專利名稱：一種堆肥發酵液提高黑麥草抗Cr和Cd能力的方法
技術領域：
本發明屬于環境保護技術領域，涉及以城市生活垃圾堆肥中提取出的有益菌種的應用。更具體的說是一種采用蘇云金芽孢桿菌發酵液提高黑麥草對Cr和Cd抗性能力的方法。
背景技術：
堆肥化(Composting)是指在有控制的條件下，使有機廢棄物在微生物(主要為細菌)作用下，發生降解，并同時使有機物向穩定的腐殖質方向轉化的過程。堆肥化后的產物稱之為堆肥(Compost)。堆肥過程可以將混合物的體積有效地減少40%-50%，并且可以依靠在高溫階段中代謝產生的熱量殺死垃圾中的病原物質。堆肥不是一項新的技術，但用這種方法處理城市固體垃圾，符合環境的利益，因為在堆肥過程中清除或者減少了城市固體垃圾中的毒性并使得最終的產物可以被用來進行再利用。堆肥的程序包括原料的預處理、原料發酵和后處理，堆肥過程受水分、氧含量、C/N比、溫度、pH和通風情況等因素的影響。堆肥化過程的實質是微生物在適宜條件下的代謝作用，在堆肥化過程中，生活垃圾中的可溶解有機物質透過微生物的細胞壁和細胞膜而被微生物所吸收，而微生物通過自身的生命活動過程，把吸收的有機物轉化成無機物。微生物在堆肥過程中扮演著重要角色， 與堆肥周期和堆肥質量密切相關。因此，堆肥中微生物的研究對開發堆肥微生物資源，加速堆肥過程，減短堆肥周期，提高堆肥質量都具有重要的意義。微生物種類繁多，自然界中僅有極少數的微生物得到鑒定，能夠存活、培養的種類更是少之又少，至多為微生物總量的1%。目前，國內外對于堆肥中的微生物進行了一系列理論和實踐的研究。對于應用堆肥可能出現的環境問題也已經引起了人們的重視，但如何解決這些問題還缺少細致深入的研究，目前，如何提高城市生活垃圾堆肥的質量，解決堆肥應用過程中可能產生的環境問題一直是相關科研人員研究關注的熱點。對于堆肥中的微生物組成及堆肥過程中的微生物變化的研究已有諸多報道，但對于將堆肥中微生物分離、應用于其他基質的研究卻少有報道。將生活垃圾堆肥用作草坪基質，不但可以避開食物鏈，同時又解決了垃圾的出路問題。但垃圾堆肥中含有重金屬等物質可能對環境造成不利的影響，這一直是堆肥應用中的重要問題，從垃圾堆肥中分離和提取有益的微生物菌種，配制成不同的微生物菌劑接種到草坪建植體系中，既可以提高堆肥的利用效率，同時又解決了堆肥重金屬等可能構成的環境威脅，體現生物制劑的優越性，符合可持續發展的要求，通過研究堆肥微生物菌劑提高黑麥草對Cr和Cd抗性能力的方法，目的是為了篩選適合的微生物菌劑，提高草坪植物的質量和抗逆性提供理論依據。蘇云金芽孢桿菌是目前國際上生產量最大并成功地用于防治農、林、貯糧害蟲和一些衛生害蟲的微生物殺蟲劑，蘇云金芽孢桿菌在形成芽孢的同時，可以形成一種由殺蟲晶體蛋白組成的伴孢晶體，它的主要殺蟲活性成分是伴孢晶體蛋白。研究發現，這種蛋白對多種農林害蟲具有特異性殺傷作用。昆蟲取食芽孢晶體混合物后，晶體在昆蟲體內的中腸堿性環境和蛋白酶的作用下被降解形成殺蟲活性蛋白，研究結果表明這些毒蛋白單獨作用或不同蛋白間協同作用對昆蟲具有不同程度的毒殺作用，進一步加強蘇云金芽孢桿菌在防治和控制害蟲危害方面的研究，對于保護人類生存環境實現可持續發展具有重大意義。蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)是目前產量最大、使用最廣的生物殺蟲劑。 關于采用蘇云金芽孢桿菌發酵濾液用來提高黑麥草抗重金屬能力的方法尚為見文獻報道。土壤重金屬污染問題一直是影響農產品質量安全，危害人體健康的嚴重環境問題，利用微生物的生物活性對重金屬的親和吸附或將其轉化為低毒產物，從而降低重金屬污染程度，是生物修復重金屬污染的重要途徑。微生物在生長過程中能夠分泌有機酸等代謝產物，具有溶解重金屬和含重金屬的礦物的能力。本研究將外源重金屬溶液加入到含有不同堆肥微生物菌劑的草坪土壤基質中，探討不同堆肥微生物對緩解外源重金屬對草坪植物的不良影響，為利用微生物吸附重金屬離子，降低重金屬對草坪植物的損害提供參考。

發明內容
