專利名稱：基于pcr的玉米半粒種子dna快速提取方法
技術領域：
本發明涉及一種基于PCR的玉米半粒種子DNA快速提取方法，屬于分子生物技術領域， 具體涉及玉米半粒種子DNA快速提取，提取后的DNA適用于PCR擴增。ニ背景技術：
目前，植物DNA提取已經發展了很多方法，可以從植物葉片、果實和種子等組織器官中提取DNA，但大多數方法提取時間較長，這些方法大多應用于科學研究，難以應用于快速檢測領域。在提取植物DNA的過程中，需要根據植物組織材料的外在性質(來源、部位、形態等)和內在特點(化學成分、組織結構等)的差異，選擇適宜的方法或作ー些特殊的處理。傳統的DNA提取方法(SDS法和CTAB法)是在裂解細胞的基礎上，用等體積的酚氯仿或酚氯仿異戊醇(25:24:1)抽提使蛋白質變性沉淀于有機相，核酸留在水相，從而達到分離核酸的目的；加入RNA酶可以去除RNA ;然后加入異丙醇或こ醇沉淀DNA ;用70%こ醇漂洗沉淀，去除殘留的有機溶劑和鹽離子，以免影響DNA溶解和后續實驗，最后用TE或ddH20 溶解DNA備用。自從SDS法和CTAB法報道以來，國內外很多學者對這兩種方法作了許多改迸。經典的DNA提取方法不需要昂貴的儀器和藥品，提取的DNA能夠滿足一般分子生物學研究的需要，已成為分子生物學實驗室提取DNA最常用的方法。但這些方法也存在著很多不足，如操作步驟復雜、耗時長、易交叉污染、苯酚和氯仿等有機溶劑易造成環境污染并且有損操作者健康等。今后，DNA提取方法研究的發展方向①用無毒的有機溶劑或無機溶劑代替有毒的有機溶劑；②簡化操作步驟，朝著批量提取的方向發展提取過程朝著自動化方向發展，將DNA提取與其他分子生物學技術(毛細管電泳、基因芯片技術等)相結合， 實現從樣品處理到分析的過程全部自動化。由于目前的DNA提取方法提取時間較長，在短時間內不能進行基于PCR的大量樣品的檢測，難以在基于PCR的快速檢測中應用。為了突破DNA提取時間較長這個瓶頸，國內外很多研究者加入了 DNA提取研究的行列，并取得了ー些成績。近年來有很多DNA快速提取方法的報道，提取時間縮短了很多，少數方法可以用于快速檢測，但提取速度還不是很快，有待進ー步加快。
發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了一種基于PCR的玉米半粒種子DNA快速提取方法。一種基于PCR的玉米半粒種子DNA快速提取技木，是先將玉米種子沿胚縱切，取含有胚的半粒種子放入I. 5mL離心管中，再加入200ii L 1000 y L提取液，所述的提取液為 0. 03M 0. 2M氫氧化鉀(K0H)或氫氧化鈉(NaOH)溶液，提取時間Imin 48h，混勻提取液，混勻后的提取液即為DNA樣品，用于PCR擴增。用于PCR擴增時DNA模板量為0. 5 y L 5u L,綜合考慮DNA樣品中雜質含量和加樣的操作方便性，通常優先選擇2 ii L作為DNA模板。本發明提取過程簡便，不研磨、不離心、不轉管、不使用有毒試劑，最主要的是提取速度非常快。用SSR引物對該方法提取的DNA進行PCR擴增，擴增產物用9%PAGE (聚丙烯酰胺凝膠)檢測，結果顯示PCR擴增產物良好。
四

圖I提取液濃度和體積對PCR擴增產物的影響(材料鄭單958)
由圖I可知，PCR擴增產物主要受提取液濃度影響，提取液體積200 ii L 1000 ii L的樣品間差異不顯著。提取液濃度0. 01 0. 02M的樣品有較弱的目標帶，0. 03 0. 05M的樣品有中等売度的目標帶，0. 06 0. 2M的樣品有清晰的目標帶，0. 3M的樣品無目標帶。圖2提取時間對PCR擴增產物的影響
由圖2可知，提取Imin 48h的樣品間差異不顯著，提取3d的樣品目標帶亮度開始減弱，提取4d的樣品目標帶已經很弱。圖3 DNA模板量對PCR擴增產物的影響
由圖3可知，各處理間差異不顯著，說明該方法有很寬的DNA模板量適應范圍。圖4不同公司的Mix對PCR擴增產物的影響(材料鄭單958)
