專利名稱：一種用于防治黃瓜霜霉病的枯草芽孢桿菌及其微生物菌劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于農業微生物領域，具體涉及一種用于防治黃瓜霜霉病的枯草芽孢桿菌和含有該枯草芽孢桿菌的微生物菌劑，以及它們在防治黃瓜霜霉病上的應用。
背景技術：
黃瓜霜霉病是由古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis Rostow)引起的侵染性氣傳病害，給黃瓜生產帶來巨大威脅。防治黃瓜霜霉病的方法主要有抗病育種、化學防治和生態防治(如高溫悶棚等)等。由于黃瓜霜霉病為多基因控制的數量性狀遺傳，抗病育種難以進行且抗性容易喪失；化學防治存在容易產生抗藥性和對人、環境污染的問題； 而生態防治的高溫悶棚需要黃瓜苗齡、長勢和天氣情況都合適的條件下才能進行，應用受條件限制。近年來，由于生物防治方法對人、畜安全，對環境沒有污染，且對防治對象的針對性強，效果好，因此，生物防治已成為防治黃瓜霜霉病的重要途徑。生物防治黃瓜霜霉病的方法主要包括利用植物提取物、植物的抗病性誘導和生防菌防治。已報道的用于防治黃瓜霜霉病的植物提取物近10余種，但是植物提取物的提取過程繁瑣、生產成本高，人工合成單一物質使用后病原菌容易產生抗藥性等缺點，使該方法難以應用。利用生防菌防治已報道有枯草芽孢桿菌ZH-8液體制劑(張淑梅等.生物技術.2004(4))和非致病性鐮刀菌F047和F047B10 (楊猛等.西北農林科技大學學報(自然科學版)；2005年05期)等。芽孢桿菌(Bacillus)具有分布廣、易分離培養、能產生抗逆性較強的芽孢、貯藏期長和使用方便等特點，是一種理想的生防微生物，相比其他類型的生防因子，更有利于菌劑的生產，劑型加工，在環境中存活、定殖與繁殖。因此，篩選對病原菌具有抑制作用的芽孢桿菌是防治有關植物病害的最有效方法之一。

發明內容
本發明目的在于提供一種用于防治黃瓜霜霉病的枯草芽孢桿菌菌株，該菌株具有高效、廣譜殺菌活性優點。本發明第二目的在于提供一種微生物菌劑。本發明第三目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。本發明第四目的在于提供上述枯草芽孢桿菌菌株在防治黃瓜霜霉病上的用途。本發明第五目的在于提供上述微生物菌劑在防治黃瓜霜霉病上的用途。本發明通過以下技術方案實現一種枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)菌株HMB19198,已于2011年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5613。利用上述枯草芽孢桿菌HMB19198生產的微生物菌劑，其活性成分為枯草芽孢桿菌HMB19198菌體和它的胞外代謝產物。上述微生物菌劑可以為液體制劑。
上述微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟菌種活化，種子液制備和發酵培養。上述微生物菌劑的制備方法，具體包括如下步驟(I)菌種活化將低溫保存的HMB19198菌株在LB平板培養基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養基上30°C培養24 36小時，得活化的菌株；(2)種子液制備用無菌的接種環刮取一環步驟(I)活化的菌株接種到IOOmLLB 液體培養基中，在26 34°C、搖床轉速為170 210rpm的條件下培養22 25小時，得種子液；(3)發酵培養按照體積比為O. 5% 3. O %的比例將步驟⑵的種子液接入到蔗糖豆餅粉培養基(PH值為5. 8 6. 2)中，在溫度為28 34°C、搖床轉速為170 210rpm 的條件下發酵培養36 54h，得發酵液；所述的蔗糖豆餅粉培養基，其組成成分及其重量百分比為:蔗糖 2. O 3. 0%，豆餅粉 I. 6 2. 4%，NaCl O. I O. 2%，CaCO3 O. I O. 3%， KH2PO4 O. 01 O. 03%和 MgSO4 · 7H20 O. 01 O. 03%，其余為水；(4)檢測發酵液中菌體和芽孢數量，待發酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌體總數的 90%時停止發酵培養；所得即為HMB19198菌株的液體制劑。上述制備方法步驟(2)或(3)中所述的溫度優選為30 32°C ;所述的搖床轉速優選為210rpm ;所述的培養時間優選為48h。所述的LB平板培養基、LB斜面培養基和LB液體培養基均按照常規方法制備。所述的蔗糖豆餅培養基的制備方法，按照重量百分比將蔗糖、豆餅粉、NaCl、 CaCO3> KH2PO4和MgSO4 · 7H20混合，再加水，攪拌均勻即可。上述微生物菌劑，其枯草芽孢桿菌HMB19198的活菌數大于7. 9 X 108cfu/mL。所述的枯草芽孢桿菌HMB19198在防治黃瓜霜霉病上的應用。上述微生物菌劑在防治黃瓜霜霉病上的應用。上述微生物菌劑的使用方法將上述所得微生物菌劑用水稀釋至活菌體數為 107cfu/mL,于黃瓜霜霉病發病前進行葉面噴霧，即可達到控制黃瓜霜霉病的目的。HMB19198菌株的篩選分離過程HMB19198菌株是河北省農林科學院植物保護研究所從江蘇省興化市的棉花根際土壤中分離得到。