專利名稱：一種酵母培養物在促進乳酸利用菌增殖中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種酵母培養物在促進乳酸利用菌增殖中的應用。
背景技術：
通過調控瘤胃微生物菌群結構來加強反芻動物對粗飼料的利用近年來成為研究的熱點。目前存在許多方法用以調控瘤胃微生物菌群結構，如應用離子載體和抗生素。但對于飼料工業中應用抗生素所引起的問題和尋求安全飼料的廣泛關注，促使研究者致力于發展一種新型非抗生素或“天然”的飼料添加劑。微生物飼料添加劑，即直接飼喂微生物 (DFM)，完全滿足發展需求，因此被推到了歷史前臺。DFM包括細菌、酵母等，許多研究證明 DFM使用效果良好，尤其是酵母培養物。酵母培養物(Yeast culture, YC)是指由酵母菌在特定工藝條件下經充分發酵后所形成的微生態制品，主要包括酵母細胞代謝產物、經發酵后變異的培養基以及少量已無活性的酵母細胞。酵母培養物的復雜成分主要包括酵母細胞內的營養物質和酵母細胞的發酵代謝產物。作為集營養、保健于一體的新型飼料添加劑，酵母培養物通過調控瘤胃微生物區系有效提高反芻動物對飼料的利用率，這也是近年來反芻動物學和營養學研究的熱點。 酵母培養物中含有氨基酸、葡萄糖、維生素和有機酸(乳酸、蘋果酸、甲酸、琥珀酸等)等，而某些瘤胃微生物如乳酸利用菌的生長代謝也需要這些物質。所以在一定程度上可以通過乳酸利用菌的生長情況判斷酵母培養物對反芻動物的營養情況。酵母培養物的質量又受到菌種、發酵生產工藝以及檢測手段等因素的影響。酵母菌在不同的培養環境下，如不同的溫度、濕度或酸堿環境尤其是底物成分，會產生不同的發酵產物，而這其中又包含大量的未知生長因子。生產酵母培養物時所使用的培養基和發酵工藝控制參數對其終端產品中代謝產物的組成、濃度及其生物利用率的穩定性有著至關重要的影響。即便在使用相同酵母菌種的情況下，不同培養基組成或不同的發酵生產控制工藝會導致酵母培養物產品中代謝產物組成和濃度出現明顯的差異。

發明內容
本發明的目的是提供一種酵母培養物在制備促乳酸利用菌增殖制劑中的用途。所述酵母培養物是按照包括如下步驟的方法制備得到的將釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)進行液體發酵后，收集發酵液,除去所述發酵液中的所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)細胞得到的無菌液體即為所述酵母培養物。所述液體發酵在如下條件下進行20-40°C、100-200轉/分鐘振蕩培養10_30小時后再靜置培養10-60小時；該振蕩培養是在有氧條件下進行的，該靜置培養是在厭氧條件下進行的。所述液體發酵所使用的發酵培養基的溶劑為水，溶質由如下I)-3)的物質組成I)碳源，所述碳源為如下A)_C)中的任一種所述碳源具體可由IOg/ 所述氮源具體可由IOg/A)葡萄糖、蔗糖和糖蜜；B)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任兩種；C)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任一種；2)氮源，所述氮源為如下D)_F)中的任一種D)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨；E)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨中的任兩種；F)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨中的任一種；3)無機鹽，所述無機鹽為 KH2P04、MgSO4, MnSO4, CaCl2, CuSO4, ZnSO4 和 FeSO4所述碳源在所述發酵培養基中的總濃度為30_300g/L L-100g/L 葡萄糖、10g/L-100g/L 鹿糖和 10g/L-100g/L 糖蜜組成所述氮源在所述發酵培養基中的總濃度為25_640g/L L-300g/L酵母膏、10g/L-300g/L蛋白胨和5g/L_40g/L硫酸銨組成；所述無機鹽中的各組分在所述發酵培養基中的濃度分別為KH2PO4 0. Ig/ L-10. 0g/L、MgSO4 0.0488g/L-4. 88g/L、MnSO4 0.089g/L_3. 56g/L、FeSO4 0.068g/ L-2.714g/L、CaCl2 0. lg/L-4. Og/L, CuSO4 0.0639g/L_2. 556g/L、ZnSO4 0.0561g/ L-2. 244g/L ；所述發酵培養基的pH值為4· 0-6. 5。所述液體發酵按照包括如下步驟的方法進行將所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)接種于種子培養基中，20_40°C、100-200轉/分鐘振蕩培養18-40小時，獲得種子液；再將所述種子液按照(1-30) 100的體積比接種于所述發酵培養基中進行所述液體發酵；所述種子液中所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)的濃度為 106_108cfu/L。所述種子培養基的溶劑為水，溶質為葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和MnSO4，在所述種子培養基中各溶質的濃度分別為葡萄糖10g/L-40g/L、酵母粉5. 0g/L-40g/L、蛋白胨5. Og/ L-40g/L、MnSO4O. 089g/L_3. 56g/L。本發明還提供一種乳酸利用菌的培養方法，該方法包括將所述乳酸利用菌接種于含有所述酵母培養物的培養基中進行培養的步驟。在上述應用或方法中，所述乳酸利用菌為反芻獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant)或埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii(Gutierrez et al.)Rogosa)。