專利名稱：一種用于檢測溶血性鏈球菌的核酸適體、互補序列及檢測方法
技術領域：
本發明屬于臨床檢驗領域、食品檢測領域，具體涉及一種以膠體金的熒光淬滅為基礎的核酸適體、互補序列及檢測溶血性鏈球菌的方法。
背景技術：
溶血性鏈球菌呈球形或橢圓形 ，直徑O. 6-1. O μ m,呈鏈狀排列，長短不一，從4-8個至20-30個菌細胞組成不等，鏈的長短與細菌的種類及生長環境有關。該菌不形成芽胞，無鞭毛，易被普通的堿性染料著色，革蘭氏陽性，老齡培養或被中性粒細胞吞噬后，轉為革蘭氏陰性。該菌為需氧或兼性厭氧菌，營養要求較高，普通培養基上生長不良，需補充血清、血液、腹水，大多數菌株需核黃素、維生素B6、煙酸等生長因子。最適生長溫度為37°C，在20-42°C能生長，最適pH為7.4-7.6。在血清肉湯中易成長鏈，管底呈絮狀或顆粒狀沉淀生長。在血平板上形成灰白色、半透明、表面光滑、邊緣整齊、直徑O. 5-0. 75mm的細小菌落，不同菌株溶血程度不一。溶血性鏈球菌在自然界中分布較廣，存在于水、空氣、塵埃、糞便及健康人和動物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通過直接接觸、空氣飛沫傳播或通過皮膚、粘膜傷口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也會對人類進行感染。一般來說，溶血性鏈球菌常通過以下途徑污染食品1、食品加工或銷售人員口腔、鼻腔、手、面部有化膿性炎癥時造成食品的污染；2、食品在加工前就已帶菌、奶牛患化膿性乳腺炎或畜禽局部化膿時，其奶和肉尸某些部位污染；3、熟食制品因包裝不善而使食品受到污染。溶血性鏈球菌是一種常見的病原微生物，可引起食物中毒與臨床感染，感染人體可導致新生兒敗血癥、腦膜炎、肺炎等多種嚴重感染性疾病，甚至死亡。溶血性鏈球菌感染具有傳染源廣，危害大等特點，同時該菌的自然來源較廣。其相關檢測技術較繁瑣，檢測周期長，按照國家食品微生物檢測標準GB4789程序培養檢測需要3天時間，同時儀器設備硬件要求高。隨著分子生物學的發展，現在已建立了以PCR為基礎的多項檢測技術如免疫PCR、實時定量PCR、多重PCR，及以抗原檢測為主的免疫學檢測法。針對溶血性鏈球菌scpA基因設計特異性LAMP擴增引物，進行等溫擴增，能有效地檢出致病性溶血性鏈球菌。這些檢測方法快捷、靈敏，準確度較高。但是，這些針對單一族溶血性鏈球菌的現代檢測方法均需一定的設備和技術要求，且試劑費用較貴，難以推廣普及。因此，建立溶血性鏈球菌特別是致病性菌株的準確快速檢測對于控制該類細菌引起的食物中毒具有重要意義因此進一步探索該菌的快速、靈敏的檢測方法對食品中該菌的污染監測、該菌的疾病診斷和流行病學調查顯得尤為重要。

發明內容
本發明的目的在于提供以膠體金淬滅熒光為基礎的一種用于檢測溶血性鏈球菌的核酸適體、互補序列及檢測方法，本發明的方法能快速、特異、靈敏地檢測溶血性鏈球菌。為實現上述目的，本發明采取的技術方案為一種用于檢測溶血性鏈球菌的核酸適體及其互補序列，核酸適體的序列命名為序列A，互補序列命名為序列B，具體序列如下序列A :5，-CAGATGCACACGCTGAAGAAACTGAGGTCGTAGGTTTTCTTCGGG-3’ ；序列B :5，-CGTGTGCATCTGAAAAAAAAAA-SH3，；其中序列A的5’端有突光報 告基團。進一步的，所述的熒光報告基團為FAM。本發明還提供了一種用于檢測溶血性鏈球菌的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟I)采用常規方法制備納米金顆粒；2)納米金顆粒與互補序列反應，形成互補寡核苷酸的納米金顆粒覆蓋體；3))將步驟2制備的互補寡核苷酸的納米金顆粒覆蓋體，與權利要I或2所述的核酸適體反應，覆蓋體上的納米金顆粒猝滅核酸適體上的熒光報告基團發出的熒光信號；4)在步驟3的反應體系中，加入溶血性鏈球菌，溶血性鏈球菌與核酸適體特異性結合，使其與覆蓋有納米金顆粒的互補寡核苷酸分離，釋放出的核酸適體標記的熒光基團使熒光信號重新恢復。用熒光分光光度計測量熒光信號強度以檢測溶血性鏈球菌的量，其最低檢測限為33CFU/ml。