2009年河北省農林科學院植物保護研究所從江蘇省興化市棉田中五點采集棉株，取根際土壤，混勻后稱取5g放到250mL的滅菌三角瓶中，加入IOOmL無菌水,放到搖床上，170r/min振蕩30min，靜置2h，取上清液ImL加無菌水9mL，即成IOmL 10_2倍土壤微生物懸液，繼而將土壤懸液稀釋成10_3、10_4、10_5、10_6倍稀釋液，取各濃度微生物懸液 200 μ L涂于LB和KB培養基平板上，每個濃度重復3次，在28°C恒溫培養ld_3d，進行細菌的分離和純化。并以黃瓜霜霉病為靶標，利用葉盤法進行生防菌的篩選。結果從中篩選出一個對黃瓜霜霉病具有明顯防治效果的菌株，定名為HMB19198。HMB19198菌株的分類鑒定(I)形態特征鑒定在LB培養基上培養菌體為桿狀，培養IOh后產生芽孢，芽孢中生，橢圓形，孢囊不膨大，抗酸染色陰性，無伴孢晶體，能運動，鞭毛周生。在營養瓊脂平板上，培養初期菌落淡乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面濕潤；培養后期菌落淡黃色，邊緣不整齊，表面干燥有褶皺；在營養瓊脂斜面上劃線培養，呈直線形；在液體培養基中靜止培養，表面形成白色菌膜。這些形態特征與《常見細菌系統鑒定手冊》(東秀珠等編著.科學出版社.2001年)中描述的芽孢桿菌屬形態特征基本一致，初步判斷菌株HMB19198屬于芽孢桿菌。(2)利用16S rDNA序列鑒定分類以HMB19198的基因組DNA為模板，以F27和R1492為引物對16S rDNA進行PCR 擴增，所述的引物序列為F27 5，AGAGTTTGATCATGGCTCAG3，； (SEQ ID No 2)R1492 :5’ GGCTACCTTGTTACGACTT3’ ； (SEQ ID No 3)16S rDNA 的擴增反應體系為 50 μ L:10XPCR Buffer (Mg2+) 5 μ L ； dNTPMixture(2. 5mM) 5 μ L ；Taq(5U/y L) I μ L, F27(10 μ mol/L) I μ L, R1492 (10 μ mol/ L) I μ L ；ΗΜΒ19198 的基因組 DNA 50ng ；ddH20 補足至 50 μ L。PCR 的反應條件為 95°C 5min ； 95°C 30s, 55°C 30s, 72°C I. 5min，30個循環-,1 TC IOmin0將所得PCR擴增產物進行凝膠電泳，送交上海生工生物工程有限公司測序，得到HMB19198的16S rDNA序列(見SEQ ID No I)。將所得HMB19198的16S rDNA序列在Genbank中進行同源性比較，結果菌株HMB19198 與芽孢桿菌屬的16S rDNA同源性達到99% (見圖2);構建系統發育樹(見圖I)，HMB19198 與芽孢桿菌屬聚合到一起，說明HMB19198屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。(3)利用gyrB基因序列鑒定分類以HMB19198基因組DNA為模板，利用芽孢桿菌gyrB基因兼并引物gyrB_F和 gyrB-R為引物進行PCR擴增，得PCR擴增產物；其中所述的gyrB-F和gyrB-R引物的序列為gyrB-F :5，TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT3，； (SEQ ID No 5)gyrB-R :5，TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC3，； (SEQ ID No 6)gyrB 的 PCR 擴增反應體系為 50 μ L:10XPCR Buffer (Mg2+) 5 μ L ；dNTP Mixture(2. 5mM)5 μ L；Taq (5U/μ L)I μ L；gyrB-F(10 μmol/L)I μ L, gyrB-R (10 μmol/ L)lyL ;HMB19198 基因組 DNA 50ng ;ddH20 補足至 50 μ L。PCR 的反應條件為 95°C 5min ; 95°C 30s, 55°C 45s, 72°C lmin，30個循環；72°C IOmin0將擴增產物送交上海生工生物工程有限公司測序，得HMB19198菌株的gyrB基因序列(見SEQ IDNo 4)。將獲得的HMB19198 菌株的gyrB基因序列在Genbank中進行同源性比較，同時利用MEGA軟件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis,分子進化遺傳分析)構建系統發育樹。結果發現 HMB19198與枯草芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性最高(見圖4)，達到99% ;構建系統發育樹(見圖3)，HMB19198菌株與枯草芽孢桿菌聚合到一起，說明HMB19198為枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis),并且是一個新菌株。(4)利用生理生化特征鑒定分類利用Biolog微生物自動鑒定系統可以測試菌株對95種碳源的利用情況從而進一步確定其種屬特征，對菌株進行鑒定分類。