專利名稱：一種防治黃瓜霜霉病的枯草芽孢桿菌及其微生物菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域，具體涉及一種用于防治黃瓜霜霉病的枯草芽孢桿菌和含有該枯草芽孢桿菌的微生物菌劑，以及它們?cè)诜乐吸S瓜霜霉病上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃瓜霜霉病是由古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis Rostow)引起的侵染性氣傳病害，給黃瓜生產(chǎn)帶來(lái)巨大威脅。防治黃瓜霜霉病的方法主要有抗病育種、化學(xué)防治和生態(tài)防治(如高溫悶棚等)等。由于黃瓜霜霉病為多基因控制的數(shù)量性狀遺傳，抗病育種難以進(jìn)行且抗性容易喪失；化學(xué)防治存在容易產(chǎn)生抗藥性和對(duì)人、環(huán)境污染的問(wèn)題； 而生態(tài)防治的高溫悶棚需要黃瓜苗齡、長(zhǎng)勢(shì)和天氣情況都合適的條件下才能進(jìn)行，應(yīng)用受條件限制。近年來(lái)，生物防治方法由于具有對(duì)防治對(duì)象針對(duì)性強(qiáng)，防效高；以及對(duì)人、畜安全，沒(méi)有環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)而受到越來(lái)越多的重視。生物防治黃瓜霜霉病的方法主要包括利用植物提取物、植物的抗病性誘導(dǎo)和生防菌防治。目前，已報(bào)道的用于防治黃瓜霜霉病的植物提取物近10余種。但是植物提取物的提取過(guò)程繁瑣、生產(chǎn)成本高，人工合成單一物質(zhì)使用后病原菌容易產(chǎn)生抗藥性缺點(diǎn)，使該方法難以應(yīng)用。利用生防菌防治已報(bào)道有枯草芽孢桿菌ZH-8液體制劑(張淑梅等.生物技術(shù).2004 (4))和非致病性鐮刀菌F047和F047B10 (楊猛等.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).2005年05期)。芽孢桿菌(Bacillus)具有分布廣、易分離培養(yǎng)、能產(chǎn)生抗逆性較強(qiáng)的芽孢、貯藏期長(zhǎng)和使用方便等特點(diǎn)，是一種理想的生防微生物，相比其他類型的生防因子，更有利于菌劑的生產(chǎn)，劑型加工，在環(huán)境中存活、定殖與繁殖。因此，篩選對(duì)病原菌具有抑制作用的芽孢桿菌是防治有關(guān)植物病害的最有效方法之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種用于防治黃瓜霜霉病的枯草芽孢桿菌菌株，該菌株具有高效、廣譜殺菌活性等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明第二目的在于提供一種微生物菌劑。本發(fā)明第三目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。本發(fā)明第四目的在于提供上述枯草芽孢桿菌菌株在防治黃瓜霜霉病上的用途。本發(fā)明第五目的在于提供上述微生物菌劑在防治黃瓜霜霉病上的用途。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株HMB20428，已于2011年12月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5616。利用上述枯草芽孢桿菌HMB20428生產(chǎn)的微生物菌劑，其活性成分為枯草芽孢桿菌HMB204^菌體和它的胞外代謝產(chǎn)物。上述微生物菌劑可以為液體制劑。
上述微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟菌種活化，種子液制備和發(fā)酵培養(yǎng)。上述微生物菌劑的制備方法，具體包括如下步驟(1)菌種活化將低溫保存的HMB20^8菌株在LB平板培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)M 36小時(shí)，得活化的菌株；(2)種子液制備用無(wú)菌的接種環(huán)刮取一環(huán)步驟(1)活化的菌株接種到IOOmLLB 液體培養(yǎng)基中，在26 34°C、搖床轉(zhuǎn)速為170 210rpm的條件下培養(yǎng)22 25小時(shí)，得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)按照體積比為0. 5% 3. 0%的比例將步驟⑵的種子液接入到蔗糖豆餅粉培養(yǎng)基(pH值為5. 8 6. 2)中，在溫度為28 34°C，搖床轉(zhuǎn)速為170 210rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)36 Mh ；所述的蔗糖豆餅粉培養(yǎng)基，其組成成分及其重量百分比為蔗糖 2. 0 3. 0%，豆餅粉 1. 6 2. 4%, NaCl 0. 1 0. 2%, CaCO3O. 1 0. 3%, KH2PO4 0. 01 0. 03%和 MgSO4 · 7H20 0. 01 0. 03%，其余為水；(4)檢測(cè)發(fā)酵液中菌體和芽孢數(shù)量，待發(fā)酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌體總數(shù)的 90%時(shí)，停止發(fā)酵培養(yǎng)；所得即為HMB204^菌株的液體制劑。上述制備方法步驟( 和(3)中所述的溫度優(yōu)選為30 32°C ；所述的搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)選為210rpm ；所述的培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為48h。所述的LB平板培養(yǎng)基、LB斜面培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基均按照常規(guī)方法制備。所述的蔗糖豆餅培養(yǎng)基的制備方法，按照重量百分比將蔗糖、豆餅粉、NaCl、 CaCO3> KH2PO4和MgSO4 · 7H20混合，再加水至所需體積，攪拌均勻即可。