專利名稱：用于檢測轉基因玉米mir162的特異性引物及熒光標記探針及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物及熒光標記探針，及其在基因特異性定性PCR、STOR Green I實時熒光定量PCR和TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20中的應用，屬于分子生物學領域。
背景技術：
將人工分離和修飾過的基因導入到生物體基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術稱之為轉基因技術(Transgene technology) 0轉基因食品有轉基因植物，如玉米、西紅柿、土豆等，還有轉基因動物，如魚、 牛、羊等。據統計，美國食品和藥物管理局確定的轉基因品種已有43種。美國是轉基因食品最多的國家，60%以上的加工食品含有轉基因成分，90%以上的大豆、50%以上的玉米、 小麥是轉基因的。由于轉基因產品的生態安全和食用安全一直備受爭議，相繼有40多個國家和地區建立和實施了轉基因標識制度。隨著這些制度的建立與不斷完善，人們對轉基因檢測技術的準確度和靈敏度提出了嚴格的要求，各種轉基因產品的檢測技術也成為了研究執占。根據不同轉基因產品的檢測目的不同，鑒定轉基因產品的主要方式有篩查法、基因特異性檢測方法、轉化體特異性檢測方法和構建特異性檢測方法。轉基因玉米MIR162是美國先正達公司開發出來的新型抗鱗翅目昆蟲品種。申請人經過對現有專利和其他文獻的檢索，尚未發現任何關于轉基因玉米MIR162基因特異性定性PCR、SYBR Green I實時熒光定量PCR和TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測的報道。

發明內容
針對上述現有技術，本發明提供了用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物及熒光標記探針，以及其在基因特異性定性PCR、SYBR Green I實時熒光定量PCR和I1aqMan 探針實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20中的應用。本發明是通過以下技術方案實現的一種用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物，所述引物由上游引物和下游引物組成，其序列為MIR162GS-F 5' -GGACCAGAGCGAGCAAATCT-3‘；MIR162GS-R 5' -GCAGGGTCTTCATCTTCTTGGT-3‘；如SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2 所示。所述用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物可以用于定性檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20，具體應用時，步驟為(1)提取待檢測樣品的基因組DNA，并以此為模板，利用特異性引物MIR162GS-F和MIR162GS-R 進行 PCR 擴增；Q)PCR擴增產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產物；若存在擴增產物，則待檢測樣品中含有MIR162目的基因Vip3Aa20 ；若不存在擴增產物，則待檢測樣品中不含有MIR162目的基因Vip3Aa20。所述步驟(1)中，PCR程序為95°C 5min 預變性；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 35 個循環；72°C延伸7min。所述用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物可以用于STOR Green I實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20，具體應用時，步驟為(1)建立MIR162基因特異性引物的SYBR Green I實時熒光定量PCR標準曲線和 zSSnb基因的STOR Green I實時熒光定量PCR標準曲線①提取轉基因玉米MIR162標準品基因組DNA進行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入MIR162目的基因的特異性引物，以及zSSnb基因的國家標準引物，進行擴增；②擴增后，測定各稀釋液中相關熒光標記物的Ct值，該Ct值與拷貝數的自然對數呈線性關系，據此繪制MIR162目的基因Vip3Aa20的定量PCR標準曲線和zSSnb基因的定量PCR標準曲線；(2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入MIR162基因的特異性引物，以及zSSnb基因的國家標準引物，進行擴增；擴增后， 測定基因組DNA提取液中相關熒光標記物的Ct值，然后根據上述繪制的MIR162基因的定量PCR標準曲線和zSSnb基因的定量PCR標準曲線，計算出相應的拷貝數，則轉基因玉米 MIR162目的基因的拷貝數與玉米內標準基因zSSnb基因的拷貝數之比，即為待檢測樣品中轉基因玉米MIR162的百分含量。