專利名稱：一株產琥珀酸的琥珀酸放線桿菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株厭氧條件下發酵高產琥珀酸的微生物菌株(F3-ZK)的選育，以及發酵產琥珀酸過程，屬生物技術領域。
背景技術：
琥珀酸，學名丁二酸，因最早于琥珀中發現而得名。作為一種重要的C4平臺化合物，廣泛應用于醫藥、食品、可降解塑料和化學工業。琥珀酸主要是通過來源于石化原料的順丁烯二酐水解得到。由于石化資源的不可再生和石化工業對環境產生的負面影響，發酵法生產琥珀酸作為一種新興的綠色工藝，已成為近年來研究的熱點。發酵法生產琥珀酸具有低碳、清潔環保的特點，符合可持續發展的要求。其中選育高產琥珀酸菌株是實現發酵法生產琥珀酸工業化的關鍵一環。目前，已報道發酵法生產琥珀酸的微生物菌株有產琥珀酸放線桿菌Mc tinobacillus succinogenes )、 產琥拍酸厭氧螺、lif (.Anaerobiospirillum succiniciproducens ) > 產琥拍酸曼氏溶血桿HMannheimia Succiniciproducens ) >大腸桿菌(萬.coli )和谷氨酸棒桿菌 (Corynebac terium glu tanicum )。早期研究較為成功的嚴格厭氧螺菌Jaaero力io^iriW腫 succiniciproducens ATCC 四305，其產琥珀酸可達 43g/L，產率 91% (US 5, 143, 833 ；US 5，143，834和US 5，168，055)；密歇根大學和密歇根生物技術研究所篩選的兼性厭氧菌 Bacterium 130Z (Actinobacillus succinogenes ATCC 55618)，產琥珀酸含量可達 70g/ L，產率80% (US 5，04，004，1996 ；US 5，723，322，1998)，其最高研究水平發酵7 產酸達到 106.8 g/L，對葡萄糖產率83% (US 5573931，1996)；韓國科學技術研究院研究組篩選曼氏琥珀酸桿菌sWccifliciZTroifoceas,報道的最高產琥珀酸水平為52. 4 g/L，生產強度 1.8 g/L'h, (S. J. Lee et al. Appl Envi Microbiol, 2006)。美國阿貢國家實驗室Μ. I. Donnelly等、南伊利諾斯州大學的Clark DP等研究組、喬治亞大學的Mark Α. Eiteman研究組等研究構建大腸桿菌基因工程菌，其中五cWi AFPlll/pTrc99A- pyc最高水平產酸 99. 2 g/L(Vemuri G N et al. J Ind Microbiol Biotechnol, 2002)。但是，上述有生產前景的菌株受專利保護，不易獲得。中國專利 CN 1884484A 公布了一株 Jciiz7O^ciBw1S succinogenes NJ113，編號為CGMCC N0. 171，其產琥珀酸可達38. 5 g/L ；中國專利CN1884484A公布了一株高產琥珀酸的谷氨酸棒桿菌CGMCC N0. 3991，其發酵液最高產琥珀酸35. 8g/L。本研究小組前期從牛的瘤胃中篩選到一株產琥珀酸的野生菌株，通過菌種鑒定確認為產琥珀酸放線桿菌CGMCC 1593 (中國專利ZL 200610038113. 6);通過NTG誘變選育氟乙酸鈉抗性突變株，得到產量提高的誘變菌株SF-9 (工業微生物，2007, 37 (2) 1_7)，其5L發酵罐中發酵3 可積累琥珀酸 40. 5g/L，應用基因組改組技術選育到耐鈉、氟乙酸鈉抗性改組菌CGMCC 2653 (即F3-IO,中國專利ZL 200810146688. 9)，該菌株在5L發酵罐中補料分批發酵4 產琥珀酸53. 96g/L。 2009年報道了采用基因組改組技術選育耐酸性琥珀酸放線桿菌F3-21，其在5L發酵罐中補料分批發酵7 產琥珀酸達到67. 4g/L (微生物學通報，2009，36 (11) :1676_1681)。但是這些菌株的產琥珀酸水平多數達不到70g/L，生產強度在1.3 g/(L.h)以下，應用于工業化生產的成本相對還是偏高。本發明針對上述問題，在前期工作的基礎上，采用基因組改組技術，通過改進篩選方法，選育到高產琥珀酸的琥珀酸放線桿菌F3-ZK，其產酸水平為70-95. 6 g/L。比出發菌株F3-21產酸提高41. 8%，生產強度提高111. 7%，糖酸轉化率提高9. m。該菌株具有高產、 降低生產成本的優勢。

發明內容
