專利名稱：表達系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及適用于重組多肽的微生物表達的表達系統。
背景技術：
從美國專利US6537779知道了基于T7的以完全回文操縱基因序列為基礎的蛋白質表達系統。基于T7的系統存在缺點，因為T7系統的操作需要噬菌體聚合酶，它通常是通過將表達所需噬菌體聚合酶的XDE3原噬菌體插入到大腸桿菌宿主株中產生溶原宿主株而提供的。也可通過用特異性λ轉導噬菌體進行侵染而將噬菌體聚合酶傳遞到細胞中，該 特異性λ轉導噬菌體攜帶了噬菌體聚合酶(例如T7RNA聚合酶)的基因。XDE3原噬菌體缺少了用于切除原噬菌體以形成裂解噬菌體顆粒所需的遺傳元件。然而，已經證明XDE3溶原宿主株釋放了噬菌體顆粒從而引起了發酵裝置中不合需要的侵染。實際上，某些發酵裝置操縱基因是不允許使用XDE3菌株的。不希望在誘導之前就表達異源蛋白質，因為ー些異源蛋白質對宿主細胞生長和質粒穩定性具有有害影響，這就降低了總產量。為避免這一點，基于Τ7的表達系統通常在兩種水平上控制異源蛋白質表達。首先，驅動從Τ7啟動子的表達需要誘導T7RNA聚合酶基因的表達以產生T7RNA聚合酶。第二，Τ7啟動子本身也需要被誘導。這就增加了操作基于Τ7的表達系統的復雜性。有著大量的具有不同控制和誘導模式的異源蛋白質表達系統，這使得對感興趣的蛋白質進行表達系統/發酵過程的選擇和優化很大程度上成為了完全根據經驗的過程。這是費時間的以及不合需要的。因此，就需要這樣的系統，它們能夠提供改善的表達控制和改善的蛋白質表達水平，它們不使用噬菌體聚合酶和溶原宿主株。也需要這樣的系統，它們能夠提供原核細胞以及真核細胞諸如哺乳動物和酵母細胞中的可誘導異源表達。

發明內容
根據本發明，提供了基于完全回文操縱基因序列的蛋白質表達系統，包括a)啟動子；以及b)完全回文操縱基因序列；特征在于啟動子不是T7。本發明的表達系統中可采用的啟動子通常是基于宿主RNA聚合酶的啟動子系統，優選基于大腸桿菌RNA聚合酶的啟動子系統。可采用的啟動子的例子包括T7A1、T7A2、T7A3、λ pL、λ pR、lac、lacUV5、trp、tac、trc、phoA 和 rrnB。在根據本發明的表達系統中可采用的操縱基因序列包括lac、gal、deo和gin。可采用ー種或多種完全回文操縱基因序列。在許多優選的實施方案中，采用了兩種完全回文操縱基因序列，最有利的是ー種操縱基因序列位于啟動子的下游，并且一種操縱基因序列位于啟動子的上游。當采用兩種操縱基因系統時，操縱基因序列優選被間隔開，從而最大程度控制啟動子。在許多實施方案中，間隔85到150個堿基對，優選間隔90到126個堿基對，最優選間隔91或92個堿基對。在某些實施方案中，操縱基因序列與轉錄起始點重疊。將考慮到的是，操縱基因系統通常會采用合適的阻抑物序列。阻抑物序列產生阻抑蛋白，例如當使用Iac操縱基因時的IacI基因序列。也可使用其它Iac阻抑物序列，例如IacIe序列可用來増加Iac阻抑蛋白的水平。也可由宿主細胞基因組提供阻抑物序列或者通過使用另外的相容性質粒來提供。可將表達系統整合到宿主細胞基因組中，但是優選將其包含在染色體外元件諸如質粒之中。備選地，可將表達系統摻入到噬菌體或病毒載體中，使用這些載體將表達系統傳遞到宿主細胞系統中。可通過現有技術中的已知方法裝配質粒或表達載體。典型地，質粒也包括如下之一或更多選擇標記，例如賦予抗生素抗性的序列，cer穩定性序列和表達盒。如果需要所期望的蛋白質分泌，表達系統也可摻入信號序列。 表達的誘導可通過加入誘導物諸如異丙基-β -D-I-硫代半乳糖苷(IPTG)，IPTG類似物諸如異丁基-C-吡喃半乳糖苷(IBCG)，乳糖或者蜜ニ糖。可以使用其它誘導物，在其它地方更充分地描述了所述其它誘導物(例如參見《操縱基因》(The Operon)，Miller和Renznikoff編輯(1978))。誘導物可単獨使用或者組合使用。合適質粒或表達載體的構建對于普通技術的科學家來說將是顯而易見的。可采用本發明的表達系統在宿主細胞特別是微生物中表達蛋白。如本文使用的，“蛋白質”一般是指具有超過大約10個氨基酸的肽或蛋白質。宿主細胞可以是原核的或真核的。原核細胞的例子包括細菌細胞，例如革蘭氏陰性細菌細胞，包括大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、粘質沙雷氏菌、銅綠假單胞菌以及革蘭氏陽性細菌，包括枯草芽孢桿菌。真核細胞的例子包括酵母，諸如巴斯德畢赤酵母、啤酒糖酵母、多形漢遜酵母、乳克魯維酵母、粟酒裂殖酵母。可采用的哺乳動物宿主細胞包括人類細胞系，諸如人胚腎和PERC. 6細胞；鼠細胞系，諸如NSO細胞；以及特別是倉鼠細胞系，諸如幼倉鼠腎細胞和特別是中國倉鼠卵巢細胞。也可以采用其它真核宿主細胞，諸如絲狀真菌、植物、昆蟲、兩棲動物細胞或卵巢物質。優選的宿主細胞是細菌，特別是腸細菌科，優選大腸桿菌，特別是其B或K12株。本發明的表達載體通常采用質粒形式，包括啟動子和完全回文操縱基因序列的質粒形成了本發明的另一方面，其中啟動子不是17。質粒可以是自主復制質粒或者整合型質粒。對于通過培養重組細胞生產蛋白質特別是重組蛋白質來說，采用本發明的表達系統是有利的。對于蛋白質的表達來說，將考慮到的是將啟動子和操縱基因序列可操作地連接到編碼待表達蛋白質的DNA上。