先將待測菌株的純培養菌落接入無菌水中，振蕩器震蕩制成細胞懸液，然后用多道移液槍接種于96孔GNIII鑒定板上培養，再用Biolog Microstation軟件讀取數據，確定碳源利用情況。通過與BI0L0G系統數據庫MicroLog software (Release Version 4.20.04)比對，可知待測菌株的分類。將HMB19198菌株送交中國農業大學，利用Biolog微生物自動鑒定系統進行鑒定分類，結果表明菌株HMB19198屬于枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)。綜合以上形態特征、16S rDNA和gyr B基因序列同源性對比分析，以及生理生化特征鑒定的結果，可知HMB19198屬于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),并且和現有的芽孢桿菌菌株不同，是一個新的枯草芽孢桿菌菌株。本發明具有的優點和有益效果(I)本發明為防治黃瓜霜霉病提供了一個高效的微生物，開辟了一個有效防治途徑；(2)本發明枯草芽孢桿菌HMB19198對黃瓜霜霉病的藥效高，平均防效在85%以上，且針對性強；(3)本發明微生物菌劑對人、畜安全，沒有環境污染；(4)利用本發明方法防治黃瓜霜霉病不易產生抗藥性；(5)本發明制備方法簡單、成本低、使用簡單。


圖I.為HMB19198菌株根據16S rDNA序列獲得的系統發育樹圖。圖2.為本發明HMB19198菌株與枯草芽孢桿菌168菌株(B. subtilis 168) 的16SrDNA基因序列同源性比較圖譜；其中枯草芽孢桿菌168菌株序列中表示與 HMB19198對應的堿基相同，“g、a、C、t”表示枯草芽孢桿菌168菌株序列中與HMB19198對應位點的堿基為g、a、c、to圖3.為HMB19198菌株根據gyrB基因序列獲得的系統發育樹圖。圖4.為本發明HMB19198菌株與枯草芽抱桿菌168菌株(B. subtilis 168)的gyrB 基因序列同源性對比圖譜；其中枯草芽孢桿菌168序列中表示與HMB19198對應的堿基相同，而“g、a、c、t”表示枯草芽孢桿菌168序列中與HMB19198對應位點的堿基為g、a、C、
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具體實施例方式下面以具體實施例來進一步清楚地解釋本發明，但是不以任何方式構成對本發明的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法；下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為重量百分含量。實施例IHMB19198微生物菌劑的制備，按照如下步驟進行(I)菌種活化將保存于-40 °C的菌株HMB19198 (枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株HMB19198已于2011年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5613)在LB平板培養基(其組成成分及其重量比為胰蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g，氯化鈉lg，瓊脂粉15g，水IOOOmL)上進行活化(30°C )， 挑取單菌落在LB斜面培養基(其組成成分及其重量比為胰蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g， 氯化鈉lg，瓊脂粉15g，水IOOOmL)上在30°C下培養24 36小時，得活化的菌株；(2)種子液的制備按常規方法制作LB液體培養基(其組成成分及其重量比為 胰蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g，氯化鈉18，水IOOOmL)，在250mL三角瓶中裝入LB培養液 IOOmL,高壓濕熱滅菌，待溫度降到室溫后，每瓶中接入步驟(I)中一接種環上述活化好的菌株，在30°C、搖床轉速190rpm的條件下進行振蕩培養24h小時，得種子液；(3)蔗糖豆餅培養基的制備按照重量百分比將蔗糖3.0%，豆餅粉2%，NaClO. I %, CaCO3 O. 3%, KH2PO4 O. 02% 和 MgSO4 · 7H20 O. 03% 加入水中，攪拌混合均勻，即得蔗糖豆餅培養基；分裝于500mL三角瓶中，每瓶200mL ;在121°C對蔗糖豆餅培養基進行滅菌30分鐘，再降溫到30°C備用；(4)發酵培養向步驟(3)所得每瓶蔗糖豆餅培養基200mL中接種步驟(2)所得種子液2mL ;在30°C、搖床轉速190rpm條件下進行發酵培養36h，以后每隔30分鐘從三角瓶中取樣進行鏡檢，對視野中的芽孢和總菌體數進行計數，并計算芽孢率(芽孢率)= 成熟芽孢數/(成熟芽孢數+菌體數)X 100);芽孢率達到90%時停止發酵培養；共發酵培養約45 50h，得枯草芽孢桿菌HMB19198的液體制劑。實施例2枯草芽孢桿菌HMB19198對黃瓜霜霉病防治效果的對比試驗(一 )試驗藥劑(I)微生物菌劑實施例I制備的HMB19198液體制劑；用水稀釋50倍。(2)化學藥劑嘧菌酯懸浮劑(250克/升)(英國先正達有限公司)；用水稀釋 1000 倍。(3)空白對照清水( 二)試驗方法本試驗在河北省農林科學院植物保護研究所的實驗室內進行。