專利名稱：一種巨大口蘑原生質體及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種巨大口蘑原生質體及其制備方法。
背景技術：
巨大口蘑CTricholoma giganteum)又稱大白口蘑，為擔子菌亞門層菌綱傘菌目口蘑科口蘑屬食用真菌，其子實體營養豐富、含有多種多糖。巨大口蘑是一種野生珍稀食用菌，有極高的經濟價值和營養價值。其子實體質地致密，在12°C貯藏30天，不變色，不變味， 不易腐爛，尤其不易褐變，即使是機械損傷后，很長時間也不會褐變。因為食用菌的原生質體全能性較易體現，所以原生質體誘變、融合育種技術是目前食用菌高產菌株及新菌株選育手段中最為高效經濟的方法之一。而原生質體的成功制備是原生質體誘變、融合育種技術的必要條件。目前國內沒有對巨大口蘑原生質體制備工藝及方法的研究，對其他食用菌原生質體制備大多使用溶壁酶，但單一的使用溶壁酶不僅價格昂貴而且效果不理想，原生質體的釋放量和再生率均處于較低的水平。因此，采用一種更廉價、并且能提高了原生質體的釋放量和再生率的方法制備巨大口蘑原生質體具有很大的意義。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種巨大口蘑原生質體的制備方法。該方法采用蝸牛酶和纖維素酶的混合酶液代替溶壁酶，可以大大降低巨大口蘑原生質體的制備費用，同時，所述制備方法得到的原生質體的釋放量和再生率均處于較高水平。本發明的另一目的在于提供由所述制備方法得到的巨大口蘑原生質體。本發明的上述目的通過如下技術方案予以實現一種巨大口蘑原生質體的制備方法，采用蝸牛酶與纖維素酶組成的混合酶液對巨大口蘑菌絲進行酶解，所述混合酶液中，纖維素酶的質量濃度為3. 5 4. 0%，蝸牛酶的質量濃度為0. 5 1. 0%，余量為滲透壓穩定劑。作為一種優選方案，所述巨大口蘑原生質體的制備方法具體包括如下步驟(1)將巨大口蘑菌絲與滲透壓穩定劑混合，于7000 10000r/min離心15 20min，將所得沉淀用滲透壓穩定劑洗滌，得到預處理后的菌絲；(2)將預處理后的菌絲按每300 500mg菌絲加入ImL的混合酶液中，置于四 32°C水浴恒溫培養3. 5 4. 5h，隔30 40min搖動一次，得到酶解液；(3)對酶解液進行過濾，濾液于3000 4000r/min離心15 20min，棄上清液，收集沉淀，即得到所述巨大口蘑原生質體。作為一種最優選方案，本發明中所述滲透壓穩定劑最優選為0. 5mol/L的甘露醇溶液。作為一種優選方案，所述混合酶液由如下方法制備得到以滲透壓穩定劑溶解纖維素酶和蝸牛酶，于7000 10000r/min離心15 20min后，用0. 222 μ m的微孔濾膜過濾上清液，所得濾液即為混合酶液。
作為一種優選方案，步驟(1)中，所述巨大口蘑菌絲為菌齡為7 IOd的巨大口蘑菌絲。作為一種優選方案，步驟(1)中，所述巨大口蘑菌絲由如下方法制備得到將巨大口蘑菌絲塊接到液體馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，于四 32°C、160 180r/min的搖床培養6 8d，然后過濾，取0. 4 0. 6g過濾后得到的菌絲轉移到160 ISOmL液體馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，于四 32°C靜置培養7 10d，過濾去上清液，得到所述巨大口蘑菌絲。作為一種最優選方案，步驟(3)中，所述過濾最優選為采用6層擦鏡紙進行過濾。為了使巨大口蘑原生質體的純度更高，可以在步驟C3)完成后，對得到的巨大口蘑原生質體進行精制，作為一種優選方案，所述精制包括如下步驟將巨大口蘑原生質體加入1 1. 5ml滲透壓穩定劑中，于3000 4000r/min離心 15 20min，去上清液，用滲透壓穩定劑洗滌下層懸浮液2 3次，再用滲透壓穩定劑重懸原生質體，得到巨大口蘑原生質體精制懸液。上述的重懸過程中，所用滲透壓穩定劑的用量優選為與步驟( 所述酶解液等體積。一種由所述制備方法得到的巨大口蘑原生質體。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明采用纖維素酶和蝸牛酶作為混合酶系，比單一的溶壁酶價格低一半以上， 大大降低了科研中巨大口蘑原生質體的制備費用，為利用原生質體技術進行巨大口蘑育種和基因工程奠定了基礎；同時，本發明的巨大口蘑原生質體的制備方法成本比傳統的制備方法降低一半以上，而且得到的原生質體釋放量達到9. 2X IO6個/mL，再生率達到1.17%，處于較高的水平。