所述步驟⑴①和O)中，zSSIIb引物序列(國家標準)如下zSSIIb-F 5' -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3‘；zSSIIb-R 5' -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3‘。所述步驟(1)①和⑵中，擴增的參數如下擴增反應體積為20uL，2Xft~emix Ex Taq (Rox) IOuL,濃度為 IOumol/L 的 Forward primer 0. 4uL,濃度為 10umol/L 的 Reverse primerO. 4uL, ddH20 8. 2uL, DNA 模板 IuL ；擴增反應條件95°CIOmin 預變性；95°C 15s，58°C 30s, 72°C 30s，在 72°C收集熒光信號，共計40個循環。一種用于檢測轉基因玉米MIR162的熒光標記探針，所述探針的序列為 MIR162GS-P :FAM-5 ‘ -CTACACCAACAACATCGT-3 ‘ -Eclipse，如 SEQ ID N0. 3 所示，探針的 5'端連接一個熒光報告集團FAM，3'端連接有一個熒光淬滅集團Eclipse。上述用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物及用于檢測轉基因玉米MIR162的熒光標記探針，可以用于TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關產品是否含有 MIR162目的基因Vip3Aa20，具體應用時，步驟為(1)建立MIR162基因特異性引物的I1aqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線和 zSSIIb基因的I1aqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線①提取轉基因玉米MIR162標準品基因組DNA進行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入MIR162目的基因Vip3Aa20的特異性引物和熒光標記探針，以及zSSUb基因的國家標準引物和熒光標記探針，進行擴增；②擴增后，測定各稀釋液中相關熒光標記物的Ct值，該Ct值與拷貝數的自然對數呈線性關系，據此繪制MIR162目的基因Vip3Aa20的定量PCR標準曲線和zSSUb基因的定量PCR標準曲線；(2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入MIR162基因的特異性引物和熒光標記探針，以及zSSUb基因的國家標準引物和熒光標記探針，進行擴增；擴增后，測定基因組DNA提取液中相關熒光標記物的Ct值，然后根據上述繪制的MIR162基因的定量PCR標準曲線和zSSUb基因的定量PCR標準曲線，計算出相應的拷貝數，則轉基因玉米MIR162基因的拷貝數與玉米內標準基因zSSUb基因的拷貝數之比，即為待檢測樣品中轉基因玉米MIR162的百分含量。所述步驟(1)①和O)中，zSSUb引物和探針序列(國家標準)如下zSSIIb-F 5' -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3‘；zSSIIb-R 5' -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3‘；zSSIIb-P :FAM-5' -TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3‘ -TAMRA。所述步驟(1)①和⑵中，擴增的參數如下擴增反應體積為20uL，2Xft~emix Ex Taq (Rox) 12. 5uL,濃度為 10umol/L 的 Forward primer IuL,濃度為 10umol/L 的 Reverse primer luL，濃度為 lOumol/L 的 TaqMan probeO. 5uL, ddH20 4uL, DNA 模板 IuL ；擴增反應條件95°CIOmin 預變性；95°C 15s，58°C 30s，72°C 30s，在 72°C收集熒光信號，共計45個循環。本發明設計了針對轉基因玉米MIR162目的基因Vip3Aa20的特異性引物與探針序列，并建立了轉基因玉米MIR162基因特異性定性PCR檢測方法、STOR Green I實時熒光定量PCR檢測方法和TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法，該檢測方法經實驗驗證，靈敏、 準確、簡單、可靠，具有廣闊的應用價值與市場前景。


圖1為實施例1中轉基因玉米MIR162基因特異性定性PCR擴增結果電泳示意圖。圖2為實施例2中內標準基因zSSUb的STOR Green I實時熒光定量PCR標準曲線。圖3為實施例2中轉基因玉米MIR162目的基因Vip3Aa20STOR Green I實時熒光定量PCR標準曲線。圖4為實施例3中內標準基因zSSUb的I1aqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線。圖5為實施例3中轉基因玉米MIR162目的基因Vip3Aa20TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例1轉基因玉米MIR162轉化體特異性定性PCR檢測方法引物由大連Takara公司合成，稀釋成lOumol/L備用，合成的引物序列如下
