專利名稱：新城疫病毒和鴨瘟病毒二重pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及新城疫病毒和鴨瘟病毒二重PCR檢測試劑盒。
背景技術：
新城疫(NewcastleDiseases,簡稱 ND)和鴨痕(Duck Plague,簡稱 DP)均常見于鴨、鵝等雁行目禽類的急性、敗血性和高度接觸性傳染病，這兩種疾病流行廣泛，傳播迅速，發病率和死亡率高，均是目前對世界范圍水禽危害最為嚴重的疫病之一。給水禽業帶來巨大的經濟損失。這兩種疾病呈急性敗血癥過程中都侵害神經系統，同時出現呼吸道癥狀，排綠色糞便，其臨床表現、病理變化、流行病學等方面都十分相似，這兩種疾病發生時，很容易混淆。目前對NDV和DPV的鑒別診斷主要依靠傳統的病原分離鑒定與血清學試驗，但這些方法存在診斷時間長，特異性差，敏感性低，而且操作繁瑣等的缺點，不利于快速診斷這兩種疾病。PCR檢測方法由于具有敏感性高、特異性好、快速、簡便等特點，已被廣泛應用于各種禽病病原體的檢測。二重PCR是ー種特殊的PCR形式，其突出特點是，一次PCR反應，能同時檢測并鑒別出兩種病原體，在臨床上具有很高的應用價值。

發明內容
本發明的ー個目的是提供一種檢測新城疫病毒和鴨瘟病毒的引物組。本發明提供的引物組，由引物1、引物2、引物3和引物4組成；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。上述引物組中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為(0.1-0. 2) (0. 1-0. 2) (1. 5-2) 1. 87 ；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比具體為0. 13 0. 13 1. 87 1. 87。本發明的另ー個目的是提供一種檢測新城疫病毒和鴨瘟病毒的PCR試劑。本發明提供的PCR試劑，由上述的引物組、PCR緩沖液和水組成；所述引物組中的引物I在所述PCR試劑中的終濃度具體為0. 1-0. 2umol/L ；所述引物組中的引物2在所述PCR試劑中的終濃度具體為0. 1-0. 2 u mo I/L ；所述引物組中的引物3在所述PCR試劑中的終濃度具體為1. 5-2 u mo I/L ；所述引物組中的引物4在所述PCR試劑中的終濃度具體為1. 5_2iimol/L。所述引物組中的引物I在所述PCR試劑中的終濃度進ー步具體為0. 13umol/L ；所述引物組中的引物2在所述PCR試劑中的終濃度進ー步具體為0. 13umol/L ；所述引物組中的引物3在所述PCR試劑中的終濃度進ー步具體為1. 87umol/L ；所述引物組中的引物4在所述PCR試劑中的終濃度進ー步具體為1.87iimol/L。
上述PCR緩沖液購自天根，產品目錄號為KT201。本發明的第三個目的是提供一種檢測新城疫病毒和鴨瘟病毒的PCR試劑盒。本發明提供的PCR試劑盒，包括上述的引物組或上述PCR試劑。上述的引物組或上述PCR試劑或上述試劑盒在制備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有新城疫病毒和/或鴨瘟病毒產品中的應用也是本發明保護的范圍；或上述的引物組或上述PCR試劑或上述試劑盒在檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有新城疫病毒和鴨瘟病毒中的應用。上述應用為用上述的引物組或上述PCR試劑或上述試劑盒對所述待測樣品進行二重PCR擴增。上述應用中，所述二重PCR擴增的退火溫度為50°C -55°C，所述二重PCR擴增的退火溫度具體為55で。上述二重PCR擴增的模板為待測樣本的cDNA或DNA。本發明的第四個目的是提供一種檢測新城疫病毒的引物對A。本發明提供的引物對A，由上述的引物組中的所述引物I和所述引物2組成。本發明的第五個目的是提供ー種檢測鴨瘟病毒的引物對B。本發明提供的引物對B，由上述的引物組中的所述引物3和所述引物4組成。含有上述引物對 A的PCR試劑A或試劑盒A是本發明保護的范圍；含有上述引物對B的PCR試劑B或試劑盒B也是本發明保護的范圍。上述的引物對A或上述的PCR試劑A或試劑盒A在制備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有新城疫病毒產品中的應用是本發明保護的范圍。上述的引物對B或上述的PCR試劑B或試劑盒B在制備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有鴨瘟病毒產品中的應用是本發明保護的范圍。本發明的實驗證明，本發明的二重PCR僅需要一次PCR反應，能同時檢測并鑒別出新城疫病毒與鴨瘟病毒，與依靠單次檢測單種病毒、依靠傳統的病原分離鑒定和血清學試驗相比，二重PCR具有特異性好、敏感性高、快速、簡便等特點，在臨床上具有很高的應用價值。


