPa，在此壓力下維持4min后，迅速放壓，從而制得第一段汽爆秸桿。取適量第一段汽爆秸桿，在離心式氣流分級裝置上進行分梳，分別得到薄壁組織和纖維組織。稱取適量分梳后的纖維組織，放入汽爆罐中，密閉后通入水蒸氣，使罐壓迅速升至I. 2MPa，在此壓力下維持4min后，迅速放壓，從而制得第二段汽爆秸桿。預處理條件為1.2MPa、8min、不分梳為預處理對照組。分別稱取第一段汽爆秸桿、分梳后的汽爆秸桿、第二段汽爆秸桿以及對照組汽爆稻桿lg(dry base),溶入20ml水于70°C浸提2h,取上清液，采用高效液相(Agilent 1200HPLC，美國)測定水解液中的糠醛和羥甲基糠醛(HMF)含量，采用紫外分光光度計在 280nm測定水解液中的可溶性木質素含量?？啡?、羥甲基糠醛(HMF)以及可溶性木質素含量之和即為水解液中抑制物含量。分別稱取第一段汽爆秸桿、分梳后的汽爆秸桿以及第二段汽爆秸桿以及預處理對照組汽爆秸桿10g，加入200ml pH 4. 850mM檸檬酸緩沖液中，加入O. 5ml纖維素酶，在50°C， 150rpm的水浴搖床中酶解48h。采用DNS法測酶解液中還原糖含量。然后，離心過濾得酶解液。取20ml酶解液,補水至40ml,加入O. 24g磷酸二氫鉀、O. 4g蛋白胨,補加葡萄糖至酶解液中初始糖濃為25g/L,加入2mL serratia marcescens種子液,調節pH為5,在37°C厭氧發酵48h。只以葡萄糖為碳源的發酵對照組。以采用HPLC測定2，3-丁二醇含量。最終折合抑制物含量為分梳后的薄壁組織中的含量與第二段汽爆后的物料的含量之和，2，3_ 丁二醇含量同理可算。結果表明實驗組的抑制物含量比預處理對照組的抑制物含量低33%，且實驗組的 2，3-丁二醇含量比只以糖為碳源的2，3-丁二醇發酵對照組高5. I %，而預處理對照組的2，3-丁二醇含量比只以糖為碳源的2，3-丁二醇發酵對照組低66. 7%。實施例2 :稱取200g干玉米秸桿放入汽爆罐中，密閉后通入水蒸氣，使罐壓迅速升至I. 2MPa，在此壓力下維持4min后，迅速放壓，從而制得第一段汽爆秸桿。取適量第一段汽爆秸桿，在離心式氣流分級裝置上進行分梳，分別得到薄壁組織和纖維組織。稱取適量分梳后的纖維組織，放入汽爆罐中，密閉后通入水蒸氣，使罐壓迅速升至I. 2MPa，在此壓力下維持4min后，迅速放壓，從而制得第二段汽爆秸桿。預處理條件為1.2MPa、8min、不分梳為預處理對照組。分別稱取第一段汽爆秸桿、分梳后的汽爆秸桿、第二段汽爆秸桿以及對照組汽爆稻桿lg(dry base),溶入20ml水于70°C浸提2h,取上清液，采用高效液相(Agilent 1200HPLC，美國)測定水解液中的糠醛和羥甲基糠醛(HMF)含量，采用紫外分光光度計在 280nm測定水解液中的可溶性木質素含量?？啡?、羥甲基糠醛(HMF)以及可溶性木質素含量之和即為水解液中抑制物含量。分別稱取第一段汽爆秸桿、分梳后的汽爆秸桿以及第二段汽爆秸桿以及預處理對照組汽爆秸桿10g，加入200ml pH 4. 850mM檸檬酸緩沖液中，加入O. 5ml纖維素酶，在50°C， 150rpm的水浴搖床中酶解48h。采用DNS法測酶解液中還原糖含量。然后，離心過濾得酶解液。取20ml酶解液,補水至40ml,加入O. 24g磷酸二氫鉀、O. 4g蛋白胨,補加葡萄糖至酶解液中初始糖濃為25g/L,加入2mL serratiamarcescens種子液,調節pH為5,在37°C厭氧發酵48h。只以葡萄糖為碳源的發酵對照組。以采用HPLC測定2，3-丁二醇含量。最終折合抑制物含量為分梳后的薄壁組織中的含量與第二段汽爆后的物料的含量之和，2，3_ 丁二醇含量同理可算。結果表明實驗組的抑制物含量比預處理對照組的抑制物含量低27%，且實驗組的 2，3-丁二醇含量比只以糖為碳源的2，3-丁二醇發酵對照組高4. 3%，而預處理對照組的2，
