專利名稱：一種黑曲霉及其應用及發酵制備檸檬酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種黑曲霉(Aspergillus niger)(該菌株于2011年10月14日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101)(保藏單位的縮寫為CGMCC)，保藏編號為CGMCC5342)及其應用，以及采用該黑曲霉作為發酵菌種發酵制備檸檬酸的方法。
背景技術：
檸檬酸是有機酸中的第一大酸，由于物理、化學等方面的優異性能，廣泛應用于醫藥、化學、電子、紡織、石油、皮革、建筑、攝影、塑料、鑄造和陶瓷等工業領域。
檸檬酸的生產方法主要有兩種一種是從天然含檸檬酸的果汁中提取；另一種是用發酵法進行生產，目前工業上主要以黑曲霉發酵法生產檸檬酸為主。具體的做法是將黑曲霉接種到發酵培養基中，發酵培養基中含有淀粉質原料酶解產物和氮源，經過發酵和固液分離得到檸檬酸的溶液。為了提高檸檬酸的生產能力，進行菌株改良，開發具有高產率的菌株是重點的研究方向。發明內容
本發明的目的是為了提高黑曲霉發酵法生產檸檬酸的生產能力，提供一種新的黑曲霉菌株及采用該黑曲霉作為發酵菌種發酵制備檸檬酸的方法。
為了實現上述目的，一方面，本發明提供了一種黑曲霉，其特征在于，所述黑曲霉的保藏編號為CGMCC5342。
另一方面，本發明提供了一種如上所述的黑曲霉在發酵制備檸檬酸中的應用。
第三方面，本發明提供了一種發酵制備檸檬酸的方法，其特征在于，所述方法包括在生成檸檬酸的條件下，將如上所述的黑曲霉接種至發酵培養基中進行發酵，得到發酵液。
本發明提供的黑曲霉，保藏編號為CGMCC5342，采用該黑曲霉作為發酵菌種發酵制備檸檬酸，可縮短發酵周期、提高終點檸檬酸含量、單罐供酸量。具體的，實施例I采用本發明提供的黑曲霉發酵制備檸檬酸，發酵周期為52h，終點檸檬酸含量為14. 5g/100mL,單罐供酸量為34. 1kg，轉化率為95. 0% ;而在其他條件相同的情況下，對比例I采用黑曲霉 Co827發酵制備檸檬酸，發酵周期為75h，終點檸檬酸含量為13. 9g/100mL,單罐供酸量為 33. 36kg，轉化率為 94. 8%0
本發明的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式
部分予以詳細說明。
生物保藏
本發明的菌株被命名為黑曲霉(Aspergillus niger),并于2011年10月14日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I 號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101)(保藏單位的縮寫為CGMCC)，保藏編號為 CGMCC5342。
具體實施方式
以下對本發明的具體實施方式
進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式
僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
一方面，本發明提供了一種黑曲霉，黑曲霉的保藏編號為CGMCC5342。
將該黑曲霉菌株分別接種在麥芽汁平板和察氏瓊脂培養基上進行培養，并定期在顯微鏡下觀察，發現
在麥芽汁瓊脂培養基(麥芽汁為2° B6，瓊脂為2g/100mL)上35°C、60%濕度下培養4d，菌落直徑可達40-50mm，7d可達45_60mm，菌落平坦，邊緣整齊，呈白色絨狀，中間孢子黑色密集，反面無色或微黃，無分泌物，稍有霉味，分生孢子梗短，分生孢子頭大圓形黑色， 老熟時開花狀。
在察氏瓊脂培養基上生長緩慢，分生孢子梗較長，分生孢子著生稀疏。
本發明中的黑曲霉菌株是通過將黑曲霉Co827作為出發菌株，在玉米原料配制的酸性平板培養基上經自然選育得到的。
酸性平板培養基玉米液化液10g/100mL、檸檬酸20g/100mL、瓊脂3g/100mL。
用黑曲霉Co827發酵生產檸檬酸，在初始糖一定的情況下，取產酸高的發酵罐批的發酵醪液，在無菌室內用無菌吸管吸取ImL發酵醪液后用劃線分離法使菌體附著于上述酸性平板培養基上。在36°C、65%濕度的培養箱內培養至培養基上長出白色的、表面有分生孢子梗的黑曲霉菌落，然后挑取單菌落至麥芽汁瓊脂培養基(麥芽汁為2° B6，瓊脂為 2g/100mL)斜面上在36°C、60%濕度的培養箱內培養5天左右，待單菌落孢子豐滿后及時收至4°C冰箱中保藏。
