專利名稱：白皮松父系鑒定方法
技術領域：
本發明涉及基因檢測方法，具體而言涉及白皮松父系鑒定方法。
背景技術：
植物的種源鑒定、父本分析是物種保存、種子園設計的重要內容，旨在通過解讀種子或個體的可能父本來源，判斷產地以及花粉或種子散播方式。現在常規方法是利用大量的分子標記組合分析植物個體的基因型，推斷子代可能的父本。在松科植物中主要采用葉綠體微衛星標記。一般認為葉綠體微衛 星具有父系遺傳、變異率高的特點，能夠通過數個甚至十余個基因的組合鑒定個體的遺傳特征，排除非親本個體。白皮松(Pinus bungeana)是我國特產的珍稀瀕危植物，因其樹形優美而成為園林綠化的優良品種。為保存白皮松種質資源、合理規劃種子園、滿足親本識別的要求，高變異葉綠體基因片段的篩選成為當務之急。現有技術通常利用葉綠體微衛星(cpSSR)高變異的特點，植物個體的DNA通過PCR擴增多個cpSSR位點，然后把所有位點的基因組合在一起當作一個基因型，再尋找與該基因型相一致的基因組合，結合產地植物群體特征，確定種質來源與可能父本。可以看出，現有技術方案很大程度依賴與cpSSR變異的高低。cpSSR變異越高則父本識別效率越高，所需位點越少，成本越低。反之，則效率降低、成本增加。

發明內容
然而我們通過對白皮松葉綠體微衛星的研究表明，其變異率遠較其它近緣種低，諸多微衛星位點沒有變異，不能夠用于種質鑒定與父系分析。因此，如何鑒別白皮松的父系需要采用其它方法來實現。本發明的目的一方面是提供一種白皮松父系鑒定方法，為了實現本發明的目的，采用如下技術方案本發明一方面涉及白皮松父系鑒定方法，包括如下步驟(I)提取待測白皮松樣品的DNA ；(2)使用引物Pb-F :5’ -TGGCATTATGGAITCTCC-3’，Pb-R 5，-AATTCTGCACAGCCTCGTC-3，對 DNA 樣品進行 PCR 擴增；(3)擴增產物進行測序，將測序結果與SEQ NO =Hl-HlO的序列進行比對以鑒別其父系。在本發明的一個優選實施方式中，所述的鑒定方法包括如下步驟(I)用CTAB法提取白皮松DNA ；(2)合成引物Pb-F :5’ -TGGCATTATGGAITCTCC-3’，Pb-R 5’ -AATTCTGCACAGCCTCGTC-3’(3)采用步驟2中的引物對DNA樣品進行PCR擴增PCR 的反應體系(25ii L) :PCR-Mix 13. 5 y L ;正反向引物各 0. I y M ;DNA 模板50ng，ddH20不足體積。PCR在MJ Research Inc.生產的PTC-200型熱循環儀上進行，反應程序為94°C預變性4min ;94°C變性45sec ；50. 3°C退火45sec ;72°C延伸Imin ；36個循環，72°C延伸 5min ;10°C保存；(4)擴增產物進行測序，將測序結果與Hl-HlO的序列進行比對以鑒別其父系。本發明另一方面還涉及SEQ NO =Hl-HlO或其互補序列在白皮松父系鑒定中的應用。本發明通過對珍稀瀕危植物白皮松葉綠體基因檢測，能夠利用單一基因對不同地理種源的進行有效鑒定，大幅度提聞了白皮松父本的檢測效率，彌補了現有葉綠體基因標記變異率低，需要的標記量大的不足。


圖I :不同產地白皮松葉綠體基因類型及頻率。
具體實施例方式實施例I :采集源于5個不同產地的15個皮松樣本，通過如下步驟對其父系進行鑒定(I)用CTAB法提取白皮松DNA ；(2)合成引物Pb-F :5’ -TGGCATTATGGAITCTCC-3’，Pb-R 5’ -AATTCTGCACAGCCTCGTC-3’(3)采用步驟2中的引物對DNA樣品進行PCR擴增PCR 的反應體系(25ii L) :PCR_Mix 13. 5 ii L ;正反向引物各 0. I ii M ;DNA 模板50ng，ddH20不足體積。PCR在MJ Research Inc.生產的PTC-200型熱循環儀上進行，反應程序為94°C預變性4min ;94°C變性45sec ；50. 3°C退火45sec ;72°C延伸Imin ；36個循環，72°C延伸 5min ;10°C保存；(4)擴增產物進行測序，將測序結果與Hl-HlO的序列進行比對以鑒別其父系。鑒定結果鑒定結果如圖I所示，例如四川白皮松固定特殊的H2基因，秦嶺南坡種源以H5為主，黃土高原群體以Hl和H3的組合為主，該標記的高變異性表明其可用于個體識別與父系鑒定。當理解的是，以上具體實施方式
僅僅是舉例性說明，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.白皮松父系鑒定方法，包括如下步驟 (1)提取待測白皮松樣品的DNA； (2)使用引物Pb-F:5，-TGGCATTATGGATTCTCC-3，，Pb-R 5’ -AATTCTGCACAGCCTCGTC-3’ 對 DNA 樣品進行 PCR 擴增； (3)擴增產物進行測序，將測序結果與SEQNO =Hl-HlO的序列進行比對以鑒別其父系。
2.根據權利要求I所述的白皮松父系鑒定方法，所述的鑒定方法包 括如下步驟 (1)用CTAB法提取白皮松DNA； (2)合成引物Pb-F:5’ -TGGCATTATGGATTCTCC-3’，Pb-R 5’ -AATTCTGCACAGCCTCGTC-3’ (3)采用步驟2中的引物對DNA樣品進行PCR擴增 PCR的反應體系(25 μ L) =PCR-Mix 13. 5 μ L ;正反向引物各O. I μ M ;DNA模板50ng，ddH20不足體積。PCR在MJ Research Inc.生產的PTC-200型熱循環儀上進行，反應程序為:94°C預變性 4min ;94°C變性 45sec ；50. 3°C退火 45sec ;72°C延伸 Imin ；36 個循環，72°C延伸5min ;10°C保存； (4)擴增產物進行測序，將測序結果與Hl-HlO的序列進行比對以鑒別其父系。
3.基因序列SEQNO =Hl-HlO或其互補序列在白皮松父系鑒定中的應用。
全文摘要
本發明公開了白皮松父系鑒定方法，包括如下步驟(1)提取待測白皮松樣品的DNA；(2)使用引物Pb-F5’-TGGCATTATGGATTCTCC-3’，Pb-R5’-AATTCTGCACAGCCTCGTC-3’對DNA樣品進行PCR擴增；(3)擴增產物進行測序，將測序結果與SEQ NOH1-H10的序列進行比對以鑒別其父系。本發明通過對珍稀瀕危植物白皮松葉綠體基因檢測，能夠利用單一基因對不同地理種源的進行有效鑒定，大幅度提高了白皮松父本的檢測效率，彌補了現有葉綠體基因標記變異率低，需要的標記量大的不足。
文檔編號C12Q1/68GK102676649SQ201210057230
公開日2012年9月19日 申請日期2012年2月29日 優先權日2012年2月29日
發明者劉占林, 劉宇佳, 楊佳 申請人:西北大學