上述微生物菌劑，其枯草芽孢桿菌HMB20428的活菌數(shù)大于5. 0 X 109cfu/mL。所述的枯草芽孢桿菌HMB20^8在防治黃瓜霜霉病上的應(yīng)用。上述微生物菌劑在防治黃瓜霜霉病上的應(yīng)用。本發(fā)明微生物菌劑的使用方法將上述所得微生物菌劑用水稀釋至活菌數(shù)為 107cfu/mL,于黃瓜霜霉病發(fā)病前進(jìn)行葉面噴霧，即可達(dá)到控制黃瓜霜霉病的目的。HMB20428菌株的篩選分離過(guò)程HMB20^8菌株是河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所從河北省邱縣的棉田土壤中分離得到的。2008年河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所從河北省邱縣棉田中五點(diǎn)采集土壤，混勻后稱取5g放到250mL的滅菌三角瓶中，加入IOOmL無(wú)菌水，放到搖床上，170r/min 振蕩30min，靜置2h，取上清液ImL加無(wú)菌水9mL，即成lOmLlO—2倍土壤微生物懸液，繼而將土壤懸液稀釋成10_3、10_4、10_5、10_6倍稀釋液，各濃度取200 μ L微生物懸液涂于LB和KB培養(yǎng)基平板上，每個(gè)濃度3次重復(fù)，在恒溫培養(yǎng)ld-3d，進(jìn)行細(xì)菌的分離和純化。并以黃瓜霜霉病為靶標(biāo)，利用葉盤法進(jìn)行生防菌的篩選。結(jié)果從中篩選出一個(gè)對(duì)靶標(biāo)病害具有明顯防治效果的菌株，定名為HMB20428。HMB20428菌株的分類鑒定(1)形態(tài)特征鑒定在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌體為桿狀，培養(yǎng)IOh后產(chǎn)生芽孢，芽孢中生，橢圓形，孢囊不膨大，抗酸染色陰性，無(wú)伴孢晶體，能運(yùn)動(dòng)，鞭毛周生。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)初期菌落淡乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面濕潤(rùn)；培養(yǎng)后期菌落淡黃色， 邊緣不整齊，表面干燥有褶皺；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上劃線培養(yǎng)，呈直線形；在液體培養(yǎng)基中靜
4止培養(yǎng)，表面形成白色菌膜。與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠等編著，科學(xué)出版社， 2001年)中描述的芽孢桿菌屬形態(tài)特征基本一致，初步判斷菌株HMB204^屬于芽孢桿菌 (Bacillus)。(2)利用16S rDNA序列鑒定分類以HMB20428的基因組DNA為模板，以F27和R1492為引物對(duì)16S rDNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所述的引物序列為F27 :5，AGAGTTTGATCATGGCTCAG3，； (SEQ ID No 2)R1492 :5，GGCTACCTTGTTACGACTT3，； (SEQ ID No 3)16S rDNA 的擴(kuò)增反應(yīng)體系為 50yL:10XPCR Buffer (Mg2+) 5 μ L ； dNTPMixture(2. 5mM) 5 μ L ；Taq(5U/y L) 1 μ L, F27(10 μ mol/L) 1 μ L, R1492(10 μ mol/ L) 1 μ L ；ΗΜΒ20428 的基因組 DNA 50ng ；ddH20 補(bǔ)足至 50 μ L。PCR 的反應(yīng)條件為 95°C 5min ； 95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 1. 5min，30個(gè)循環(huán)；72°C lOmin。將所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，送交上海生工生物工程有限公司測(cè)序，得到HMB20^8的16S rDNA序列(見(jiàn)SEQ ID No: 1)。將所得HMB20428的16S rDNA序列在Genbank中進(jìn)行同源性比較，結(jié)果菌株HMB20^8 與芽孢桿菌屬的16S rDNA同源性達(dá)到99% (見(jiàn)圖2)；構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見(jiàn)圖1)，HMB20^8 與枯草芽孢桿菌聚合到一起，說(shuō)明HMB204^屬于枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)，而且和現(xiàn)有的枯草芽孢桿菌菌株不同，是一個(gè)新菌株。(3)利用生理生化特征鑒定分類利用Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)可以測(cè)試菌株對(duì)95種碳源的利用情況從而進(jìn)一步確定其種屬特征，提高菌株鑒定的可靠性。方法是先將待測(cè)菌株的純培養(yǎng)菌落接入無(wú)菌水中，振蕩器震蕩制成細(xì)胞懸液，然后用多道移液槍接種于96孔GNIII鑒定板上培養(yǎng)，再用Biolog Microstation軟件讀取數(shù)據(jù)，確定碳源利用情況。通過(guò)與BIOLOG系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)MicroLog software (Release Version 4.20.04)比對(duì)，可知待測(cè)菌株的分類。將 HMB20428菌株送交中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，利用Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定分類，結(jié)果菌株HMB20428屬于枯草芽孢桿菌(B. subtil is)。