專利名稱：一種應(yīng)用納米磁珠提取食用油脂中核酸的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用納米磁珠提取食用油脂類核酸的試劑盒。
技術(shù)背景
核酸的提取與純化技術(shù)是生物化學(xué)與分子生物學(xué)的一項(xiàng)基本技術(shù)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)，醫(yī)學(xué)，食品檢測及其相關(guān)領(lǐng)域，核酸的提取與純化技術(shù)也得到了進(jìn)一步的發(fā)展。
日前常采用的核酸提取技術(shù)大體上可以分為液-液提取和固相提取兩種方法。其中液-液提取法發(fā)展的較早，使用比較廣泛，主要原理是基于DNA在不同溶劑中溶解行為不同來達(dá)到分離純化DNA目的，其優(yōu)點(diǎn)在于提取DNA產(chǎn)率較高，成本低廉，主要缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，提取DNA純度不高，大量使用有毒溶劑，難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)操作。固相萃取法發(fā)展較晚，其主要原理是將DNA在一定條件下吸附到固體表面(通常為硅膠、離子交換、膜介質(zhì))，除去其它不吸附的雜質(zhì)后，再將DNA從固相表面洗脫下來。目前大多數(shù)核酸提取試劑盒都是基于固相萃取技術(shù)。固相提取法克服了以往液-液提取法的缺點(diǎn)，大大提高了提取效率，雖然提取產(chǎn)率稍遜于液-液提取法，但是純度較高，而且不含有液-液提取中常出現(xiàn)的酚和表面活性劑等雜質(zhì)，因而更適合后續(xù)分子生物學(xué)檢測，但是固相分離時(shí)往往需要通過離心或抽濾等手段來進(jìn)行試劑體系的交換與核酸的同收，不太適用于自動(dòng)化平臺。另外，固相介質(zhì)價(jià)格昂貴，會使檢測成本有所提高。
納米磁珠法提取核酸是近兒年才發(fā)展起來的核酸提取方法。其主要原理是在磁珠(主要為鐵氧體)表面通過共聚合和表面修飾等引入活性基團(tuán)，這些活性基團(tuán)有-C00H，-NH2, -OH, -C0H, -SH, -S03等，利用磁珠表面的這些活性基團(tuán)，以共價(jià)鍵的形式偶聯(lián)在磁珠的表面，制備成具有磁性的親和吸附劑，然斤與生物樣品共同孵育后，目標(biāo)分子能夠迅速被磁珠捕獲，可以在磁場作用下從液相中沉降下來，經(jīng)過簡單的洗滌，分離得到表面結(jié)合有目標(biāo)分子的磁珠復(fù)合物，通過改變洗滌條件可以將目標(biāo)分子從磁珠上洗脫下來。其提取過程中不需要苯酚和氯仿等毒性大的有機(jī)溶劑，提取的基因組DNA純度高、產(chǎn)量高，提取步驟簡單，不需要離心，不僅可以滿足從小亮到大量不同提取規(guī)模的要求，還能選擇手動(dòng)和自動(dòng)化操作，使分離技術(shù)取得了巨大的進(jìn)步。
到目前為止，保存較好的生物材料、加工或部分深加工生物材料基本均可利用一種或多種核酸提取技術(shù)提取到適量的核酸進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)操作，但對于某些特殊的實(shí)驗(yàn)材料(如食用油脂等)，目前常用的核酸提取方法卻難以提取到供后續(xù)檢測的核酸。多年來，國內(nèi)外諸多實(shí)驗(yàn)室均嘗試建立穩(wěn)定可靠的食用油脂中核酸的提取方法，專利號 200810029117. 7的專利公開了“一種提取食用油脂中核酸的方法”，利用傳統(tǒng)的CTAB法，配合自制的長片段核酸富集純化裝置，從食用油脂中提取到了適量的核酸供后續(xù)PCR檢測， 但該方法仍然使用了苯酚、氯仿等有機(jī)溶劑，對人身體有害，操作過程復(fù)雜，并且需要使用特殊的富集裝置，方法的可操作性不強(qiáng)，不利于推廣使用。
因此，市場上需要開發(fā)一些操作簡單、穩(wěn)定可靠、成本低、產(chǎn)量高的油脂類DNA提取試劑盒。 發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種食用油脂類DNA提取試劑盒，該試劑盒制備過程簡單可靠、成本低、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，適用于各類食用油脂樣品的DNA提取。包括裂解液、沉淀液、 共沉劑、結(jié)合液、磁珠緩沖液、洗滌緩沖液I、洗滌緩沖液II、洗脫緩沖液。
所述的裂解液含有10mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, 20mmol/L EDTA, 2 % 十二烷基磺酸鈉(SDS)，該裂解液的pH值為8. 0。
所述的沉淀液含有5g/L CTAB,40mmol/L NaCl。
所述的共沉劑為lg/ml的糖元。
所述的磁珠緩沖液中的磁珠由內(nèi)核層由磁性!^e3O4顆粒構(gòu)成，內(nèi)核層外包被了四乙氧基硅烷(TEOS)。
所述的洗滌緩沖液I 含有 10mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl，20mol/L EDTA，該洗滌緩沖液PH值為6.0。
所述的洗滌緩沖液II含有70%的無水乙醇。
所述的洗脫緩沖液含有l(wèi)Ommol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA,該緩沖液的PH值為 8. 0。