圖1為二重PCR特異性試驗結果圖2為二重PCR敏感性試驗結果圖3為臨床樣品檢測的部分結果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。 實施例1、引物的設計針對新城疫(Newcastle Diseases,簡稱ND)病毒和鴨痕(Duck Plague,簡稱DP)病毒的保守基因(ND保守基因是F基因genbank號JN872152.1的第1676-2094位核苷酸，DP保守基因是EU08288. 2的第55471-56072位核苷酸)，結合DNAstar、Primer5及NCB1-blast生物學軟件的綜合分析結果,設計兩對特異性引物，引物由上海Invitrogen公司合成，引物序列參數如表1:表I為NDV、DPV引物的核苷酸序列
引物名稱_引物序列(5’ -3’ )_
NDV-FTGC AAC CGC TGC ACA GAT AAC (序列 I)NDV-PTCA GGC CGC TAC CM TTA ATG AG (序列 2)
DPV-FTGA GGC TGG TAT GCG TGA CAT A (序列 3)
畫DPV-PHG GTT TCT GAG TTG GCA GAG G (序列 4)實施例2、引物在二重PCR檢測中的特異性和敏感性試驗1、二重PCR特異性試驗新城疫病毒NDV-F48E9購自中國獸醫藥品監瞀所；新城疫病毒NDV-Lasota購自中國獸醫藥品監瞀所；新城疫病毒C3tl株購自中國獸醫藥品監瞀所；鴨瘟地方分離株I (為鴨瘟病毒，以下簡稱DPV)記載在“用聚合酶鏈反應檢測鴨瘟病毒的研究”，中國獸藥雜志2000，34(4) : 10 12，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得;小鴨肝炎病毒記載在“用聚合酶鏈反應檢測鴨瘟病毒的研究”，中國獸藥雜志，2000，34(4) 10 12，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；番鴨細小病毒記載在“用聚合酶鏈反應檢測鴨瘟病毒的研究”，中國獸藥雜志2000，34(4) 10 12，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；小鵝瘟病毒記載在“用聚合酶鏈反應檢測鴨瘟病毒的研究”，中國獸藥雜志2000，34(4) 10 12，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；禽呼腸孤病毒記載在“應用多重反轉錄_聚合酶鏈反應檢測雞新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒的研究”，中國預防獸醫學報，2000, 22⑵126-129，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；H6亞型禽流感病毒記載在“H6亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測方法的建立”，“微生物學通報”DEC 20，2011，38 (12) : 1855-1861，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；鴨疫巴氏桿菌記載在“應用多重反轉錄_聚合酶鏈反應檢測雞新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒的研究”，中國預防獸醫學報，2000, 22⑵126-129，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得； 將新城疫病毒NDV-F48E9、NDV-Lasota、NDV-C3(l株、鴨瘟病毒地方分離株I (以下簡稱DPV)、小鴨肝炎病毒、番鴨細小病毒、小鵝瘟病毒、鴨圓環病毒、禽呼腸孤病毒、H6亞型禽流感病毒、鴨疫巴氏桿菌分別接種正常健康的鴨，分別得到感染新城疫病毒NDV-F48E9鴨、感染NDV-Lasota鴨、感染NDV-C3tl株鴨、感染DPV鴨、感染小鴨肝炎病毒鴨、感染番鴨細小病毒鴨、感染小鵝瘟病毒鴨、感染鴨圓環病毒鴨、感染禽呼腸孤病毒鴨、感染H6亞型禽流感病毒鴨、感染鴨疫巴氏桿菌鴨。I) cDNA模板制備