在上述應用或方法中，所述反會獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant)具體可為反會獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant ATCC NO. 12561);所述埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii (Gutierrez et al. )Rogosa)具體可為埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii(Gutierrez et al. )Rogosa ATCC NO. 17752)。實驗證明，使用上述工藝制備得到的酵母培養物分別培養乳酸利用菌反芻獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant ATCC NO. 12561)和埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii (Gutierrez et al. ) Rogosa ATCC NO. 17752)可使其生物量分別提高2. 6-3. 5倍和2. 4-3. 8倍。本發明為提高反芻動物生產力水平、優化飼料組成提供了一個重要途徑。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例所用的培養基、菌株的詳細信息如下⑶C培養基青島海博生物技術有限公司。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) :CGMCC 編號為 2. 1882。反會獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant) ATCC 編號為 12561。埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii (Gutierrez et al. ) Rogosa) :ATCC編號為 17752。實施例I、酵母培養物及其制備方法與應用一、酵母培養物的制備I、培養基的配制液體種子培養基稱取IOg葡萄糖、5g酵母粉、5g蛋白胨和O. Ig MnSO4 ·Η20，用IL 蒸餾水加熱溶解后，121°C、0. IMpa高溫滅菌15min，備用。液體發酵培養基稱取IOg葡萄糖，IOg鹿糖，IOg糖蜜，IOg蛋白胨，IOg酵母膏， 5g 硫酸銨，O. Ig KH2PO4,0. Ig MgSO4 · 7H20，0. Ig MnSO4 · H2O, O. Ig CaCl2,0. IgCuSO4 · 5Η20, O. Ig ZnSO4 · 7Η20 和 O. Ig FeSO4 · 4Η20，蒸餾水溶解后，用 O. lmol/L HCl 溶液調節 pH 值至
4.O,定容至1L, 121°C、0. IMpa高溫滅菌15min,備用。2、種子液的獲得將凍干保藏的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae CGMCC No. 2. 1882)活化三代后接入上述液體種子培養基中，200C、100轉/分鐘振搖培養18h，獲得種子液，經檢測，該種子液經15倍稀釋后的0D_值為0. 491，釀酒酵母的活細胞數為I. I X 109cfu/L。3、發酵液的獲得將步驟2獲得的種子液按I : 100的體積比接種于液體發酵培養基中，20°C、100 轉/分鐘條件下發酵培養IOh后轉入20°C恒溫箱中靜置培養10h，獲得發酵液。4、酵母培養物的獲得將步驟3獲得的發酵液于4000轉/分鐘條件下離心5min除去菌體，將獲得的上清液用細菌過濾器(0. 22 μ m)過濾，經平板檢驗無菌長出，得到的無細胞濾液即為無菌酵母培養物。二、利用酵母培養物對乳酸利用菌進行增殖培養將凍干保藏的兩種乳酸利用菌反芻獸月形單胞菌和埃氏巨型球菌分別進行如下步驟1-4的實驗I、活化后分別接入⑶C培養基，20°C嚴格厭氧培養20h，獲得菌懸液；2、制備如下培養基乳酸鈉 15ml、硫酸銨 0.6g、NaCl 0. 5g、KH2PO4 0. lg/L、 MgSO4 · 7H20 0. lg/L、MnSO4 · H2O 0. 2g/L、CaCl2 2g/L、CuSO4 · 5H20 2g/L、ZnSO4 · 7H201g/L、 FeSO4 · 4H20 0. 3g/L, pH 值為 4. 5。
3、設置如下兩組處理，每種處理3次重復處理I (實驗組)取5ml步驟2制備的培養基、O. 025ml步驟一制備的酵母培養物和O. 005ml的乳酸利用菌菌懸液(約I X 107cfu/ml)在IOml無菌離心管中混合后密封， 37°C恒溫培養24h，得到乳酸利用菌培養液。處理2 (對照組)取5ml步驟2制備的培養基、O. 025ml無菌水和O. 005ml的乳酸利用菌菌懸液(約I X 107cfu/ml)在IOml無菌離心管中混合后密封，37°C恒溫培養24h，得到乳酸利用菌培養液。4、培養液中乳酸利用菌的生物量測定以乳酸利用菌培養基(即步驟2制備的培養基)為調零空白對照，將步驟3培養的乳酸利用菌培養液直接用TU-1901紫外可見分光光度計測定其在600nm波長條件下的吸光值即OD6tltl值，結果如表I所示。表I.培養液中乳酸利用菌生物量的測定結果
權利要求
1.一種酵母培養物在制備促乳酸利用菌增殖制劑中的應用；所述酵母培養物是按照包括如下步驟的方法制備得到的將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)進行液體發酵后，收集發酵液，除去所述發酵液中的所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)細胞得到的無菌液體即為所述酵母培養物。