本發明的目的是提供一株產琥珀酸的琥珀酸放線桿菌，其產酸水平為70-95. 6 g/ L0本發明的技術方案一株高產琥珀酸的琥珀酸放線桿菌Mc tinobacillus succinogenes) F3-ZK，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC NO :M2012036。所述CCTCC N0:M2012036菌株的應用，該菌在5-15L發酵罐中，補料分批發酵 36-48 h 產琥珀酸 70-95. 6 g/L，生產強度 1. 70-1. 99 g/(L *h)，糖酸轉化率 0. 70-0. 83 g/一株高產琥珀酸的琥珀酸放線桿菌JciiflO力aci/^As succinogenes F3-ZK， 巳保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC NO :M2012036o通過以下選育得到 CGMCC1593經基因組改技術得到的菌株F3-21為出發菌株，通過吖啶黃、紫外線、紫外線-硫酸二乙酯和亞硝基胍誘變，采用“96孔板培養-HPLC濃縮檢測-厭氧瓶復篩”的方法，獲得進一步進行基因組改組的出發菌庫，再通過三輪的原生質體遞進融合，得到改組菌A succinogenes F3_ZK0以下是本發明方法的詳細描述
改進的“96孔板培養-HPLC濃縮檢測-厭氧瓶復篩”篩選方法 吖啶黃、紫外線、紫外線-硫酸二乙酯和亞硝基胍對菌株F3-21進行誘變處理，處理液涂布于選擇性平板，并于37°C厭氧培養3-5 d。選擇性平板上長出的單菌落用牙簽接入96 孔細胞培養板發酵培養基中，置于厭氧手套箱中在100%C02條件下培養M-72 h。采用濃縮檢測法對96孔進行HPLC檢測第一步96孔板中孔的編號規則先按96孔板發酵批次編號I、II、III、IV、V等，然后在每塊96孔板中，按行順序編號1、2、3··· 12和列順序編號A、 B、O·· H ；第二步將每行如1-A，1-B,……I-H孔中的發酵液等體積混合，樣品處理后進行 HPLC檢測；第三步對檢測結果最高一組(假設是第2組)中的單孔發酵液進行下一輪檢測， 如對2-A，2-B,……2-H孔中的發酵液分別用HPLC檢測，通過減少測定數量，達到濃縮篩選的目的。每塊細胞培養板選出1-2株產琥珀酸含量最高的菌株，接種到厭氧瓶中進行復篩， 產酸高的前5-15株菌組成基因組改組的出發菌庫。選擇平板是在TSB平板培養基中，分別添加0.3-0. 5 mol/L琥珀酸鈉、10-100 g/L 丙酮酸鈉、1-20 g/L氟乙酸鈉和稀釋1-5倍發酵液，制成相應的琥珀酸鈉的平板，丙酮酸鈉的平板，氟乙酸鈉的平板以及發酵液的平板。發酵培養基按文獻微生物學通報(2009,36 :1676-1681)中報道的方法。基因組改組方法
改組出發菌庫的菌株培養12-24 h后轉接到另一新鮮培養基中，取基本處于對數生長期的細胞在6000-100000r/min轉速下離心，PB緩沖液洗滌和制成菌體懸液，向菌懸液中加入適量溶菌酶于在37°C水浴中酶解得到原生質體。將得到的原生質體懸液等量混合后分成兩等份，分別進行紫外(25 W紫外燈下30 cm處照射5_10 min)和熱滅活(55°C，20-60 min)，取等量的滅活菌懸液在離心管中混合，離心后用PB緩沖液懸浮，然后加入0.2-5mL PEG在37 °C水浴中融合5-20min，離心棄去上清，用PB緩沖液懸浮，涂布選擇性再生平板上， 倒置于37°C厭氧培養箱培養3-5 d。將再生平板上長出的融合子挑入96孔細胞培養板，按 “96孔板培養-HPLC濃縮檢測-厭氧瓶復篩”篩選方法，進行第一輪基因組改組菌的篩選。 將得到的3-5株高產菌，作為第二輪基因組改組的母本，按同樣的流程進行第二輪、第三論基因組改組。有機酸產物檢測方法，按中國專利ZL 200610038113. 6所述的方法。酶活分析按文獻Arch Microbiol (1997,167 332 - 342)所述的方法。本發明的有益效果通過改進篩選方法，選育到高產琥珀酸的琥珀酸放線桿菌 F3-ZK,即CCTCC NO :M2012036，其產酸水平為70-95. 6 g/L。比出發菌株F3_21產酸提高 41. 8%，生產強度提高111. 7%，糖酸轉化率提高9. m。該菌株具有高產、降低生產成本的優勢。生物材料樣品保藏一株高產琥珀酸的琥珀酸放線桿菌Mc tinobacillus succinogenes) F3-ZK，已保藏于中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，地址中國武漢武漢大學，保藏日期2012年2月洸日，保藏編號CCTCC NO :M2012036。