因此，本發明也提供了生產蛋白質的方法，其包括使表達系統表達，該表達系統包括a)啟動子；b)完全回文操縱基因序列；以及c)蛋白質的表達盒；其特征在于啟動子不是T7。
如果需要的話，也可以存在一種或多種啟動子、操縱基因序列和表達盒，它們可以是相同的或不同的。通過現有技術中公知的用于所采用細胞的方法來使表達系統表達。優選的表達方法包括在生長培養基中培養重組細胞，特別是通過發酵，然后回收所表達的蛋白質。術語“生長培養基”是指用于生長重組細胞的營養培養基。在許多實施方案中，采用營養液。用于特定重組細胞的合適的生長培養基是現有技術中公知的。



圖I顯示蛋白Dl. 3的基因序列。圖2顯示實施例7的hTNF α蛋白積累結果。㈩=基礎表達，未入誘導物(IPTG)；(**)=% TCP，％細胞總蛋白質。圖3顯示實施例9的菌株CLD038的蛋白質印跡分析。箭頭指示hTNF α帶。泳道6 CLD038 2小時溫育(誘導前)泳道5 CLD038 4小時溫育(誘導前)泳道4 CLD038 =IPTG誘導后I小時泳道3 CLD038 =IPTG誘導后2小時泳道2 CLD038 =IPTG誘導后3小時泳道I :CLD038 =IPTG誘導后4小時泳道7 :分子量標準參照物圖4顯示實施例11的菌株CLD030的hTNF α生產率分布圖。圖5顯示實施例15使用的Dl. 3-Α5Β7雙特異性單鏈四價雙抗體(bsctDb)基因序列(SEQID NO 22)。圖6顯示實施例16使用的谷胱甘肽-S-轉移酶-3C蛋白酶融合基因序列(SEQ IDNO 23)。圖7顯示實施例16使用的人干擾素α 2 (IFN α 2)基因序列(SEQ IDNO 24)。圖8顯示實施例16使用的人促紅細胞生成素(EPO)基因序列(SEQID NO 25)。圖9顯示實施例17使用的L-2-鹵代鏈烷酸脫鹵素酶(hadL)基因序列(SEQ IDNO 26)。圖10顯示實施例17的L-2-鹵代鏈烷酸脫鹵素酶蛋白質的表達和累積。箭頭指示HadL蛋白質的位置。泳道I :分子量標準參照物泳道2 :瓶1-CLD075誘導前泳道3 :瓶2-CLC075誘導前泳道4 :瓶1-CLD075，6小時培養物，O. 5mM IPTG誘導后3小時泳道5 :瓶2-CLD075，6小時培養物，未誘導泳道6 :瓶1-CLD075，23小時培養物，O. 5mM IPTG誘導后20小時泳道7 :瓶2-CLD075, 23小時培養物，未誘導泳道8:分子量標志物
圖11顯示實施例18的誘導后，L-2-鹵代鏈烷酸脫鹵素酶蛋白質的表達/累積。圖12顯示實施例21使用的HCMV啟動子和雙重的完全回文Iac操縱基因的DNA序列(SEQ ID NO 33)。圖13顯示實施例21使用的IgG Fe序列(SEQ ID NO 34)。圖14顯示實施例21的IgG Fe蛋白累積水平。對于誘導的和未誘導的兩者都是η = 4。提供的數據為帶有代表I個標準差的誤差棒的平均值。圖15顯示實施例20使用的克隆序列I的序列(SEQ ID NO 35)。圖16顯示實施例20使用的克隆序列2的序列(SEQ ID NO 36)。圖17顯示實施例9的hTNF α的累積水平。 泳道I :CLD077誘導后20小時泳道2 CLD077誘導后3小時泳道3 CLD077誘導前泳道4:分子量標志物圖18顯示載體pAVE013的質粒圖。
具體實施例方式通過下面的實施例但并不限制地說明本發明。I. pAVE系列載體的產牛載體pAVEO 11、pAVEO 12 和 pAVEO 13產生pAVEO 11的起始載體是pZT7#2. 0，根據US 6537779的描述進行制備。ρΖΤ7#2.0具有ρΑΤ153載體骨架、cer穩定性序列、tet A/R、感興趣基因上游的單一天然Iac操縱基因序列以及上游T4轉錄終止子。使用合成的寡核苷酸接頭通過Nco UEcoR I和Xba I限制酶位點將T7A3啟動子和雙完全回文Iac操縱基因克隆到該質粒中。