具體實施例方式以下結合具體實施例對本發明作進一步說明，但具體實施例并不對本發明作任何限定。實施例1巨大口蘑(巨大口蘑，廣東省連南縣食用菌研究所陳秋來惠贈)，本實施例所用巨大口蘑菌絲的制備方法如下在巨大口蘑菌絲平板上用打孔器取3片最前端生長旺盛的菌絲塊，將其接到液體 PDA培養基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)中，于30°C、160r/min的搖床培養7d，然后將液體過濾，取0. 4g上述液體過濾后所得的菌絲轉移到裝有160mL液體PDA培養基的250mL三角瓶中，于30°C，靜置培養6d，即菌絲為6日菌齡，過濾去上清液，得到巨大口蘑菌絲。混合酶液的配制方法如下稱取纖維素酶和蝸牛酶加入無菌0. 5mol/L的甘露醇溶解，使纖維素酶和蝸牛酶的質量濃度分別為4%和(纖維素酶由上海伯奧生物科技有限公司提供；蝸牛酶由北京百泰生物科技有限公司提供)，于8000r/min離心ISmin除雜質后用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾上清液，得到濾液，即為混合酶液。
巨大口蘑原生質體的制備方法如下(1)菌絲的預處理 將以上制備的0. 4g巨大口蘑菌絲加入到50mL離心管中，加入0. 5mol/L甘露醇作為滲透壓穩定劑，于7000r/min離心15min，去上清液，所得沉淀用滲透壓穩定劑洗滌2次， 得到預處理后的菌絲；(2)酶解的過程如下每0. 4g預處理后的菌絲加入ImL上述混合酶液，置于31°C水浴恒溫培養4. 5h，隔 30min適當搖動一次，得到酶解液；(3)酶解后的處理如下酶解完畢后，用6層擦鏡紙過濾酶解液，除去殘留菌絲，濾液于3000r/min離心 20min，棄上清液，收集沉淀，即得到巨大口蘑原生質體。(4)精制將制得的巨大口蘑原生質體沉淀用0. 5mol/L的甘露醇作為滲透壓穩定劑，于 3000r/min離心15min并洗滌兩次，然后用與步驟(2)酶解液等體積的0. 5mol/L的甘露醇重懸原生質體，得到精制的巨大口蘑原生質體，重懸的目的是為了使巨大口蘑原生質體的純度更高。然后用血球計數板測定巨大口蘑原生質體釋放量，整個過程在無菌條件下進行， 血球計數板為25X16型，具體計算公式為
原生質生質體AmL= 80個小方格原生質小方格χ 400 X 10000 X稀釋倍數;
80測得本實施例方法制得的巨大口蘑原生質體釋放量為9. 9X IO6個/mL。巨大口蘑原生質的再生率測試方法如下將原生質體濃度調整到106個/mL，取0. ImL原生質體懸浮液涂布于PDA再生培養基上，計算其再生率，再生培養基為可溶性淀粉4.7g，蔗糖5g，酵母膏0. lg，KH2P04 0. Ig, MgS04 · 7H20 0. 5g 瓊脂 1· 5 2g，0. 5moL/L 甘露醇 IOOmL, pH = 7. 0。再生率計算值為 1. 17%。實施例2采用實施例1相同的巨大口蘑菌絲，區別在于，混合酶液的配制方法如下稱取纖維素酶和蝸牛酶加入無菌0. 5mol/L的甘露醇溶解，使纖維素酶和蝸牛酶的質量濃度分別為3. 5%和0. 5% (纖維素酶由上海伯奧生物科技有限公司提供；蝸牛酶由北京百泰生物科技有限公司提供)，于8000r/min離心ISmin除雜質后用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾上清液，得到濾液，即為混合酶液。巨大口蘑原生質體的制備方法及釋放量測定與實施例1相同，經測定后，本實施例方法制得的巨大口蘑原生質體釋放量為9. 6X IO6個/mL。巨大口蘑原生質的再生率測試方法如下將原生質體濃度調整到106個/mL，取0. ImL原生質體懸浮液涂布于PDA再生培養基上，計算其再生率，再生培養基為可溶性淀粉4.7g，蔗糖5g，酵母膏0. lg，KH2P04 0. Ig, MgS04 · 7H20 0. 5g 瓊脂 1· 5 2g，0. 5moL/L 甘露醇 IOOmL, pH = 7. 0。再生率計算值為1. 08%。 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種巨大口蘑原生質體的制備方法，其特征在于，采用蝸牛酶與纖維素酶組成的混合酶液對巨大口蘑菌絲進行酶解；所述混合酶液中，纖維素酶的質量濃度為3. 5 4. 0%， 蝸牛酶的質量濃度為0. 5 1. 0%，余量為滲透壓穩定劑。