圖1 F3-I改組菌5 L攪拌罐補料分批發酵曲線。
具體實施例方式實施例1
分別用吖啶黃、紫外線、紫外線-硫酸二乙酯和亞硝基胍誘變A succinogenes F3_21， 得到1056個單菌落；這些單菌經過“96孔板培養-HPLC濃縮檢測-厭氧瓶復篩”獲得 11株琥珀酸產量高于出發菌株的突變株(III -9-H、IV -7-A、IV _7_C、V -12_B、VI -10-C、 W -11-H、VDI -10-H、IX -2-C、X -8-E、XI -8-B 和ΧΠ _7_B)，其平均搖瓶產琥珀酸較 F3-21 提高了 13. 9%。以該11株突變菌株為出發菌庫。實施例2
以11株誘變高產菌株作為改組出發菌庫進行第一輪融合，11株菌酶解條件采用酶濃度為0. 25 mg/mL，酶解時間為60 min，采用紫外和熱致死雙滅活，PEG融合后涂布選擇性再生雙層平板，平板上共長出360多個單菌落，然后將這些單菌落挑入96孔板內進行通量篩選。第一輪基因組改組，得到4株F1代高產改組菌(F1- I -3-F, F1- II -7-B, F1-III -2-E 和F1- IV -9-D)，其平均搖瓶產琥珀酸較F3-21提高了 20. 2%，以F1代改組菌為母本進行第二輪改組，篩選得到了 4株F2代高產改組菌(F2- I -5-B、F2- II -5-H、F2- III -6-D和 F2- III -10-F)，其平均搖瓶產琥珀酸較F3-21提高了 32. 9% ；再以F2代改組菌為母本進行第三輪改組，結果篩選得到3株F3代高產改組菌(F3- I -9-C、F3- II _3_F、F3- II -10-D)，平均搖瓶產琥珀酸較F3-21提高了 45. 7%，其中F3- II _3_F(定名為F3-I)，搖瓶產琥珀酸達到 38. 9 g/L,比 F3-21 提高了 47. 6%。實施例3
將F3-I種子液，按10%接種量接入裝有3. 5L發酵液的5L發酵罐中，于37°C，攪拌轉速200 r/min下厭氧發酵，發酵過程通過補充葡萄糖漿維持糖濃度10-30 g/L，并用堿性鹽控制PH，維持5. 8-6. 4之間。其中，種子培養基(每L):葡萄糖5 g，酵母膏5 g，Κ2ΗΡ04·3Η20 1.0 g，NaH2PO4CH2O 1.0 g，pH 7.0。37°C厭氧培養16小時。發酵培養基(每L)甜高粱榨汁糖漿(總還原糖》0-80 g，酵母膏 0-15 g，玉米漿 20 g, MgCl2 0.2 g, Na2HPO4* 12 H2O 1.5 g, NaH2PO4 · 2 H2O 1. 5 g, pH 6. 5。37°C厭氧培養 48 小時。發酵曲線如圖1。48 h產琥珀酸95. 6 g/L。實施例4
測定改組菌F3-a(和出發菌F3-21的代謝途徑中關鍵酶的活性，結果如表1。表1. F3-ZK與F3-21代謝途徑中關鍵酶的酶活比較結果
權利要求
1.一株高產琥珀酸的琥珀酸放線桿菌(Jciiz7OAaciWw1S succinogenes) F3-ZK，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC NO :M2012036。
2.權利要求1所述CCTCCNO :M2012036菌株的應用，其特征在于該菌在5-15L發酵罐中，補料分批發酵36-48 h產琥珀酸70-95. 6 g/L，生產強度1. 70-1. 99 g/(L*h)，糖酸轉化率 0. 70-0. 83 g/g。
全文摘要
本發明公開了一株高產琥珀酸的琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)F3-ZK，以及其篩選和應用于發酵法生產琥珀酸的方法。該菌株是以CGMCC1593為出發菌株，經多輪原生質體遞進融合，并通過“96孔板培養-HPLC濃縮檢測-厭氧瓶復篩”的方法獲得。該菌株已于2012年2月26日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCCNOM2012036。該菌在5-15L發酵罐中，采用補料分批發酵，48h產琥珀酸95.6g/L，生產強度1.99g/(L·h)，糖酸轉化率0.71g/g。與國內外其它菌株比具有高產、降低生產成本的優勢。
文檔編號C12R1/01GK102533622SQ201210056568
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月6日 優先權日2012年3月6日
發明者張坤坤, 鄭璞 申請人:江南大學