將分離獲得的多個菌株進行搖瓶篩選，搖瓶培養基配方為玉米液化液15重量％，玉米液化清液85重量％。搖床培養條件為轉速350rpm，培養溫度36± I °C，時間 70-85h。
通過搖瓶篩選出產酸高的菌株再次在上述酸性平板培養基上進行分離，通過搖瓶進行篩選，直至獲得一株產酸高、發酵周期62小時以下且性能穩定的菌株，即本發明的黑曲霉，保藏編號為CGMCC5342。
發酵周期是指從接種開始至發酵液中還原糖含量達到0. 3g/100mL以下的這段培養時間。
根據GB/T 5513-2008檢測還原糖含量。
另一方面，本發明提供了如上所述的黑曲霉在發酵制備檸檬酸中的應用。
第三方面，本發明提供了一種發酵制備檸檬酸的方法，所述方法包括在生成檸檬酸的條件下，將如上所述的黑曲霉接種至發酵培養基中進行發酵，得到發酵液。
由于本發明提供的制備朽1檬酸的方法相對于現有技術的改進主要在于使用本發明的黑曲霉作為發酵菌種，本發明的黑曲霉的發酵周期為52-62小時，因此本發明方法的發酵時間優選為52-62小時，對于其他條件和操作沒有特別的要求，例如，發酵條件可以為本領域常規的發酵條件，例如，發酵的條件可以包括溫度為30-40°C，優選為35-37°C ;起始PH值為4-5 ;通氣量為0. 1-1體積(體積 分鐘)，優選為0. 3-0. 8體積(體積 分鐘)。
發酵過程就其本質來說是由微生物參與的生物化學反應過程，因此微生物細胞的4數量、狀態、代謝情況對產物的生物合成有著重要的影響。菌體濃度的大小對發酵產物的產率有著重要的影響。理論上菌體濃度越大，產物的產量也越大，但是菌體濃度過高會產生其他影響，如營養物質消耗過快，發酵液中的營養成分發生明顯的改變，如有毒物質的積累等，這些可能改變菌體的代謝途徑。因此，本發明中，以每升發酵培養基為基準，黑曲霉的接種量優選為I. 8 X 107-3. 8 X IO7個孢子，進一步優選為2. 2X 107-3. 6X 107個孢子。
孢子的數量可以通過本領域公知的方法測定，例如，通過血球計數板計數。
本發明中，發酵培養基為本領域技術人員公知的概念，指微生物發酵所需的供微生物生長和維持用的人工配制的養料，一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽(包括微量元素)以及維生素和水等。發酵液也為本領域技術人員公知的概念，指接入微生物菌株的液體培養基(該液體培養基也即本發明中所稱發酵培養基)，經過一段時間的培養后所得產物。
根據本發明，對發酵培養基的成分沒有特別的要求，只要可以用于檸檬酸發酵的發酵培養基即可。優選地，發酵培養基含有由淀粉質原料酶解得到的酶解產物，且優選由淀粉質原料酶解得到的酶解產物的量占發酵培養基總量的80-100重量％。一般地，淀粉質原料酶解得到的產物稱為液化液，液化液經固液分離得到酶解殘渣和液化清液，通常可以將液化清液用于制備發酵培養基，也可以將液化清液與液化液混合后用于制備發酵培養基。 因此，本發明中，所述由淀粉質原料酶解得到的酶解產物包括上述經固液分離得到的液化清液，也包括未經固液分離的液化液，還包括上述二者的混合物。發酵培養基優選由液化液和液化清液與水混合或不與水混合得到，且進一步優選以發酵培養基的總重量為100重量份為基準，液化清液的用量為80-85重量份，液化液的用量為15-20重量份。
根據本發明，液化清液可以通過多種方法制備得到，例如，可以通過如下方法制備得到將淀粉質原料粉碎，將粉碎后的產物進行酶解，酶解得到的產物再經固液分離，得到液化清液和酶解殘渣，固液分離的條件使酶解殘渣的固含量為45-55重量％，優選為49-51 重量％。
根據本發明，淀粉質原料可以為本領域公知的各種可以用于酶解、發酵制備檸檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以選自玉米、薯類(如木薯)和小麥中的一種或幾種，優選情況下，所述淀粉質原料為玉米。
所述酶解步驟可以通過本領域常用的方法完成，比如向粉碎產物中添加產酶微生物和/或酶，在產酶微生物的生長溫度和/或酶有活力的溫度下保溫完成。所述產酶微生物為能夠分泌淀粉酶的產酶微生物。所述酶包括淀粉酶。