3-丁二醇含量比只以糖為碳源的2，3-丁二醇發酵對照組低66. 5%。實施例3 :稱取200g干玉米秸桿放入汽爆罐中，密閉后通入水蒸氣，使罐壓迅速升至I. IMPa，在此壓力下維持4min后，迅速放壓，從而制得第一段汽爆秸桿。取適量第一段汽爆秸桿，在離心式氣流分級裝置上進行分梳，分別得到薄壁組織和纖維組織。稱取適量分梳后的纖維組織，放入汽爆罐中，密閉后通入水蒸氣，使罐壓迅速升至I. 2MPa，在此壓力下維持4min后，迅速放壓，從而制得第二段汽爆秸桿。預處理條件為1.2MPa、8min、不分梳為預處理對照組。分別稱取第一段汽爆秸桿、分梳后的汽爆秸桿、第二段汽爆秸桿以及對照組汽爆稻桿lg(dry base),溶入20ml水于70°C浸提2h,取上清液，采用高效液相(Agilent 1200HPLC，美國)測定水解液中的糠醛和羥甲基糠醛(HMF)含量，采用紫外分光光度計在 280nm測定水解液中的可溶性木質素含量?？啡⒘u甲基糠醛(HMF)以及可溶性木質素含量之和即為水解液中抑制物含量。分別稱取第一段汽爆秸桿、分梳后的汽爆秸桿以及第二段汽爆秸桿以及預處理對照組汽爆秸桿10g，加入200ml pH 4. 850mM檸檬酸緩沖液中，加入O. 5ml纖維素酶，在50°C， 150rpm的水浴搖床中酶解48h。采用DNS法測酶解液中還原糖含量。然后，離心過濾得酶解液。取40ml酶解液，加入O. 2g磷酸二氫鉀、O. 08g硫酸銨、O. 016g硫酸鎂、O. 008g氯化鈣、O. 08g酵母粉。補加葡萄糖至酶解液中初始糖濃為25g/L，加入2mL安琪酵母種子液，調
6節pH為5.5，在32°C厭氧發酵48h。只以葡萄糖為碳源的發酵對照組。采用HPLC測定乙醇含量。最終折合抑制物含量為分梳后的薄壁組織中的含量與第二段汽爆后的物料的含量之和，乙醇含量同理可算。結果表明實驗組的抑制物含量比預處理對照組的抑制物含量低33%。實驗組的乙醇含量比預處理對照組的乙醇含量高13. 8%，且分別比只以糖為碳源的乙醇發酵對照組低 22. 4%和 33%。
權利要求
1.一種從源頭上降低木質纖維素來源的發酵抑制物的方法，包括以下步驟.1)對秸桿原料進行第一段蒸汽爆破處理；.2)將第一段汽爆物料進行分梳，得到薄壁組織和纖維組織；.3)對分梳得到的纖維組織進行第二段蒸汽爆破處理；.4)分別對第一段汽爆、分梳以及第二段汽爆后的物料進行酶解和發酵；.5)分別測定秸桿原料、第一段汽爆物料、分梳后的薄壁組織和纖維組織以及第二段汽爆物料的含水率、水洗液中的抑制物含量、以及發酵產物含量。
2.根據權利要求I所述的方法，其中步驟I)的第一段蒸汽爆破處理是在汽爆罐中在.O.5 I. 5MP a的蒸汽壓力下進行I lOmin。
3.根據權利要求I所述的方法，其中步驟3)的第二段蒸汽爆破處理是在汽爆罐中在.O.5 I. 5MP a的蒸汽壓力下進行I lOmin。
4.根據權利要求I所述的方法，其中步驟4)中的酶解條件為汽爆秸桿與pH4.8且濃度為50mM檸檬酸緩沖液的固液比為I : 10 I : 30，加酶量為15IU/g 110/g底物， 在50°C，100 200rpm的搖床中酶解24 120h。然后，離心得酶解液。
全文摘要
本發明公開了一種從源頭上降低木質纖維素來源的發酵抑制物的方法，該方法將蒸汽爆破技術和氣流分級技術組合起來應用于木質纖維原料的預處理。二段汽爆分梳工藝有效的針對纖維原料各組織的特征選擇性的進行預處理，既能保證纖維組織達到較好的預處理效果，又能避免薄壁組織的過度降解，從而提高纖維原料的酶解率的同時，又能有效控制副反應的發生，即降低抑制物含量，省去了脫毒單元操作的引入，簡化了工藝。另外，該工藝中，纖維細胞和薄壁細胞的分離和選擇性預處理，為木質纖維原料的分層多級轉化和生物量權利用提供了新途徑，且二段汽爆分梳工藝還有助于纖維原料的復水均勻，降低了第二段物料的汽爆條件且減少了生料含量，提高了原料的利用率。
文檔編號C12P7/18GK102586342SQ20121001479
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月17日 優先權日2012年1月17日
發明者張玉針, 陳洪章 申請人:中國科學院過程工程研究所