綜合以上形態(tài)特征、16S rDNA序列同源性對(duì)比分析，以及生理生化特征鑒定的結(jié)果，可知HMB20^8屬于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，并且和現(xiàn)有的芽孢桿菌菌株不同，是一個(gè)新的枯草芽孢桿菌菌株。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1)本發(fā)明枯草芽孢桿菌菌株HMB204^對(duì)黃瓜霜霉病特異性強(qiáng)，而且防效高，平均防效在85%以上；( 利用本發(fā)明方法防治黃瓜霜霉病不易產(chǎn)生抗藥性；C3)本發(fā)明微生物菌劑對(duì)人、畜安全，沒(méi)有環(huán)境污染；(4)本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單、成本低、使用方便。


圖1為HMB20^8菌株根據(jù)16S rDNA序列獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。圖2為本發(fā)明HMB20428菌株與枯草芽孢桿菌168菌株(B. subtilis 168) 的16SrDNA基因序列同源性比較圖譜；其中枯草芽孢桿菌168菌株序列中“-”表示與 HMB20428對(duì)應(yīng)的堿基相同，“g、a、c、t”表示枯草芽孢桿菌168菌株序列中與HMB20^8對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的堿基為g、a、c、t。
具體實(shí)施例方式下面以具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步清楚地解釋本發(fā)明，但是不以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為重量百分含量。實(shí)施例1HMB20428微生物菌劑的制備，按照如下步驟進(jìn)行(1)菌種活化將保存于-40 °C的菌株HMB20^8 (枯草芽孢桿菌(Baci 1 Ius subtilis)菌株HMB20428已于2011年12月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5616)在LB平板培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比例為胰蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，氯化鈉lg，瓊脂粉15g，水IOOOmL)上在30°C下進(jìn)行活化，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比例為胰蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，氯化鈉lg，瓊脂粉15g，水IOOOmL)上30°C培養(yǎng)M 36小時(shí)，得活化的菌株；(2)種子液的制備按常規(guī)方法制作LB液體培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比例為胰蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，氯化鈉IgdK IOOOmL)，在250mL三角瓶中裝入LB培養(yǎng)液IOOmL,高壓濕熱滅菌，待溫度降到室溫后，每瓶中接入步驟(1)中一接種環(huán)上述活化好的菌株，在搖床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速190rpm，并在30°C下培養(yǎng)24h小時(shí)，得種子液；(3)蔗糖豆餅培養(yǎng)基的制備按照重量百分比將蔗糖3.0%，豆餅粉2 %， NaClO. 1 %, CaCO3 0. 3%, KH2PO4 0. 02%禾口 MgSO4 · 7H20 0. 03%加入水中，攪拌混合均勻，即得蔗糖豆餅培養(yǎng)基；分裝于500mL三角瓶中，每瓶200mL ；在121°C對(duì)蔗糖豆餅培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌30分鐘，再降溫到30°C備用；(4)發(fā)酵培養(yǎng)向步驟(3)所得每瓶蔗糖豆餅培養(yǎng)基200mL中接種步驟(2)所得種子液2mL ；在30°C、搖床轉(zhuǎn)速190rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)36h，以后每隔30分鐘從三角瓶中取樣進(jìn)行鏡檢，對(duì)視野中的芽孢和總菌體數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算芽孢率(芽孢率(％ )= 成熟芽孢數(shù)/(成熟芽孢數(shù)+菌體數(shù))X 100)；芽孢率達(dá)到90%時(shí)停止發(fā)酵培養(yǎng)；共發(fā)酵培養(yǎng)約45 50h，所得即為枯草芽孢桿菌HMB20428的液體制劑。實(shí)施例2枯草芽孢桿菌HMB20^8對(duì)黃瓜霜霉病防治效果的對(duì)比試驗(yàn)(一)試驗(yàn)藥劑:(1)微生物菌劑實(shí)施例1制備的HMB20^8液體制劑；用水稀釋50倍。(2)化學(xué)藥劑嘧菌酯懸浮劑O50克/升)(英國(guó)先正達(dá)有限公司)，用水稀釋 1000 倍。(3)空白對(duì)照清水(二)試驗(yàn)方法本試驗(yàn)在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。本試驗(yàn)所用的黃瓜霜霉病菌2010年來(lái)自河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)藥應(yīng)用技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，配制成孢子囊(IX IO5-L 5 X IO5個(gè)/mL)的懸浮液。