由于微生物生長會產生副產物，因此優選直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考慮，優選以每克粉碎后的粉碎產物的干重計，淀粉酶的用量為15-50個酶活力單位。
本發明中，酶活力單位的定義為在pH值為6. O、溫度為70°C的條件下，I分鐘將I 毫克淀粉轉化為還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。
酶解的溫度可以在很大范圍內改變，優選為70_105°C，更優選為90_95°C。酶解的時間理論上越長越好，考慮到設備利用率，優選酶解的時間為90-150分鐘，更優選為 100-120分鐘。酶解的pH值可以在很大范圍內改變，優選為5. 0-7. 0，更優選為5. 4-6. 2，進一步優選為5. 8-6. O。
淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，淀粉酶一般包括a -淀粉酶、 ^ -淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。
根據本發明，優選使用a -淀粉酶和/或異淀粉酶。
根據本發明，固液分離的方法與裝置為本領域技術人員所公知，例如，壓濾機或離心機。
黑曲霉可以采用常規的方法接種，例如，在被接種至發酵培養基中之前，將黑曲霉經過種子培養，之后將得到的種子液加入到發酵培養基中。黑曲霉種子培養的程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定來確定，當pH < 2. O、酸度> lg/100mL、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時停止培養。
優選情況下，種子培養的方法包括將黑曲霉接種在黑曲霉培養液中進行培養， 黑曲霉培養液中含有10-17重量％的玉米粉，以每升培養液為基準，黑曲霉的接種量為2.75X 108-3X 108 個孢子。
將經過種子培養得到的種子液加入到發酵培養基中進行發酵，通常用接入發酵培養基的種子液的體積占接入種子液后發酵培養基的體積的百分比來表示黑曲霉的接種量， 當接入發酵培養基的種子液的體積占接入種子液后發酵培養基的體積的8-12%時，能夠滿足以每升發酵培養基為基準，黑曲霉的接種量在2. 2 X 107-3. 6 X IO7個孢子范圍內。因此， 接入發酵培養基的黑曲霉的優選的接種量可以表示為接種量為8-12%。
根據本發明，黑曲霉種子罐的培養液的制備方法沒有特別的限制，只要得到的培養液能夠適用于黑曲霉菌種的生長即可。
根據本發明，黑曲霉的種子罐的培養條件可以在很大范圍內改變，例如培養的條件可以包括培養的溫度為30-38°C，優選為35-37°C;起始pH值為5_6 ;通氣量為0. 1-1體積(體積 分鐘)，優選為0. 3-0. 8體積(體積 分鐘)。
術語“通氣量”一般以通氣比來表示，通常以每分鐘內通過單位體積培養液的空氣體積比來表示(V/V min)，例如通氣比為I : 0. 1-1，簡稱通氣量為0. 1-1體積(體積 分鐘)。
發酵的設備為本領域技術人員所公知，例如，可以使用發酵罐。
按照本發明的方法制備得到的發酵產物檸檬酸可以用常規的方法，根據不同工業產品的要求分離并精制，比如中和、酸解、脫色、濃縮、結晶、包裝。
以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明并不限于上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思范圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。
另外需要說明的是，在上述具體實施方式
中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。
此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。
實施例
以下的實施例將對本發明作進一步的說明，但并不因此限制本發明。
在以下實施例中