本發明采用納米金顆粒與核酸適體序列結合快速檢測溶血性鏈球菌的原理利用與溶血性鏈球菌特異性結合的單鏈DNA核酸適體既可以與靶蛋白特異結合又能與互補寡聚核苷酸形成雙鏈的特點，利用納米金顆粒猝滅熒光染料的特點，通過將溶血性鏈球菌引入到體系中后熒光信號的改變，用熒光分光光度計測量熒光信號強度來實現對溶血性鏈球菌的分析。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果I)特異性強本發明尋找并合成了與溶血性鏈球菌特異性結合的帶有熒光報告基團FAM的核酸適體。并用阪崎腸桿菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌作為對照菌株。此核酸適體僅與溶血性鏈球菌有高特異性結合，與其他對照菌株結合較弱。因此能對溶血性鏈球菌進行特異性檢測。2)靈敏度高最低檢測限為33cfu/ml。3)檢測效率高檢測周期由國標方法(GB4788. 11-2003)的3天縮短為增菌24h后歷經30min左右孵育反應，檢測時間短，且可同時檢測多個樣品，檢測量大。4)操作簡單操作步驟簡單，結果直接客觀，對操作人員要求不高。5)安全性高不需用到有毒害的試劑，對操作人員有一定的保護性。


圖1納米金顆粒的透射電鏡照片。圖2溶血性鏈球菌和標記熒光的核酸適體結合激發熒光光譜。圖3不同濃度溶血性鏈球菌與標記熒光的核酸適體結合激發熒光光譜。
圖4不同細菌與標記熒光的核酸適體結合激發熒光光譜。圖5以Logltl [溶血性鏈球菌濃度]為X軸，最大熒光強度為Y軸繪制的校正曲線。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明。實施例一1、實驗材料1.1熒光分光光度計測量(日本日立公司F7000);透射電子顯微鏡(JEM-1230，JEOL，Japan) ;pH 計(上海 REX 儀器廠)
1. 2培養基腦心浸液肉湯、血平板由廣東環凱微生物科技有限公司生產。1. 3菌種溶血性鏈球菌[CMCC(B) 32210]、金黃色葡萄球菌[ATCC6538]、沙門氏菌[CMCC(B) 50115]、銅綠假單胞菌[CMCC (B) 10104]、阪崎桿菌[ATCC29004]。2、合成了一條能與溶血性鏈球菌特異性結合的標記了 FAM的核酸適體序列；同時合成了一條DNA靶序列的互補序列。3、樣品處理生物安全柜中按GB4789. 11-2003要求進行樣品稀釋及增菌，樣品增菌液于37 °C培養箱中培養24h.4、使用的陽性對照菌株為β -溶血溶血性鏈球菌，陰性對照菌株為阪崎桿菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌。將上述菌種分別接于腦心浸液肉湯培養基中，36°C培養24h。取β -溶血溶血性鏈球菌培養液1ml，進行10倍比稀釋，得到IOc1-1O8系列稀釋度的菌懸液，分別從不同稀釋度的菌懸液中取lml，涂布于血平板，計算菌液的密度。剩下的培養液IOOOOrpm,離心lOmin。其他的陰性菌株也按上述方法培養,離心,但不做計數。5、合成納米金顆粒檸檬酸鈉(38. SmM ;50毫升)迅速添加到沸騰的氯金酸(I毫米，250毫升)。不停地攪拌煮沸15分鐘。在5分鐘內溶液的顏色從淺黃色變成深紅色，讓其冷卻至室溫。制備的納米金顆粒存放在4°C。通過透射電子顯微鏡檢測納米金顆粒的濃度。透射電鏡拍攝納米金顆粒，納米金顆粒的平均直徑為17. 94±O. lnm，結果見圖1。6、將納米金顆粒與互補的寡核苷酸反應O. 50D巰基化的DNA適體加入ImllOnM的的納米金顆粒。16小時后，將2M NaCl溶液慢慢加入混合物，放置8h ;隨后加入O. 2M NaCl，放置8h ;再加入O.1M NaCl，放置8h ；最后，用O. 3M NaCl對混合液進行處理。將經過上述的鹽化處理過程的溶液12000rpm離心15min，用O. 3M NaCl和IOmM磷酸鹽緩沖液(pH7. O)將紅色沉淀洗三遍。最后用O. 3M NaCl和IOmM磷酸鹽緩沖液(pH7. O)將膠體重懸，將固定好的覆蓋了納米金顆粒的寡核苷酸放在4°C備用。將I μ M靶DNA加到上述溶液中。混合物雜交過夜后12000rpm離心15分鐘。最后紅色沉淀重懸于在O. 3M NaCl和IOmM磷酸鹽緩沖液(pH值7. O)緩沖液中。