本發(fā)明提供一種磁珠制備方法。包括納米!^e3O4磁珠的制備；磁珠表面四乙氧基硅烷修飾。
本發(fā)明還提供了一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒提取油脂中核酸的方法，步驟如下油脂中極性成分的萃取；使用裂解液釋放核酸；磁珠特異性吸附核酸；洗滌去除雜質(zhì)；洗脫得到核酸溶液。
本發(fā)明修飾的!^e3O4磁珠可以把基因組DNA吸附在表面，蛋白質(zhì)、脂類等其它雜質(zhì)不被吸附。用洗滌液將其它雜質(zhì)沖洗掉，吸附在磁珠表面的基因組DNA可以直接作為PCR 的模板，也可以加入洗脫液，將吸附于磁珠表面的DNA洗脫并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)者提供了一種食用油脂中核酸的提取試劑盒。本試劑盒不需要使用苯酚和氯仿等毒性大的有機(jī)溶劑，安全性好，操作簡單，可以從多種食用油脂中提取得到適量DNA片段，滿足后續(xù)分子生物學(xué)檢測需求。本試劑盒可以儲存在4°C，也可以在室溫下放置，便于運(yùn)輸。


圖1為初榨大豆油、精煉大豆油內(nèi)源基因熒光定量PCR檢測圖譜； 擴(kuò)增曲線自左向右依次為陽性參比、初榨大豆油、精煉大豆油。
圖2為初榨玉米油、精煉玉米油內(nèi)源基因熒光定量PCR檢測圖譜； 擴(kuò)增曲線自左向右依次為陽性參比、初榨玉米油、精煉玉米油。
圖3為初榨花生油、精煉花生油內(nèi)源基因熒光定量PCR檢測圖譜； 擴(kuò)增曲線自左向右依次為陽性參比、初榨花生油、精煉花生油。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 試劑盒組成與配制
1、裂解液
IOmmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, 20mmol/L EDTA，2 % 十二烷基磺酸鈉 (SDS)，該裂解液的pH值為8.0。
2、沉淀液
5g/L CTAB,40mmol/L NaCl
3、共沉劑
lg/ml 的糖元
4、磁珠緩沖液
采用熱還原法制備內(nèi)核為磁性狗304顆粒，外包被了四乙氧基硅烷(TEOS) —單分散相超順磁性顆粒的水溶液。
1)納米!^e3O4顆粒的制備
量取20mL乙二醇，加入0. 5g PEG6000，加熱完全溶解；加入1. 8g乙酸鈉和1. 35g FeCl3 · 6H20，劇烈攪拌30min，充分混合均勻；將液體轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜中，200°C加熱他；冷卻至室溫后，將產(chǎn)物依次用無水乙醇和去離子水洗滌數(shù)次；60°C真空干燥，得到黑色磁性!^e3O4微球。
2)磁性!^e3O4微球表面包覆
稱取Ig磁性微球，用0. lmol/L HCl超聲處理Ih ；蒸餾水洗滌，加入無水乙醇 40mL,蒸餾水8mL，氨水0. 2mL,四乙氧基硅烷(TEOS) 0. 25mL,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，產(chǎn)物依次用無水乙醇和蒸餾水洗滌，60°C真空干燥，獲得表面硅膠包覆的磁性!^e3O4微球。
3)配制成200g/L，PH值7. 0的水懸濁液。
6、洗滌緩沖液I
IOmmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl，20mol/L EDTA,該洗滌緩沖液 PH 值為 6. 0。
7、洗滌緩沖液II
70%的無水乙醇。
8、洗脫緩沖液
IOmmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA,該緩沖液的 PH 值為 8. 0。
實(shí)施例2 使用試劑盒提取兒種大豆油/玉米油中核酸并進(jìn)行熒光定量PCR檢測
利用實(shí)施例1所述試劑盒提取兒種食用油(大豆油、玉米油和花生油)中核酸，并對內(nèi)源基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測。
本實(shí)例包括以下步驟
1、兒種食用油脂中核酸片段的提取
(1)將裂解液置于室溫下平衡30min或在55°C水浴中預(yù)熱5min ；
(2)量取待測油IOOml于250ml燒杯中，加入IOOml無菌水，放入超聲波清洗儀中， 超聲消解20min ；
(3)取出倒入4支50ml離心管中，12000rpm離心IOmin ；
(4)取下層水相40ml分于4支新的50ml離心管中，加入預(yù)熱的細(xì)胞裂解液10mL， 65°C溫育 30min ；
(5)加入IOyL DNA共沉劑，兩倍體積沉淀液，充分混勻，_20°C靜置Ih ；
(6) 12000rpm離心lOmin，棄上清，用500 μ L無菌水溶解沉淀；
(7)加入50 μ L磁性微球，加入0. 8倍體積異丙醇，室溫翻轉(zhuǎn)混勻5min，磁分離棄去清液；
(8)加入Iml洗滌緩沖液I，震蕩混勻2min，磁分離，去上清；
(9)加入Iml洗滌緩沖液II，震蕩混勻2min，磁分離，去上清；
(10)室溫下風(fēng)干或放入真空干燥儀中干燥；
(11)加入50ml洗脫緩沖液，震蕩混勻，磁分離，取上清備用。
2、兒種食用油內(nèi)源基因熒光定量PCR檢測
取上述提取到的油脂中DNA片段，用ABI公司的7900型熒光PCR儀對內(nèi)源基因進(jìn)行熒光PCR檢測，結(jié)果見圖1、2、3。
本實(shí)施例中采用的引物和探針
大豆油(Lectin)