MIR162GS-F 5' -GGACCAGAGCGAGCAAATCT-3‘；MIR162GS-R 5' -GCAGGGTCTTCATCTTCTTGGT-3‘。分別提取轉基因玉米MIR162、GA21、NK603、M0N810、M0N88017、TC1507、MIR604、 Btl76、Btll，非轉基因大豆1138-2，轉基因大豆GTS40-3-2、M0N87701，轉基因棉花 M0N88913、LLcotton25、M0N531、M0N1445，轉基因水稻TT51、科豐6號，非轉基因玉米鄭單 958基因DNA為模板，分別用MIR162GS-F和MIR162GS-R引物組合進行PCR擴增。PCR程序為:95°C 5min 預變性；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s，;35 個循環；72°C延伸 7min。PCR 擴增產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產物。結果利用所設計的引物以提取的基因組為模板進行PCR擴增，結果如圖1所示， 由圖可見，只有轉基因玉米MIR162基因組成功擴增出98bp特異性產物，而其他轉基因和非轉基因樣品模板都沒有可觀察到的擴增產物。由此證明，該引物具有良好的特異性，適合于轉基因玉米MIR162基因特異性的定性檢測。實施例2轉基因玉米MIR162基因特異性STOR Green I實時熒光定量PCR檢測方法提取轉基因玉米MIR162標準品基因組DNA，按5倍倍比分別稀釋至5°，5^,5"2, 5_3， 5_4 ；相應的拷貝數設為100000，20000，4000，800，160，每個濃度設3個重復，檢測擴增的重復性。引物由大連Takara公司合成，稀釋成lOumol/L備用。合成的MIR162引物序列如下MIR162GS-F 5' -GGACCAGAGCGAGCAAATCT-3‘；MIR162GS-R 5' -GCAGGGTCTTCATCTTCTTGGT-3‘。玉米內標引物(zSSIIb)采用國家標準引物，其序列如下zSSIIb-F 5' -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3‘；zSSIIb-R 5' -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3‘。擴增反應體積為 20uL，2 X Premix Ex Taq (Rox) IOuL，濃度為 IOumo 1/L 的 Forward primerO. 10umol/L ^ Reverse primer 0. 4uL, ddH20 8. 2uL，DNAluL。才Γ 增反應條件95°C IOmin預變性；95°C 15s，58°C 30s, 72°C 30s，在72°C收集熒光信號，共計 40個循環。每個試樣重復3次，同時設立無菌雙蒸水(ddH20，空白)和非轉基因樣品(鄭單958，陰性)對照。結果通過對不同MIR162標準品拷貝數為100000，20000，4000，800，160的DNA進行STOR Green I實時熒光定量PCR擴增，計算機軟件自動生成標準曲線，縱坐標為Ct，橫坐標為起始拷貝數的自然對數。根據標準曲線所得的線性計算公式，通過對不同轉基因含量的轉基因玉米MIR162標準品(1%,0.5%,0. 1%,0. 05%,0.01% 陽性樣品、陰性樣品及空白對照的測定，將樣品的Ct值代入公式，即可得到待測樣品轉基因成分的百分含量。對玉米內標準基因zSSnb和轉基因玉米MIR162的基因特異性引物對同一組標準品DNA和不同百分含量的轉基因玉米DNA進行STOR Green I實時熒光定量PCR擴增，分別得到PCR擴增曲線，并由系統軟件自動生成標準曲線。玉米內標準基因zSSnb的標準曲線如圖2所示，該曲線的斜率為-3. 25，相關系數R2為0. 999。轉基因玉米MIR162的基因特異性引物的標準曲線如圖3所示，該曲線的斜率為-3. 557，相關系數R2為0. 998。因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。根據公式樣品中轉基因玉米MIR162含量=(外源基因MIR162拷貝數/內標基因zSSUb 拷貝數)X100%可以計算出待測樣品中轉基因成分MR162的百分含量。實施例3轉基因玉米MIR162轉化體特異性TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法提取轉基因玉米MIR162標準品基因組DNA，按5倍倍比分別稀釋至5°，5—1，5_2，5_3，5_4 ；相應的拷貝數設為100000，20000，4000，800，160，每個濃度設3個重復，檢測擴增的重復性。引物和探針由大連Takara公司合成，稀釋成lOumol/L備用。合成的MIR162引物與探針序列如下MIR162GS-F 5' -GGACCAGAGCGAGCAAATCT-3‘；MIR162GS-R 5' -GCAGGGTCTTCATCTTCTTGGT-3‘；MIR162GS-P :FAM-5' -CTACACCAACAACATCGT-3‘ -Eclipse。