取感染新城疫病毒NDV-F48E9鴨、感染NDV-Lasota鴨、感染NDV-C3tl株鴨、感染小鴨肝炎病毒鴨、感染禽呼腸孤病毒鴨、感染H6亞型禽流感病毒鴨的咽喉、泄殖腔棉拭子浸泡于500 L生理鹽水中，然后將棉拭子充分捻動，在試管壁上擠壓干凈后，以6000r/min離心15min，取上清250iiL，加入480iiL TRIzol LS reagent，輕輕混勻后室溫靜置lOmin，加A 200 u L氯仿，輕微振蕩混勻，室溫靜置5mim，12000rpm離心lOmin，取上清約500 u L，加入500 ii L異丙醇，混勻后-20°C靜置10min，12000rpm離心lOmin，棄上清，加入75%こ醇1000 u L，混勻，12000rpm離心lOmin，棄上清，干燥后加入35ul DEPC-H2O,分別得到RNA。再向RNA中加入1.5 ii L自由引物(購自TaKaRa公司，D3802)，置于70°C水浴中lOmin，然后取出置冰上5min，再加入如下試劑5XRT Buffer(購自TaKaRa公司，D2620)，IOu L, 10mmol/L dNTP 2 u L, 5U/ u L AMV1. Ou L, Ribonuclease Inhibitor(購自 TaKaRa公司，D2313A)40U/ii L 0. 5 u L ;混勻后42°C水浴90min，分別獲得的新城疫病毒NDV-F48E9cDNA、NDV-Lasota cDNA、NDV-C30株cDNA、小鴨肝炎病毒cDNA、禽呼腸孤病毒cDNA、H6亞型禽流感病毒cDNA。2) DNA模板制備分別均勻剪取感染DPV鴨、感染番鴨細小病毒鴨、感染小鵝瘟病毒鴨、感染鴨圓環病毒鴨和感染鴨疫巴氏桿菌鴨的肝臟(也可以是脾臟、肺臟等組織)與雙抗生理鹽水以體積比1: 5的比例研磨制成病料懸料,分裝1. 5ml EP管，12000rpm離心lOmin,取250 ii L上清移至另一新1.5ml EP管，按照抽提DNA試劑盒(購自天根，產品目錄號DP304-02)的說明書進行提取，分別得到DPV DNA、番鴨細小病毒DNA、小鵝瘟病毒DNA、鴨圓環病毒DNA、鴨疫巴氏桿菌DNA。3) 二重 PCR 擴增分別取2ul上述得到的cDNA或DNA作為模板進行二重PCR擴增，反應體系總體積^25uL,2XTaq PCR Master Mix (購自天根 KT201) 12. 5 ii L，2 ii L 模板，加入終濃度分別為 0. 13 ii mol/L 的 NDV-F、NDV-P 各 0. 33 y L,各加入終濃度分別為1. 87 u mol/L 的 DPV-F,DPV-P各0. 86 iiし最后用雙蒸水補至25 uし上述模板具體分別為NDV-F48E9 cDNA、NDV-Lasota cDNA、NDV-C3tl 株 cDNA、DPVDNA、NDV-F48E9 cDNA+DPV DNA (混合的體積比為1: 9)、NDV-Lasota cDNA+DPV DNA (混合的體積比為1: 9)、NDV-C3tl株cDNA+DPV DNA、小鴨肝炎病毒cDNA、番鴨細小病毒DNA、小鵝瘟病毒DNA、鴨圓環病毒DNA、禽呼腸孤病毒cDNA、H6亞型禽流感病毒cDNA、鴨疫巴氏桿菌DNA。PCR 反應程序為94 0C 5min ；94 °C 40s, 50 °C lmin，72 °C 40s, 30 個循環；72°C IOmin。結果如圖1 所示，M :1OObp DNA Ladder ；1 :NDV_F48E9 ；2 =NDV-Lasota ；3 =NDV-C30株；4 DPV ；5 NDV-F48E9+DPV ；6 NDV-Lasota+DPV ；7 :NDV-C3tl株+DPV ；8 :小鴨肝炎病毒；9 番鴨細小病毒；10 :小鵝瘟；11 :鴨圓環病毒；12 :禽呼腸孤病毒；13 H6亞型禽流感病毒；14 :鴨疫巴氏桿菌， 可以看出，1-3得到419bp的片段，4得到602bp的片段;5_7得到419bp和602bp的片段；8-13沒有這兩種大小的片段。從上述結果可以看出，該引物及方法可以見到出新城疫病毒和鴨瘟病毒，且對新城疫病毒和鴨瘟病毒特異性高。