2.如權利要求1所述巨大口蘑原生質體的制備方法，其特征在于，具體包括如下步驟(1)將巨大口蘑菌絲與滲透壓穩定劑混合，于7000 10000r/min離心15 20min，將所得沉淀用滲透壓穩定劑洗滌，得到預處理后的菌絲；(2)將預處理后的菌絲按每300 500mg菌絲加入ImL的混合酶液中，置于四 32°C 水浴恒溫培養3. 5 4. 5h，隔30 40min搖動一次，得到酶解液；(3)對酶解液進行過濾，濾液于3000 4000r/min離心15 20min，棄上清液，收集沉淀，即得到所述巨大口蘑原生質體。
3.如權利要求1或2所述巨大口蘑原生質體的制備方法，其特征在于，所述滲透壓穩定劑為0. 5mol/L的甘露醇溶液。
4.如權利要求1或2所述巨大口蘑原生質體的制備方法，其特征在于，所述混合酶液由如下方法制備得到以滲透壓穩定劑溶解纖維素酶和蝸牛酶，于7000 lOOOOr/min離心 15 20min后，用0. 222 μ m的微孔濾膜過濾上清液，所得濾液即為混合酶液。
5.如權利要求2所述巨大口蘑原生質體的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述巨大口蘑菌絲為菌齡為7 IOd的巨大口蘑菌絲。
6.如權利要求2所述巨大口蘑原生質體的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述巨大口蘑菌絲由如下方法制備得到將巨大口蘑菌絲塊接到液體馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，于四 32°C、160 180r/min的搖床培養6 8d，然后過濾，取0. 4 0. 6g過濾后得到的菌絲轉移到160 ISOmL液體馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，于四 321靜置培養7 IOd,過濾去上清液，得到所述巨大口蘑菌絲。
7.如權利要求2所述巨大口蘑原生質體的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述過濾為采用6層擦鏡紙進行過濾。
8.如權利要求2所述巨大口蘑原生質體的制備方法，其特征在于，步驟(3)完成后，還進行精制，所述精制包括如下步驟將巨大口蘑原生質體加入1 1. 5ml滲透壓穩定劑中，于3000 4000r/min離心15 20min,去上清液，用滲透壓穩定劑洗滌下層懸浮液2 3次，再用滲透壓穩定劑重懸原生質體，得到巨大口蘑原生質體精制懸液。
9.一種由權利要求1所述制備方法得到的巨大口蘑原生質體。
全文摘要
本發明公開一種巨大口蘑原生質體的制備方法。所述制備方法，包括如下步驟用滲透壓穩定劑對巨大口蘑菌絲進行預處理，然后采用蝸牛酶與纖維素酶組成的混合酶液對巨大口蘑菌絲進行酶解，所述混合酶液中，纖維素酶的質量濃度為3.5～4.0％，蝸牛酶的質量濃度為0.5～1.0％，余量為滲透壓穩定劑；最后對酶解液進行過濾，離心，所得沉淀即為巨大口蘑原生質體。本發明所用的混合酶液比單一的溶壁酶價格低一半以上，大大降低了科研中巨大口蘑原生質體的制備費用，為利用原生質體技術進行巨大口蘑育種和基因工程奠定了基礎；同時，本發明的巨大口蘑原生質體的制備方法成本比傳統的制備方法降低一半以上，而且得到的原生質體釋放量和再生率均處于較高水平。
文檔編號C12N5/04GK102559576SQ201210018448
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月18日 優先權日2012年1月18日
發明者倪炎, 梁大偉, 莫美華, 陳梅梅, 馬建偉, 馬紫英 申請人:華南農業大學