玉米內標引物與探針(zSSIIb)采用國家標準引物與探針，其序列如下zSSIIb-F 5' -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3‘；zSSIIb-R 5' -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3‘；zSSIIb-P :FAM-5' -TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3‘ -TAMRA。擴增反應體積為20uL,2XPremix Ex Taq (Rox) 12. 5uL,濃度為 10umol/L 的 Forward primer IuL,濃度為 10umol/L 的 Reverse primer IuL,濃度為 lOumol/L 的 TaqMan probeluL, ddH20 3. 5uL, DNA 模板 IuL ；擴增反應條件95 °C IOmin 預變性；95 °C 15s, 58°C 30s, 72°C 30s，在72°C收集熒光信號，共計45個循環。每個試樣重復3次，同時設立無菌雙蒸水(ddH20，空白)和非轉基因樣品(鄭單958，陰性)對照。結果通過對不同MIR162標準品拷貝數為100000，20000，4000，800，160的DNA進行TaqMan實時熒光定量PCR擴增，計算機軟件自動生成標準曲線，縱坐標為Ct，橫坐標為起始拷貝數的自然對數。根據標準曲線所得的線性計算公式，通過對不同轉基因含量的轉基因玉米MIR162標準品(1 %，0. 5 %，0. 1 %，0. 05 %，0. 01 % )、陽性樣品、陰性樣品及空白對照的測定，將樣品的Ct值代入公式，即可得到待測樣品轉基因成分的百分含量。對玉米內標準基因zSSUb和轉基因玉米MIR162的基因特異性引物對同一組標準品DNA和不同百分含量的轉基因玉米DNA進行TaqMan實時熒光定量PCR擴增，分別得到 PCR擴增曲線，并由系統軟件自動生成標準曲線。玉米內標準基因zSSUb的標準曲線如圖 4所示，該曲線的斜率為-3. 557，相關系數R2為0. 999。轉基因玉米MIR162的基因特異性引物的標準曲線如圖5所示，該曲線的斜率為-3. M6，相關系數R2為0. 997.因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。根據公式樣品中轉基因玉米MIR162含量=(外源基因MIR162拷貝數/內標基因zSSUb 拷貝數)X100%可以計算出待測樣品中轉基因成分MR162的百分含量。以上結果可以證明，本發明為轉基因玉米MIR162目的基因Vip3Aa20的定性PCR、 SYBRGreen I實時熒光定量PCR和TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測提供了簡單、可靠的測定方法，可以用于轉基因玉米MIR162的檢測。本發明為轉基因標識提供了一種強有力的技術支撐，為轉基因產品的控制提供了必要的手段。
權利要求
1.一種用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物，其特征在于所述引物由上游引物和下游引物組成，其序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。
2.權利要求1所述的用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物在定性檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20中的應用。
3.權利要求1所述的用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物在STORGreen I實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20中的應用。
4.一種用于檢測轉基因玉米MIR162的熒光標記探針，其特征在于所述探針的序列如 SEQ ID NO. 3所示，探針的5'端連接一個熒光報告集團FAM，3‘端連接有一個熒光淬滅集團 Eclipse。
5.權利要求1所述的用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物及權利要求4所述的用于檢測轉基因玉米MIR162的熒光標記探針在TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20中的應用。
6.一種定性檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20的方法，其特征在于步驟為(1)提取待檢測樣品的基因組DNA，并以此為模板，利用特異性引物MIR162GS-F和 MIR162GS-R 進行 PCR 擴增；0)PCR擴增產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產物；若存在擴增產物，則待檢測樣品中含有MIR162目的基因Vip3Aa20 ；若不存在擴增產物，則待檢測樣品中不含有MIR162目的基因Vip3Aa20。