取無(wú)病完整的黃瓜葉片，分別將其浸在(1)實(shí)施例1中制備的HMB204^液體制劑50倍稀釋液中；(2)化學(xué)藥劑對(duì)照嘧菌酯懸浮劑050克/升)1000倍水稀釋液中；(3)空白對(duì)照清水中；Ih后取出放入培養(yǎng)皿；在30°C光照培養(yǎng)箱中定殖一天，用打孔器打取直徑 15mm的葉盤，放置在培養(yǎng)皿中，每種處理重復(fù)4次，每皿10個(gè)葉盤作為一次重復(fù)；將制備好的黃瓜霜霉病菌孢子囊懸浮液在每個(gè)葉盤中部滴加IOul ；在18°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天， 調(diào)查病級(jí)并且計(jì)算防效。黃瓜霜霉病級(jí)別劃分標(biāo)準(zhǔn)和防效計(jì)算方法參照《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則》(一)殺菌劑防治黃瓜霜霉病GB/T 17980. 26-2000(以下同)。(三)結(jié)果(見(jiàn)表1)枯草芽孢桿菌HMB20^8液體制劑處理后黃瓜霜霉病病指(0.00)顯著低于空白對(duì)照病指(94. 17)和化學(xué)藥劑對(duì)照病指(78. 33)，防治效果達(dá)到 100. 00%，說(shuō)明本發(fā)明枯草芽孢桿菌HMB20^8及其微生物菌劑對(duì)黃瓜霜霉病具有很好的防治效果。表1枯草芽孢桿菌HMB20^8對(duì)黃瓜霜霉病防效的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株HMB20428，已于2011年12月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5616。
2.利用權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌HMB20^8生產(chǎn)的微生物菌劑，其特征在于其活性成分為枯草芽孢桿菌HMB204^菌體和它的胞外代謝產(chǎn)物。
3.按照權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于為液體制劑。
4.按照權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于HMB20428的活菌數(shù)大于 5. OX 109cfu/mL。
5.權(quán)利要求2所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)將低溫保存的HMB20^8菌株在LB平板培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)M 36小時(shí)，得活化的菌株；(2)用無(wú)菌的接種環(huán)刮取一環(huán)步驟(1)活化的菌株接種到IOOmLLB液體培養(yǎng)基中，在 26 34°C、搖床轉(zhuǎn)速為170 210rpm條件下培養(yǎng)22 25小時(shí)，得種子液；(3)按照體積比為0.5% 3. 0%的比例將步驟(2)的種子液接入到蔗糖豆餅粉培養(yǎng)基中，在溫度為28 34°C，搖床轉(zhuǎn)速為170 210rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)36 Mh ；所述的蔗糖豆餅粉培養(yǎng)基，其組成成分及其重量百分比為蔗糖2. 0 3. 0%，豆餅粉1. 6 2. 4%， NaCl 0. 1 0. 2 %，CaCO3 0. 1 0. 3 %，KH2PO4 0. 01 0. 03 % 和 MgSO4 · 7Η20 0. 01 0. 03%，其余為水；(4)檢測(cè)發(fā)酵液中菌體和芽孢數(shù)量，待發(fā)酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌體總數(shù)的90% 時(shí)，停止發(fā)酵培養(yǎng)。
6.按照權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟(3)中所述的溫度為30 32 °C。
7.按照權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟(3)中所述的搖床轉(zhuǎn)速為 2IOrpmο
8.按照權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟(3)中所述的培養(yǎng)時(shí)間為48h。
9.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌HMB20^8在防治黃瓜霜霉病上的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2所述的微生物菌劑在防治黃瓜霜霉病上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于防治黃瓜霜霉病的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株HMB20428，已于2011年12月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.5616。本發(fā)明還公開(kāi)了利用上述菌株生產(chǎn)的微生物菌劑及其制備方法。所述微生物菌劑的其活性成分為枯草芽孢桿菌HMB20428菌體和它的胞外代謝產(chǎn)物。本發(fā)明菌株HMB20428對(duì)黃瓜霜霉病特異性強(qiáng)，而且防效高，平均防效在85％以上；其次，利用本發(fā)明方法防治黃瓜霜霉病不易產(chǎn)生抗藥性；此外，本發(fā)明微生物菌劑對(duì)人、畜安全，沒(méi)有環(huán)境污染；還有本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單、成本低、使用方便。
文檔編號(hào)C12R1/125GK102533610SQ20121002810
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月9日
發(fā)明者李寶慶, 李社增, 郭慶港, 馬平, 鹿秀云 申請(qǐng)人:河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所