2.根據權利要求I所述的應用，其特征在于所述液體發酵在如下條件下進行 20-400C >100-200轉/分鐘振蕩培養10-30小時后再靜置培養10-60小時。
3.根據權利要求I或2所述的應用，其特征在于所述液體發酵所使用的發酵培養基的溶劑為水，溶質由如下I)-3)的物質組成1)碳源，所述碳源為如下A)-C)中的任一種A)葡萄糖、蔗糖和糖蜜；B)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任兩種；C)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任一種；2)氮源，所述氮源為如下D)-F)中的任一種D)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨；E)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨中的任兩種；F)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨中的任一種；3)無機鹽，所述無機鹽為KH2P04、MgSO4, MnSO4, CaCl2, CuSO4, ZnSO4 和 FeSO4 ；所述碳源在所述發酵培養基中的總濃度為30-300g/L;所述碳源具體可由IOg/L-100g/L 葡萄糖、10g/L-100g/L 鹿糖和 10g/L-100g/L 糖蜜組成；所述氮源在所述發酵培養基中的總濃度為25-640g/L;所述氮源具體可由IOg/ L-300g/L酵母膏、10g/L-300g/L蛋白胨和5g/L_40g/L硫酸銨組成；所述無機鹽中的各組分在所述發酵培養基中的濃度分別為=KH2PO4 0. lg/L-10. 0g/L、 MgSO4 0. 0488g/L-4. 88g/L、MnSO4 0. 089g/L_3. 56g/L、FeSO4 0. 068g/L_2. 714g/L、CaCl2 0. lg/L-4. 0g/L、CuSO4 0. 0639g/L_2. 556g/L、ZnSO4 0. 0561g/L_2. 244g/L ；所述發酵培養基的pH值為4. 0-6. 5。
4.根據權利要求1-3中任一所述的應用，其特征在于所述液體發酵按照包括如下步驟的方法進行將所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)接種于種子培養基中，20-40°C、100-200轉/分鐘振蕩培養18-40小時，獲得種子液；再將所述種子液按照(1-30) 100的體積比接種于所述發酵培養基中進行所述液體發酵。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述種子培養基的溶劑為水，溶質為葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和MnSO4，在所述種子培養基中各溶質的濃度分別為葡萄糖10g/L-40g/ L、酵母粉 5. 0g/L-40g/L、蛋白胨 5. 0g/L_40g/L、MnSO4 0. 089g/L_3. 56g/L。
6.一種乳酸利用菌的培養方法，包括將所述乳酸利用菌接種于含有所述酵母培養物的培養基中進行培養的步驟。
7.根據權利要求1-6中任一所述的應用或方法，其特征在于所述乳酸利用菌為反芻獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant)或埃氏巨型球菌 (Megasphaera elsdenii (Gutierrez et al.)Rogosa)。
8.根據權利要求7所述的應用或方法，其特征在于所述反芻獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant)為反會獸月形單胞菌 (Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant ATCC NO. 12561);所述埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii (Gutierrez et al.)Rogosa)為埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii (Gutierrez et al.)Rogosa ATCC NO. 17752)。
全文摘要
本發明公開了一種酵母培養物在促進乳酸利用菌增殖中的應用。所述酵母培養物是按照包括如下步驟的方法制備得到的將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)進行液體發酵后，收集發酵液，除去所述發酵液中的所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)細胞得到的無菌液體即為所述酵母培養物。實驗證明，使用所述酵母培養物分別培養乳酸利用菌反芻獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp.ruminantium Bryant ATCC NO.12561)和埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii(Gutierrez et al.)Rogosa ATCC NO.17752)可使其生物量分別提高2.6-3.5倍和2.3-3.8倍。本發明為提高反芻動物生產力水平、優化飼料組成提供了一個重要途徑。
文檔編號C12N1/18GK102604862SQ20121005202
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者劉萍, 徐樂, 解洛香 申請人:中國農業大學