本試驗所用的黃瓜霜霉病菌2010年來自河北省農林科學院植物保護研究所農藥應用技術實驗室，配制成孢子囊(I X IO5-L 5X IO5個/mL)的懸浮液，用于本試驗接種。取無病完整的黃瓜葉片，分別將其浸在(I)微生物菌劑實施例I中制備的 HMB19198液體制劑50倍稀釋液中，(2)化學藥劑嘧菌酯懸浮劑(250克/升)1000倍水稀釋液中，(3)空白對照清水中，Ih后取出放入培養皿；在30°〇光照培養箱中定殖一天，用打孔器打取直徑15mm的葉盤，放置在培養皿中，每皿10個葉盤作為一次重復，每處理重復4 次。在每個葉盤中部滴加黃瓜霜霉病菌孢子囊懸浮液IOul ;在181光照培養箱中培養7天， 調查病級并且計算防效。黃瓜霜霉病級別劃分標準和防效計算方法參照《中華人民共和國國家標準農藥田間藥效試驗準則》(一)殺菌劑防治黃瓜霜霉病GB/T 17980. 26-2000(以下同)。(三)結果(見表I)枯草芽孢桿菌HMB19198液體制劑處理后黃瓜霜霉病病指 (14.17)顯著低于空白對照病指(94.17)和化學藥劑對照病指(78. 33)，防治效果達到 85. 87%，說明本發明枯草芽孢桿菌HMB19198及其微生物菌劑對黃瓜霜霉病具有很好的防治效果。表I枯草芽孢桿菌HMB19198對黃瓜霜霉病防效的對比試驗結果
權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株HMB19198，已于2011年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5613。
2.利用權利要求I所述的枯草芽孢桿菌HMB19198生產的微生物菌劑，其特征在于其活性成分為枯草芽孢桿菌HMB19198菌體和它的胞外代謝產物。
3.按照權利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于為液體制劑。
4.按照權利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于其枯草芽孢桿菌HMB19198的活菌數大于 7. 9X108cfu/mL。
5.權利要求2所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)將低溫保存的HMB19198菌株在LB平板培養基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養基上30°C培養24 36小時，得活化的菌株；(2)用無菌的接種環刮取一環步驟(I)活化的菌株接種到IOOmLLB液體培養基中，在 26 34°C、搖床轉速為170 210rpm的條件下培養22 25小時，得種子液；(3)按照體積比為O.5% 3.0%的比例將步驟(2)的種子液接入到蔗糖豆餅粉培養基中，在溫度為28 34°C、搖床轉速為170 210rpm的條件下發酵培養36 54h，得發酵液；所述的蔗糖豆餅粉培養基，其組成成分及其重量百分比為蔗糖2. O 3. 0%，豆餅粉 I. 6 2. 4%,NaCl O. I O. 2%,CaCO3 O. I O. 3%,KH2PO4 O. 01 O. 03%和 MgSO4 ·7Η20O.01 O. 03%，其余為水；(4)檢測發酵液中菌體和芽孢的數量，待發酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌體總數的 90%時停止發酵培養；所得即為ΗΜΒ19198菌株的液體制劑。
6.按照權利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟(3)中所述的溫度為30 32。。。
7.按照權利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟(3)中所述的搖床轉速為 210rpmo
8.按照權利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟(3)中所述的培養時間為48h。
9.權利要求I所述的枯草芽孢桿菌HMB19198在防治黃瓜霜霉病上的應用。
10.權利要求2所述的微生物菌劑在防治黃瓜霜霉病上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種用于防治黃瓜霜霉病的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株HMB19198，已于2011年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.5613。本發明還公開了利用該菌株生產的微生物菌劑及其制備方法。本發明枯草芽孢桿菌HMB19198對黃瓜霜霉病特異性強，防效高，平均防效在85％以上；其次，利用本發明防治黃瓜霜霉病不易產生抗藥性；還有本發明微生物菌劑對人、畜安全，沒有環境污染問題；本發明制備方法簡單、成本低、使用簡單。
文檔編號C12N1/20GK102586142SQ201210028079
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月9日 優先權日2012年2月9日
發明者李寶慶, 李社增, 郭慶港, 馬平, 鹿秀云 申請人:河北省農林科學院植物保護研究所