根據GB 1987-2007標準檢測所得檸檬酸溶液的濃度(即終點檸檬酸含量)。
單罐供酸量=檸檬酸溶液的濃度X檸檬酸溶液的體積。
轉化率)=單罐供酸量/總糖的重量X100%，其中總糖的重量包括種子罐用糖重量和發酵罐用糖重量。
以下實施例使用的黑曲霉菌株A均為本發明的上述黑曲霉菌株(該菌株于2011 年10月14日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101)(保藏單位的縮寫為CGMCC)，保藏編號為CGMCC5342)。
實施例I
本實施例用于說明本發明提供的發酵制備檸檬酸的方法。
(I)將收獲的56千克玉米進行粉碎，得到平均粒子直徑為400微米的粉碎后產物。
(2)將粉碎后產物按24重量％的濃度調漿，相對于每克粉碎后產物，加入20個酶活力單位的淀粉酶(諾維信公司，a-淀粉酶，本發明實施例中均為此淀粉酶)，進入噴射器，在93°C、pH為5. 9的條件下酶解100分鐘得到產物。
(3)將一部分酶解得到的產物通過用液壓式板框壓濾機進行壓濾，分離出液化清液和酶解殘渣，其中，酶解殘渣的固含量為51重量％。
(4)配制發酵培養基，將180. 5千克的上述液化清液、35. 5千克的酶解得到的產物滅菌后加入到300L的發酵罐中，得到發酵培養基。
(5)將步驟(2)中的剩余部分的酶解得到的產物，加水稀釋至總糖為10重量％， 得到培養液，將培養液投入種子罐，加熱到121°c消毒，維持30分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌株A，每升培養液中黑曲霉的接種量為2. 75 X IO8個孢子。在35°C、起始pH值為5、0. 3體積(體積 分鐘)的通氣條件下進行菌種培養；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和pH測定對黑曲霉的生長進行觀察，當pH < 2.0、酸度> lg/100mL、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養。
(6)將步驟(5)培養的黑曲霉菌種加入到步驟(4)的發酵罐中開始發酵，接種量為 8 %，發酵條件包括溫度為35°C，起始pH值為5，通氣量為0. 3體積(體積 分鐘)，發酵至發酵液中還原糖含量達到0. 3g/100mL以下停止發酵，發酵時間為52小時，然后進行固液分離得到檸檬酸溶液。測定檸檬酸溶液的濃度，計算單罐供酸量和轉化率見表I。
實施例2
本實施例用于說明本發明提供的發酵制備檸檬酸的方法。
(I)將收獲的56千克進行粉碎，得到平均粒子直徑為380微米的粉碎后產物。
(2)將粉碎后的產物按27重量％的濃度調漿，相對于每克粉碎后的產物，加入50 個酶活力單位的淀粉酶，進入噴射器，在95°C、pH為5. 8的條件下酶解110分鐘得到產物。
(3)將一部分酶解得到的產物通過用液壓式板框壓濾機進行壓濾，分離出液化清液和酶解殘渣，其中，酶解殘渣的固含量為50重量％。
(4)配制發酵培養基，將177. I千克的上述液化清液、38. 9千克的酶解得到的產物滅菌后加入到300L的發酵罐中，得到發酵培養基。
(5)將步驟(2)中的剩余部分的酶解得到的產物，加水稀釋至總糖為10重量％， 得到培養液，將培養液投入種子罐，加熱到121°C消毒，維持30分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌株A，每升培養液中黑曲霉的接種量為2. 8 X IO8個孢子。在36°C、起始pH值為5.5,0. 6體積(體積 分鐘)的通氣條件下進行菌種培養；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和pH測定對黑曲霉的生長進行觀察，當pH < 2.0、酸度> lg/100mL、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養。
(6)將步驟(5)培養的黑曲霉菌種加入到步驟(4)的發酵罐中開始發酵，接種量為 10%,發酵條件包括溫度為36°C，起始pH值為4. 5，通氣量為0. 8體積(體積 分鐘)，發酵至發酵液中還原糖含量達到0. 3g/100mL以下停止發酵，發酵時間為62小時，然后進行固液分離得到檸檬酸溶液。測定檸檬酸溶液的濃度，計算單罐供酸量和轉化率見表I。