通過退火寡核苷酸I和2. I，制備接頭12.1:寡核苷酸I (SEQ ID NO I)5' CATGTGGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCAAGAACAATCCTGCACG寡核苷酸2. KSEQ ID NO 2)5' AATTCGTGCAGGATTGTTCTTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCA然后將接頭作為Nco 1/EcoR I片段連接到質粒pZT7#2. O中，轉化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通過使用Nco I限制酶切消化初步篩選轉化體。通過測序確認序列。將所得質粒命名為PAVE012。然后通過退火寡核苷酸3和4，將Τ7Α3啟動子盒克隆到pAVE012中寡核苷酸3 (SEQ ID NO 3)5' AATTCAAACAAAACGGTTGACAACATGAAGTAAACACGGTACGATGTACCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸4 (SEQ ID NO 4)5' CTGGTGGGGGGTTGTGGGCGCTCGCGGTTCCGGTGCGTCGTGCCGTGTTTGCTTCGTGTTGTCGGCCGTTTTGTTTG將退火的寡核苷酸作為Xba 1/EcoR I片段連接到質粒pAVE012中，轉化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通過質粒DNA的限制酶切消化進行初步篩選。然后通過測序確認序列。將所得質粒命名為PAVEO11。將人TNFa基因作為Nde I/Xho I片段克隆到該質粒中以產生pAVE013。PAVE013的質粒圖譜示于圖18中。這顯示了操縱基因和啟動子以及構建中使用的限制酶位點的排列。兩個操縱基因都是完全回文Iac操縱基因。RBS是核糖體識別位點。載體包括pAT153載體骨架、cer穩定性序列、誘導型四環素抗性基因(tet A/R)以及上游T4轉錄終止子。載體pAVEO38 和 pAVE041產生pAVE038的起始載體是pZT7#2. 0，根據US 6537779的描述進行制備。使用合成的寡核苷酸接頭通過EcoR I和Xba I限制酶位點將tac啟動子和單ー天然Iac操縱基因克隆到該質粒中。通過退火寡核苷酸11和12，制備接頭1112 :
寡核苷酸11 (SEQ ID NO 5)5' A ATTTTCTGA A ATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGGATACTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCA寡核苷酸I2 (SEQ ID NO 6)5 ' CTAGTGGGGAAT TGT TAT CCGCT CACAAT T CCACACAGT AT CCGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAA然后將接頭作為Xba 1/EcoR I片段連接到質粒pZT7#2. O中，轉化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通過使用Nco I限制酶切消化初步篩選轉化體。通過測序確認序列。將所得質粒命名為PAVE038。將人TNF α基因作為Nde I/Xho I片段克隆到該質粒中以產生質粒pAVE041。
載體 pAVE037 和 pAVE040產生pAVE037的起始載體是pZT7#2. 0，根據US 6537779的描述進行制備。使用合成的寡核苷酸接頭通過EcoR I和Xba I限制酶位點將tac啟動子和単一完全回文Iac操縱基因克隆到該質粒中。通過退火寡核苷酸13和14，制備接頭1314 寡核苷酸I3 (SEQ ID NO 7)5 ' AATTT TCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGGAT ACTGTGTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸14 (SEQ ID NO 8)5 ' CTAGTGGGGAAT TGTGAGCGCT CACAAT T CCACACAGT AT CCGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAA然后將接頭作為Xba 1/EcoR I片段連接到質粒pZT7#2. O中，轉化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通過使用Nco I限制酶切消化初步篩選轉化體。通過測序確認序列。將所得質粒命名為PAVE037。將人TNF α基因作為Nde I/Xho I片段克隆到該質粒中以產生pAVE040。載體pAVE028 和 pAVE030產生pAVE028的起始載體是pAVE012。通過退火寡核苷酸5和6，將T7A3啟動子盒克隆到PAVE012中