本發明采用的蘇云金芽孢桿菌(拉丁名feci77w5· thuringiensis)菌種保藏號CFCC10206，保藏單位中國林業微生物菌種保藏管理中心，對外可以提供。生理生化特性細胞呈革蘭氏陽性，桿狀，大小為I. 0-1. 2X3-5 μ m。形成半孢晶體，對阿拉伯糖甘露醇不產酸產淀粉酶，硝酸鹽還原到亞硝酸鹽。蘇云金芽孢桿菌毒性對人、畜低毒，大鼠口服急性LD5tl 852. 7-856. 7毫克/公斤， 對家禽、鳥類、魚、畜等低毒。本發明將配制成不同濃度的蘇云金芽孢桿菌發酵濾液接種到草坪建植體系中。通過研究堆肥發酵液提高黑麥草對Cr和Cd抗性能力的方法，為草坪植物耐重金屬的建植提供依據。為實現上述目的，本發明提供如下的技術方案
一種堆肥發酵液提高黑麥草抗Cr和Cd能力的方法，其特征在于按如下的步驟進行 (I)蘇云金芽孢桿菌的分離蘇云金芽孢桿菌本身有市售；也可以分離自天津小淀垃圾堆肥處理廠的生活垃圾堆肥；本發明從生活垃圾堆肥所得到的蘇云金芽孢桿菌生理生化性質與市售的蘇云金芽孢桿菌相同，分離的方法如下
1)將新鮮堆肥樣品稱取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml無菌水三角瓶中，振蕩，使樣品中的微生物充分且均勻分布于液體中，用移液槍在三角瓶中取Iml母液，加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，此為10—1濃度的稀釋溶液，按此方法分別稀釋成ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4、 10_5、10_6幾種濃度的堆肥稀釋液；分別用移液槍吸取O. I毫升濃度為10_2、10_3、10_4、10_5、 10_6稀釋液，注入到牛肉膏蛋白胨固體平板培養基上，每一稀釋度重復三次，無菌水為空白對照；用無菌玻璃刮刀將菌懸液均勻涂抹在整牛肉膏蛋白胨固體培養基上，使微生物均勻分布，將含有牛肉膏蛋白胨固體培養基的平板倒置于37°C恒溫培養箱中培養I天；
2)蘇云金芽孢桿菌發酵液的制備
A.將分離出的蘇云金芽孢桿菌菌種純化培養2代；然后接入裝有50mL牛肉膏蛋白胨液體培養基的250 mL三角瓶中，180 r/min37°C培養；選用600nm波長進行比濁測定，以菌懸液的OD值為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制微生物的生長曲線；根據生長曲線獲得微生物生長至穩定期的時間，取穩定期的菌種采用顯微鏡直接計數法計算每mL菌液中的活菌數；
B.取純化蘇云金芽孢桿菌菌種，接入裝有50mL高氏一號液體培養基的250 mL三角瓶中，180 r/min37°C培養8 12 h至穩定期，取穩定期的菌種采用顯微鏡直接計數法計算每 mL菌液中的活菌數，將穩定期的菌液進行抽濾，抽濾后將菌液通過孔徑為O. 22um的微孔濾膜，獲得的過濾液則為微生物發酵后的過濾液；其中蘇云金芽孢桿菌的菌落數(個)
稀釋倍數W微生物菌落數 P10-V·27 2 XlO2KIO-3*'12 SxICPtj48x10V10-1菌落數<3D，無法計數—IO-6P菌落數<3Q，無法計數^
結論通過在牛肉膏蛋白胨培養基上生長的蘇云金芽孢桿菌的菌落數情況可以看出， 堆肥中的蘇云金芽孢桿菌菌落數高于土壤對照，由于10_4倍濃度下的土壤中和10_5、10_6的濃度下堆肥和土壤中的菌落數均少于30個，因此無法進行統計計數。3)稀釋蘇云金芽孢桿菌發酵液
取一部分過濾液分別稀釋至4倍濾液和8倍濾液，備用；
4)堆肥發酵液提高黑麥草對Cr和Cd抗性能力的方法
在直徑為7cm的一次性塑料杯中加入200g烘干土壤，并播種黑麥草種子O. 5g，待播種 IOd后，分別向草坪植物上加入Iml堆肥發酵液，對照組加入無菌液體培養基，加菌劑生長 5d后，向土壤中分別加入氯化鎘和重鉻酸鉀溶液，實驗為3次重復，共60個樣品，室內適溫繼續培養，實驗期間每天定量給水，保證各個處理間環境一致，待其生長30天后測定各項指標；
其中的純化培養2代培養指的是用接菌環直接挑起待純化的菌落，接種到事先準備好的高氏一號平板固體培養基中，在平板上自左向右輕輕劃線，將培養皿倒置于37°C恒溫培養箱中培養I天，此過程為純化一代，從純化一代的菌種中挑取菌落再重復此過程為純化二代其中的純化培養2代培養指的是用接菌環直接挑起待純化的菌落，接種到事先準備好的高氏一號平板固體培養基中，在平板上自左向右輕輕劃線，將培養皿倒置于37°C恒溫培養箱中培養I天，此過程為純化一代，從純化一代的菌種中挑取菌落再重復此過程為純化二代。本發明所制備的蘇云金芽孢桿菌與從生活垃圾堆肥所所制備的蘇云金芽孢桿菌生理生化性質與市售的相同，故未保藏。關于蘇云金芽孢桿菌的鑒定結果