因此，上述引物和方法可應用于鑒定未知樣本是否感染新城疫病毒(NDV，)和鴨瘟病毒(DPV):若得到419bp的片段，則樣本中含有NDV，反之則沒有；若得到602bp的片段，則樣本中含有DPV，反之則沒有；若得到419bp和602bp的片段，則樣本中含有NDV和DPV，反之則沒有。2、二重PCR敏感性試驗用DU 800紫外分光光度計測得新城疫病毒cDNA濃度和鴨瘟病毒DNA濃度分別為20ng/ul，70ng/ul，然后連續10倍稀釋至cDNA為0. 4fg/ul，DNA為126fg/ul，將不同稀釋倍數的混合物作為模板，模板具體如下4ng/ul NDV-C3tl 株 cDNA 和 126ng/ul DPV (體積比為 I 9) DNA ；0. 4ng/ul NDV-C30 株 cDNA 和 12. 6ng/ul DPV (體積比為 I 9) DNA ；4pg/ul NDV-C3tl 株 cDNA 和 1260pg/ul DPV (體積比為 I 9) DNA ；0. 4pg/ul NDV-C30 株 cDNA 和 126pg/ul DPV (體積比為 I 9) DNA ；0. 04pg/ul NDV-C30 株 cDNA 和 12. 6pg/ul DPV (體積比為 I 9) DNA ；4fg/ul NDV-C3tl 株 cDNA 和 1260fg/ul DPV (體積比為 I 9) DNA ；0. 4fg/ul NDV-C30 株 cDNA 和 126fg/ul DPV (體積比為 I 9) DNA ；按照上述I的3)方法進行二重PCR。結果如圖2 所示，其中，M 為 IOObp DNA Ladder ；1 為 4ng/ul NDV-C30 株 cDNA 和126ng/ul DPV(體積比為 I 9)DNA ;2 為 0. 4ng/ul NDV-C3tl 株 cDNA 和 12. 6ng/ul DPV(體積比為 I 9)DNA ;3 為 4pg/ul NDV-C3tl 株 cDNA 和 1260pg/ul DPV (體積比為 I 9) DNA ；4為 0. 4pg/ul NDV-C30 株 cDNA 和 126pg/ul DPV (體積比為 I 9) DNA ；5 為 0. 04pg/ulNDV_C30株 cDNA 和 12. 6pg/ul DPV (體積比為 I 9) DNA ；6 為 4fg/ul NDV-C30 株 cDNA 和 1260fg/ul DPV (體積比為 I 9)DNA ;7 為 0. 4fg/ul NDV-C3。株 cDNA 和 126fg/ul DPV (體積比為
I 9)DNA ;8為陰性對照(H20，2ul);可以看出，1_4均得到419bp和602bp的片段，說明新城疫病毒NDV-C3tl cDNA最小檢出0. 4pg，鴨瘟病毒DPV的DNA最小檢出126pg。結果表明該技術敏感性高。實施例3、臨床樣品二重PCR檢測對采集的7份(編號為1-7)鴨病料，1-3采肝、4-5采脾臟、6_7采肺臟，將其磨成懸液再進行病毒分離鑒定，分別提取鴨病料DNA和RNA，并將RNA反轉錄得到cDNA，將各個樣本的DNA和cDNA混合(體積比為1:1),得到編號為1-7的混合樣本。分別將上述編號為1-7的混合樣本作為模板，按照實施例2的I的3)方法進行ニ重PCR檢測。若得到419bp的片段，則樣本中含有NDV，反之則沒有；若得到602bp的片段，則樣本中含有DPV，反之則沒有；若得到419bp和602bp的片段，則樣本中含有NDV和DPV，反之則沒有。結果如圖3所示，M為IOObp DNA Ladder ；1為陽性對照(NDV_C3Q+DPV) ;2_8分別對應樣本1-7 ;可以看出，樣本1-7僅得到419bp的片段，說明樣本1-7均僅含有NDV。將編號為1-7的鴨病料經過處理后接雞胚，從中收獲尿囊液，用血凝試驗檢測，結果7份病料含有的病毒均能凝集雞紅細胞，說明7份病料沒有DPV病毒；再將編號為1-7份病料的cDNA作為模板，用NDV病毒的特異引物XZ9 :5’GGA GGA TGT TGG CAGCAT-3’ ；XZlO :5’ GAC AAC ATA TAC ACC TCA TC-3’ ；擴增片段為 310bp，說明 1-7 感染 NDV(見于文章“2000-2004年間廣西新城疫病毒強毒株的分離與鑒定”)。為了進ー步證明，編號為1-7的鴨病料的確沒有DPV病毒，將編號為1-7樣本的DNA 作為模板用 DPV 病毒的特異引物 XZ43 :5，_GCA AGC TTG GCT GGT ATG CGT GAC AT-3，;XZ44 :5’ -TTC TGC AGG TAT TGG TTT CTG AGT TGG C-3’，(見于文章用聚合酶鏈反應檢測鴨瘟病毒的研究”，中國獸藥雜志，2000，34 (4) :10 12)引物進行擴增，沒有得到602bp的片段，說明1-7不感染DPV。 結果與本發明的方法一致，說明本發明的引物和方法正確。
序列表
<110〉廣西壯族自治區獸醫研究所
<120〉新城疫病毒和鴨瘟病毒二重PCR檢測試劑盒
く 160〉4
<210〉 I
<211〉 21