由圖4可知，提取液濃度0. 01 0. 02M的樣品，兩個公司的Mix都擴增出較弱的目標帶；提取液濃度0. 03 0. 05M的樣品，兩個公司的Mix都擴增出中等亮度的目標帶；但 BioTeke公司的Mix對提取液濃度為0. 06M 0. 20M的樣品的擴增都顯示很亮的目標帶，而天根公司的Mix對提取液濃度為0. 06M 0. IOM的樣品擴增顯示很亮的目標帶，0. 02M的樣品就已經開始不出帶；提取液濃度為0. 3M的樣品兩個公司的Mix都未擴增出目標帶。圖5提取液濃度0. 03M,提取液體積500ml的PCR擴增產物
有圖5可知，提取液濃度0. 03M，提取液體積500ml，提取lOmin，能保證得到較好的PCR 產物。圖I、圖4中圖上方是對應的提取液(KOH溶液)濃度編號1 2:0.01M;3 4: 0. 02M ;5 6 0. 03M ;7 8 0. 04M ；9 10 :0. 05M ；11 12 0. 06M ;13 14 0. 07M ；15 16 :0. 08M ；17 18 :0. 09M ；19 20 :0. IM ；21 22 :0. 2M ；23 24 :0. 3M。圖2中圖上方是對應的提取時間編號1 2 =Imin ;3 4 5min ;5 6 =IOmin ； 7 8 20min ；9 10 :40min ；11 12 60min ；13 14 12h ；15 16 24h ；17 18 36h ； 19 20 48h ；21 22 :3d ；23 24 4d
圖3中圖上方是對應的DNA模板量編號(I 12:鄭單958) : I 2 :0. 5 y L ;3 4 : luL;5 6 :2uL;7 8 :3uL;9 10 4 u L ；11 12 :5uL。圖5中圖上方1、2、3、4對應4個重復。圖I中圖左側是對應的提取液體積。圖2中圖左側是對應的玉米品種。圖4中圖左側是對應的提供Mix的公司。圖 3 中Marker 的大小(從上到下)200bp, 180bp, 160bp, 140bp, 120bp, IOObp0五具體實施例方式
以玉米商品種子(鄭單958、先玉335)為材料，通過實施例對本發明做進ー步的描述。實施例統ー采用20 ii L PCR擴增體系，具體組分及程序如下(引物phi065 ；Mix 北京BioTeke公司、北京天根公司)。取2 y L PCR擴增后產物，濃度9%PAGE電泳檢測。本發明中的所述的濃度單位M是指摩爾濃度mol/L。
權利要求
1.一種基于PCR的玉米半粒種子DNA快速提取方法，其特征在于先將玉米種子沿胚縱切，取含有胚的半粒種子放入I. 5mL離心管中，再加入200 μ L 1000 μ L提取液，所述的提取液為O. 03Μ O. 2Μ氫氧化鉀KOH或氫氧化鈉NaOH溶液，提取時間Imin 2d，混勻提取液，混勻后的提取液即為DNA樣品，用于PCR擴增時DNA樣品模板量為O. 5 μ L 5 μ L。
2.根據權利要求I所述的一種基于PCR的玉米半粒種子DNA快速提取方法，其特征在于用于PCR擴增時所述的DNA樣品模板量為2 μ L。
全文摘要
本發明涉及一種基于PCR的玉米半粒種子DNA快速提取方法，是將玉米種子縱切，取一半(必須含有胚)放入1.5mL離心管中，加入500μL提取液(0.03mol/L～0.05mol/LKOH或NaOH溶液)，提取1min～48h，混勻，即為DNA提取液樣品。取0.5～5μL該DNA樣品可以直接用于PCR擴增，該方法的主要用途是玉米種子純度或GMO高通量檢測，和基于PCR的玉米種子DNA快速提取主要用于玉米種子DNA的快速提取，提取后的DNA滿足PCR擴增。
文檔編號C12N15/10GK102586230SQ20121005253
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月2日 優先權日2012年3月2日
發明者張春慶, 溫大興 申請人:山東農業大學