在牛肉膏蛋白胨培養基上挑取與蘇云金芽孢桿菌相似的菌落，發現在培養基上形成的菌落為圓形，白色，邊緣光滑，不透明，革蘭氏染色為陽性，菌體在顯微鏡下觀察呈橢圓形桿狀，芽孢為橢圓形，用溴酚藍和番紅染液進行伴胞晶體染色，鏡下觀察到有紅色菌體，無色芽孢以及藍色伴孢晶體，初步鑒定其為蘇云金芽孢桿菌(與市售的相同)。細菌的生理生化實驗結果
將初步鑒定為蘇云金芽孢桿菌的菌株定為待測菌株，對其進行生理生化實驗的檢測，得到結果如下表
權利要求
1. 一種堆肥發酵液提高黑麥草抗Cr和Cd能力的方法，其特征在于按如下的步驟進(I)蘇云金芽孢桿菌的分離1)將新鮮堆肥樣品稱取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml無菌水三角瓶中，振蕩，使樣品中的微生物充分且均勻分布于液體中，用移液槍在三角瓶中取Iml母液，加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，此為10—1濃度的稀釋溶液，按此方法分別稀釋成ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4、 10_5、10_6幾種濃度的堆肥稀釋液；分別用移液槍吸取O. I毫升濃度為10_2、10_3、10_4、10_5、 10_6稀釋液，注入到牛肉膏蛋白胨固體平板培養基上，每一稀釋度重復三次，無菌水為空白對照；用無菌玻璃刮刀將菌懸液均勻涂抹在整牛肉膏蛋白胨固體培養基上，使微生物均勻分布，將含有牛肉膏蛋白胨固體培養基的平板倒置于37°C恒溫培養箱中培養I天；2)蘇云金芽孢桿菌發酵液的制備A.將分離出的蘇云金芽孢桿菌菌種純化培養2代；然后接入裝有50mL牛肉膏蛋白胨液體培養基的250 mL三角瓶中，180 r/min37°C培養，選用600nm波長進行比濁測定，以菌懸液的OD值為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制微生物的生長曲線，根據生長曲線獲得蘇云金芽孢桿菌生長至穩定期的時間；B.取純化蘇云金芽孢桿菌菌種，接入裝有50mL高氏一號液體培養基的250mL三角瓶中，180 r/min37°C培養8 12 h至穩定期，取穩定期的菌種采用顯微鏡直接計數法計算每 mL菌液中的活菌數，將穩定期的菌液進行抽濾，抽濾后將菌液通過孔徑為O. 22um的微孔濾膜，獲得的過濾液則為微生物發酵后的過濾液；3)稀釋蘇云金芽孢桿菌發酵液取一部分過濾液分別稀釋至4倍濾液和8倍濾液，備用；4)堆肥發酵液提高黑麥草對Cr和Cd抗性能力的方法在直徑為7cm的一次性塑料杯中加入200g烘干土壤，并播種黑麥草種子O. 5g，待播種 IOd后，分別向草坪植物上加入Iml堆肥發酵液，對照組加入無菌液體培養基，加菌劑生長 5d后，向土壤中分別加入氯化鎘和重鉻酸鉀溶液，實驗為3次重復，共60個樣品，室內適溫繼續培養，實驗期間每天定量給水，保證各個處理間環境一致，待其生長30天后測定各項指標；其中的純化培養2代培養指的是用接菌環直接挑起待純化的菌落，接種到事先準備好的高氏一號平板固體培養基中，在平板上自左向右輕輕劃線，將培養皿倒置于37°C恒溫培養箱中培養I天，此過程為純化一代，從純化一代的菌種中挑取菌落再重復此過程為純化二代。
全文摘要
本發明公開了一種堆肥發酵液提高黑麥草抗Cr和Cd能力的方法，它是在直徑為7cm的一次性塑料杯中加入200g烘干土壤，并播種黑麥草種子0.5g，待播種10d后，分別向草坪植物上加入菌劑，加菌劑生長5d后，向土壤中分別加入氯化鎘和重鉻酸鉀溶液，實驗為3次重復，共60個樣品，室內適溫繼續培養，實驗期間每天定量給水，保證各個處理間環境一致，待其生長30天后測定各項指標。實驗結果表明加入蘇云金芽孢桿菌菌劑后，可促進草坪植物的生長，提高了黑麥草對Cr和Cd抗性能力。
文檔編號C12R1/07GK102598977SQ201210051928
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月2日 優先權日2012年3月2日
發明者多立安, 程田, 趙樹蘭 申請人:天津師范大學