<212〉 DNA
く 213〉人丄序列
<220〉
<223〉
<400〉 I
tgcaaccgct gcacagataa c21
<210〉2
く211〉23
<212〉DNA<213〉人工序列<220〉
<223>
<400〉 2
tcaggccgct accaattaat gag23`<210〉3
<211〉22
<212>DNA<213〉人工序列<220〉
く 223〉
<400〉 3
tgaggctggt atgcgtgaca ta22
く210〉 4〈211〉 22く212〉 DNA〈213〉人工序列〈220〉
く 223〉
く400〉 4
ttggtttctg agttggcaga gg2權利要求
1.檢測新城疫病毒和鴨瘟病毒的引物組，由引物1、引物2、引物3和引物4組成； 所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。
2.根據權利要求1所述的引物組，其特征在于 所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為(0.1-0.2) (0.1-0. 2)(1.5-2) 1.87 ； 所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比具體為0.13 0.13 1.87 1.87。
3.檢測新城疫病毒和鴨瘟病毒的PCR試劑，由權利要求1或2所述的引物組、PCR緩沖液和水組成； 所述引物組中的引物I在所述PCR試劑中的終濃度具體為0.1-0.2 μ mol/L ； 所述引物組中的引物2在所述PCR試劑中的終濃度具體為0.1-0.2 μ mol/L ； 所述引物組中的引物3在所述PCR試劑中的終濃度具體為1.5-2 μ mol/L ； 所述引物組中的引物4在所述PCR試劑中的終濃度具體為1.5-2 μ mol/L ； 所述引物組中的引物I在所述PCR試劑中的終濃度進一步具體為0.13ymol/L ； 所述引物組中的引物2在所述PCR試劑中的終濃度進一步具體為0.13μmol/L ； 所述引物組中的引物3在所述PCR試劑中的終濃度進一步具體為1.87 μ mol/L ； 所述引物組中的引物4在所述PCR試劑中的終濃度進一步具體為1.87 μ mol/L。
4.檢測新城疫病毒和鴨瘟病毒的PCR試劑盒，包括權利要求1或2所述的引物組或權利要求3所述PCR試劑。
5.權利要求1或2所述的引物組或權利要求3所述PCR試劑或權利要求4所述試劑盒在制備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有新城疫病毒和鴨瘟病毒產品中的應用。
6.根據權利要求5所述應用，其特征在于所述應用為用權利要求1或2所述的引物組或權利要求3所述PCR試劑或權利要求4所述試劑盒對所述待測樣品進行二重PCR擴增。
7.根據權利要求5或6所述應用，其特征在于 所述二重PCR擴增的退火溫度為50°C-55°C，所述二重PCR擴增的退火溫度具體為55℃。
8.—種檢測新城疫病毒的引物對A，由權利要求1或2所述的引物組中的所述引物I和所述引物2組成； 或一種檢測鴨瘟病毒的引物對B，由權利要求1或2所述的引物組中的所述引物3和所述引物4組成。
9.權利要求8所述的引物對A在制備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有新城疫病毒產品中的應用； 或權利要求8所述的引物對B在制備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有鴨瘟病毒產品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種新城疫病毒和鴨瘟病毒二重PCR檢測試劑盒。本發明提供的引物組，由引物1、引物2、引物3和引物4組成；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本發明的實驗證明，一次PCR反應，能同時檢測并鑒別出新城疫病毒與鴨瘟病毒，與依靠傳統的病原分離鑒定與血清學試驗相比，二重PCR具有特異性好、敏感性高、快速、簡便等特點，在臨床上具有很高的應用價值。
文檔編號C12N15/11GK103031385SQ20121005638
公開日2013年4月10日 申請日期2012年3月6日 優先權日2012年3月6日
發明者謝芝勛, 陳安莉, 謝麗基, 劉加波, 謝志勤, 龐耀珊, 鄧顯文, 范晴 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所