5，-GCC CTC TAC TCC ACC CCC A-3，(上游引物)
5，-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TT-3，(下游引物)
Probe 5' -FAM-AGC TTC GCC GCT TCC TTC AAC TTC AC-TAMRA-3'
玉米油(zSSIIb)
5，-CTC CCAATC CTTTGACATCTG C-3，(上游引物)
5，-TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG-3，(下游引物)
Probe 5-FAM-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A-TAMRA-3'
花生油(AF431131)
5，-TCA GAA TCC CAT CCG GTT TC-3，(上游引物)
5，-GTG TTAACG GGC ATG GAG AT-3，(下游引物)
5' -FAM-CCT ACA TCT TGA ACC GCC ATG ACA A-TAMRA-3'
PCR擴(kuò)增體系(取2 μ IDNA溶液PCR擴(kuò)增模板)
ddH2017. 5μ 1
Taq PCR Buffer 2 μ 1
dNTP Mixture2 μ 1
Taq0. 5 μ 1
PrimerF1 μ 1
PrimerR1 μ 1
Probe1 μ 1
Total25 μ 1
熒光PCR擴(kuò)增條件
94°C 預(yù)變性 5min;
94°C 變性 5min，
60°C退火 30sec，
72°C延伸 40sec，40 個(gè)循環(huán)。
由圖1、2、3可以看出，兒種食用油的內(nèi)源基因都能被很好的擴(kuò)增，初榨油的CT值小于精煉油的CT值，說明初榨油中由于加工程度不深，DNA片段含量較高。擴(kuò)增曲線光滑， 重復(fù)性好，CT值均低于40，說明應(yīng)用本方法能夠提取出適量的DNA片段，滿足后續(xù)分子生物學(xué)的檢測。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用納米磁珠提取食用油脂類DNA的試劑盒及其應(yīng)用，其組分如下裂解液、沉淀液、共沉劑、結(jié)合液、磁珠緩沖液、洗滌緩沖液I、洗滌緩沖液II、洗脫緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的裂解液含有l(wèi)Ommol/L Tris-HCl, 150mmol/LNaCl,20mmol/L EDTA，2%十二烷基磺酸鈉(SDS)，該裂解液的 pH 值為 8. 0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的沉淀液含有5g/LCTAB，40mmol/ LNaCl。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的共沉劑為糖元。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的結(jié)合液為3mol/L的NaAC。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的磁珠緩沖液中的磁珠由內(nèi)核層由磁性!^e3O4顆粒構(gòu)成，內(nèi)核層外包被了四乙氧基硅烷(TEOS)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的洗滌緩沖液I含有l(wèi)Ommol/L Tris-HCl, 150mmol/LNaCl,20mol/L EDTA,該洗滌緩沖液 PH 值為 6. 0。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的洗滌緩沖液II含有70%的無水乙醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的洗脫緩沖液含有l(wèi)Ommol/L Tris-HCl, lmmol/LEDTA,該緩沖液的 PH 值為 8. 0。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒提取油脂中核酸的方法，步驟如下使用雙蒸水萃取油脂中極性成分；使用裂解液釋放核酸；磁珠特異性吸附核酸；洗滌去除雜質(zhì)；洗脫得到核酸溶液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種應(yīng)用納米磁珠提取食用油脂類核酸的試劑盒。試劑盒包括裂解液、沉淀液、共沉劑、磁珠緩沖液、洗滌緩沖液I、洗滌緩沖液II、洗脫緩沖液組成。油脂中DNA提取主要步驟包括油脂中極性成分的萃取、細(xì)胞裂解、核酸吸附、雜質(zhì)去除和核酸洗脫。應(yīng)用本試劑盒提取食用油脂DNA不需要使用苯酚和氯仿等毒性大的有機(jī)溶劑，安全性好、操作簡單快速，提取的DNA豐度較高。本試劑盒適用于從初榨或精煉大豆油、玉米油、花生油等食用油脂中提取DNA，以滿足后續(xù)PCR或其他分子生物學(xué)檢測。
文檔編號C12N15/10GK102533734SQ20121003769
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月20日
發(fā)明者劉鵬, 廖芳, 王金成, 羅家鳳, 趙衛(wèi)東, 鄭文杰, 郭京澤 申請人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心