實施例3
本實施例用于說明本發明提供的發酵制備檸檬酸的方法。
(I)將收獲的56千克玉米進行粉碎，得到平均粒子直徑為370微米的粉碎后產物。
(2)將粉碎后的產物按26重量％的濃度調漿，相對于每克粉碎后的產物，加入15 個酶活力單位的淀粉酶，進入噴射器，在90°C、pH為6. 0的條件下酶解120分鐘，得到酶解產物。
(3)將一部分酶解產物通過用液壓式板框壓濾機進行壓濾，分離出酶解液化清液和酶解殘渣，其中，酶解殘渣的固含量為49重量％。
(4)配制發酵培養基，將169千克的上述酶解液化清液和42. 2千克的酶解得到的產物滅菌后加入到300L的發酵罐中，得到發酵培養基。
(5)將步驟(2)中的剩余部分的酶解得到的產物，加水稀釋至總糖為10重量％， 得到培養液，將培養液投入種子罐，加熱到121°c消毒，維持30分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌株A，每升培養液中黑曲霉的接種量為3 X IO8個孢子。在37°C、起始pH值為6、0.8體積(體積 分鐘)的通氣條件下進行菌種培養；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和 pH測定對黑曲霉的生長進行觀察，當pH < 2. O、酸度> lg/100mL、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養。
(6)將步驟(5)培養的黑曲霉菌種加入到步驟(4)的發酵罐中開始發酵，接種量為 12%,發酵條件包括溫度為37°C，起始pH值為4，通氣量為0. 6體積(體積 分鐘)，發酵至發酵液中還原糖含量達到0. 3g/100mL以下停止發酵，發酵時間為56小時，然后進行固液分離得到檸檬酸溶液。測定檸檬酸溶液的濃度，計算單罐供酸量和轉化率見表I。
對比例I
按照實施例I的方法發酵制備檸檬酸，不同的是，接入的黑曲霉菌株為現有技術常用的黑曲霉Co827，發酵至發酵液中還原糖含量達到0. 3g/100mL以下停止發酵，發酵時間為75小時，然后進行固液分離得到檸檬酸溶液。測定所得檸檬酸溶液的濃度，計算單罐供酸量和轉化率見表I。
表I
權利要求
1.一種黑曲霉(Aspergillus niger),其特征在于，所述黑曲霉的保藏編號為 CGMCC5342。
2.一種如權利要求I所述的黑曲霉在發酵制備檸檬酸中的應用。
3.一種發酵制備檸檬酸的方法，其特征在于，所述方法包括在生成檸檬酸的條件下，將如權利要求I所述的黑曲霉接種至發酵培養基中進行發酵，得到發酵液。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，以每升發酵培養基為基準，黑曲霉的接種量為1.8X 107-3. 8X 107 個孢子。
5.根據權利要求4所述的方法，其中，以每升發酵培養基為基準，黑曲霉的接種量為2.2X 107-3. 6X 107 個孢子。
6.根據權利要求3-5中任意一項所述的方法，其中，所述發酵的條件包括溫度為 30-400C，起始pH值為4-5，通氣量為0. 1-1體積(體積 分鐘)，發酵的時間為52-62小時。
7.根據權利要求3-6中任意一項所述的方法，其中，所述發酵培養基含有由淀粉質原料酶解得到的酶解產物。
全文摘要
本發明提供了一種黑曲霉(Aspergillus niger)，其特征在于，所述黑曲霉的保藏編號為CGMCC 5342。另一方面，本發明提供了一種上述黑曲霉在發酵制備檸檬酸中的應用。第三方面，本發明提供了一種發酵制備檸檬酸的方法，其特征在于，所述方法包括在生成檸檬酸的條件下，將上述黑曲霉接種至發酵培養基中進行發酵，得到發酵液。本發明提供的黑曲霉作為發酵菌種發酵制備檸檬酸，可縮短發酵周期、提高終點檸檬酸含量、單罐供酸量。
文檔編號C12R1/685GK102533570SQ20121005082
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月29日 優先權日2012年2月29日
發明者盧宗梅, 吳曉艷, 徐麗紅, 鐘華, 陳修 申請人:中糧生物化學(安徽)股份有限公司