7.一種STOR Green I實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20的方法，其特征在于步驟為(1)建立MIR162基因特異性引物的STORGreenI實時熒光定量PCR標準曲線和zSSnb 基因的STORGreen I實時熒光定量PCR標準曲線①提取轉基因玉米MIR162標準品基因組DNA進行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入 MIR162目的基因的特異性引物，以及zSSnb基因的國家標準引物，進行擴增；②擴增后，測定各稀釋液中相關熒光標記物的Ct值，該Ct值與拷貝數的自然對數呈線性關系，據此繪制MIR162目的基因Vip3Aa20的定量PCR標準曲線和zSSnb基因的定量 PCR標準曲線；(2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入MIR162基因的特異性引物，以及zSSnb基因的國家標準引物，進行擴增；擴增后，測定基因組DNA提取液中相關熒光標記物的Ct值，然后根據上述繪制的MIR162基因的定量PCR 標準曲線和zSSnb基因的定量PCR標準曲線，計算出相應的拷貝數，則轉基因玉米MIR162 目的基因的拷貝數與玉米內標準基因zSSnb基因的拷貝數之比，即為待檢測樣品中轉基因玉米MIR162的百分含量。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟⑴①和(2)中，擴增的參數如下擴增反應體積為 20uL，2XPremix Ex Taq (Rox) 10uL，濃度為 10umol/L 的 Forward primer 0.lOumol/L 的 Reverse primer 0. 4uL, ddH20 8. 2uL,DNA|ffe. IuL ；if 增反應條件95°C IOmin預變性；95°C 15s，58°C 30s, 72°C 30s，在72°C收集熒光信號，共計 40個循環。
9.一種TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20的方法，其特征在于步驟為(1)建立MIR162基因特異性引物的I1aqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線和zSSnb 基因的TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線①提取轉基因玉米MIR162標準品基因組DNA進行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入 MIR162目的基因Vip3Aa20的特異性引物和熒光標記探針，以及zSSUb基因的國家標準引物和熒光標記探針，進行擴增；②擴增后，測定各稀釋液中相關熒光標記物的Ct值，該Ct值與拷貝數的自然對數呈線性關系，據此繪制MIR162目的基因Vip3Aa20的定量PCR標準曲線和zSSUb基因的定量 PCR標準曲線；(2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入MIR162基因的特異性引物和熒光標記探針，以及zSSUb基因的國家標準引物和熒光標記探針，進行擴增；擴增后，測定基因組DNA提取液中相關熒光標記物的Ct值，然后根據上述繪制的MIR162基因的定量PCR標準曲線和zSSUb基因的定量PCR標準曲線，計算出相應的拷貝數，則轉基因玉米MIR162基因的拷貝數與玉米內標準基因zSSUb基因的拷貝數之比，即為待檢測樣品中轉基因玉米MIR162的百分含量。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述步驟(1)①和O)中，擴增的參數如下擴增反應體積為20uL，2XPremix Ex Taq(Rox) 12. 5uL，濃度為10umol/L的 Forward primer IuL,濃度為 10umol/L 的 Reverse primer IuL,濃度為 lOumol/L 的 TaqMan probeO. 5uL, ddH20 4uL, DNA 模板 IuL ；擴增反應條件95°C IOmin預變性；95°C 15s, 58°C 30s, 72°C 30s，在72°C收集熒光信號，共計45個循環。
全文摘要
本發明公開了一種用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本發明還公開了一種用于檢測轉基因玉米MIR162的熒光標記探針，序列如SEQ ID NO.3所示，探針的5′端連接一個熒光報告集團FAM，3′端連接有一個熒光淬滅集團Eclipse。本發明還公開了該引物及探針用于基因特異性定性PCR、SYBR Green I實時熒光定量PCR和TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20的檢測方法，該檢測方法經實驗驗證，靈敏、準確、簡單、可靠，具有廣闊的應用價值與市場前景。
文檔編號C12Q1/68GK102559921SQ20121005253
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月2日 優先權日2012年3月2日
發明者孫紅煒, 張廣遠, 李凡, 楊淑珂, 路興波 申請人:山東省農業科學院植物保護研究所