7、溶血性鏈球菌的測定PBS 緩沖液(2M NaCl 和 IOmM 磷酸鹽(pH :7. O) ；0. 3M NaCl 和 IOmM 磷酸鹽(pH 值7.0) ;10mM磷酸鹽(pH值7. O))將60 μ L的核酸適體覆蓋的納米探針與不同濃度溶血性鏈球菌混合。然后在25°C室溫下孵育30分鐘，最后，用熒光分光光度計測量。本發明采用的方法檢測周期由國標方法(GB4788. 11-2003)的3天縮短為增菌24h后歷經30min左右孵育反應，檢測時間短，檢測效率高，且可同時檢測多個樣品，檢測量大。8、熒光測定在FAM的最大吸收波長(490nm)下，當FAM標記的核酸適體存在時，能觀察到顯著的熒光發射強度(圖2)。與納米金反應后，熒光信號被猝滅。然而，在515nm下存在IO8CFU/ml溶血性鏈球菌的熒光強度是不含溶血性鏈球菌熒光強度的2. 5倍，因此本發明提供的方法特異性強。觀察到的熒光猝滅現象很大程度取決于納米金顆粒的超高的猝滅熒光的能力。當溶血性鏈球菌的濃度從102CFU/mL到107CFU/mL，在515nm波長下，熒光信號逐漸增加。9、檢測限以Logltl[溶血性鏈球菌濃度]為X軸，最大熒光強度為Y軸繪制校正曲線。檢測 溶血性鏈球菌線性范圍在4. 9X 104-4. 9X 107CFU/mL，以最低值計算檢出限33CFU/mL (根據IUPAC定義(⑶L = 3Sb/m))，因此本發明提供的的方法靈敏度高。本發明適用于醫療、生物技術、環保、食品飲料、奶制品、釀酒、水務處理等各領域，廣泛應用于醫療保健食品工業、制藥、生物研究等領域的溶血性鏈球菌的檢測。以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式
，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應該以權利要求書的保護范圍為準。
權利要求
1.一種用于檢測溶血性鏈球菌的核酸適體及其互補序列，其特征在于核酸適體的序列命名為序列A，互補序列命名為序列B，具體序列如下序列 A :5’ -CAGATGCACACGCTGAAGAAACTGAGGTCGTAGGTTTTCTTCGGG-3’ ；序列 B :5’ -CGTGTGCATCTGAAAAAAAAAA-SH3’ ；其中序列A的5’端標記有突光報告基團。
2.根據權利要求1所述的核酸適體及其互補序列，其特征在于，所述的熒光報告基團為 FAM。
3.一種用于檢測溶血性鏈球菌的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟1)采用常規方法制備納米金顆粒；2)納米金顆粒與權利要求1或2所述的互補序列反應，形成互補寡核苷酸的納米金顆粒覆蓋體；3)將步驟2制備的互補寡核苷酸的納米金顆粒覆蓋體，與權利要I或2所述的核酸適體反應，覆蓋體上的納米金顆粒猝滅核酸適體上的熒光報告基團發出的熒光信號；4)在步驟3的反應體系中，加入溶血性鏈球菌，溶血性鏈球菌與核酸適體特異性結合， 使其與覆蓋有納米金顆粒的互補寡核苷酸分離，釋放出的核酸適體標記的熒光報告基團使熒光信號重新恢復。
4.根據權利要求3所述的一種用于檢測溶血性鏈球菌的檢測方法，其特征在于所述的熒光信號是用熒光分光光度計測量的，其最低檢測限為33CFU/ml。
5.根據權利要求3或4所述的一種用于檢測溶血性鏈球菌的檢測方法，其特征在于 所述的溶血性鏈球菌為β-溶血性鏈球菌。
全文摘要
本發明涉及一種用于檢測溶血性鏈球菌的核酸適體、互補序列及檢測方法，本發明屬于臨床檢驗領域及食品檢測領域，本發明設計了連接有FAM熒光信號的與溶血性鏈球菌特異性結合的核酸適體，及與其互補的寡核苷酸序列，建立了用于檢測溶血性鏈球菌的以膠體金淬滅熒光為基礎的核酸適體生物傳感器檢測方法，本發明主要用于溶血性鏈球菌的快速檢測，具有特異性強、靈敏度高、檢測效率高、操作簡單且安全性高的優點。
文檔編號C12Q1/06GK102994633SQ20121040882
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月12日 優先權日2012年10月12日
發明者彭新凱, 李樂, 聶靜苑, 鐘菲菲, 劉子音, 黃亮, 楊麗霞, 夏立新 申請人:湖南省食品安全生產工程技術研究中心