寡核苷酸5 (SEQ ID N09)5' AATTCGAAACAAAACGGTTGACAACATGAAGTAAACACGGTACGATGTACCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸6 (SEQ ID NO 10)5' CTGGTGGGGGGTTGTGGGCGCTCGCGGTTCCGGTGCGTCGTGCCGT GTTTGCTTCGTGTTGTCGGCCGTTTTGTTTCG將退火的寡核苷酸作為Xba 1/EcoR I片段連接到質粒pAVE012中，轉化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通過限制酶切消化質粒DNA進行初步篩選。然后通過測序確認序列。將所得質粒命名為PAVE028。
將人TNF α基因作為Nde I/Xho I片段克隆到該質粒中以產生pAVE030。載體pAVE007 和 pAVE031產生pAVE007的起始載體是pZT7#2. 0，根據US 6537779的描述進行制備。使用合成的寡核苷酸接頭通過EcoR I和Xba I限制酶位點將Τ7Α3啟動子和単一完全回文Iac操縱基因克隆到該質粒中。含有Τ7Α3啟動子的接頭由寡核苷酸3和4組成。寡核苷酸3 (SEQ ID NO 3)5' AATTCAAACAAAACGGTTGACAACATGAAGTAAACACGGTACGATGTACCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸4 (SEQ ID NO 4)5' CTGGTGGGGGGTTGTGGGCGCTCGCGGTTCCGGTGCGTCGTGCCGTGTTTGCTTCGTGTTGTCGGCCGTTTTGTTTG退火寡核苷酸3和4，然后將形成的接頭作為Xba 1/EcoR I片段連接到質粒pZT7#2. O中，轉化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通過限制酶切消化質粒DNA進行初歩篩選。然后通過測序確認序列。將所得質粒命名為PAVE007。將人TNFa基因作為Nde I/Xho I片段克隆到該質粒中以產生pAVE031。載體pAVE029 和 pAVE027產生pAVE029的起始載體是pZT7#2. 0，根據US 6537779的充分描述進行制備。使用合成的寡核苷酸接頭通過EcoR I和Xba I限制酶位點將λ PL啟動子和単一完全回文Iac操縱基因克隆到該質粒中。通過退火寡核苷酸7和8，制備接頭78 :寡核苷酸7 (SEQ ID NO 11)5' AATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸8 (SEQ ID NO 12)5 ' CTAGTGGGGAAT TGTGAGCGCT CACAAT T CCGCT CAGTAT CACCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGAT然后將接頭作為Xba 1/EcoR I片段連接到質粒pZT7#2. O中，轉化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通過使用Nco I限制酶切消化初步篩選轉化體。通過測序確認序列。將所得質粒命名為PAVE029。
將人TNF α基因作為Nde I/Xho I片段克隆到該質粒中以產生pAVE027。載體pAVE043 和 pAVE044產生pAVE043的起始載體是pAVE012。通過退火寡核苷酸17和18，將tac啟動子盒克隆到PAVE012中寡核苷酸17 (SEQ ID NO 37)5 ' AATTTTCTGAAATGAGCTGTTGACAATT AATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸18 (SEQ ID NO 38)5 ' CTAGTGGGGAAT TGTGAGCGCT CACAAT T CCACACAT T AT ACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAA將退火的寡核苷酸作為Xba 1/EcoR I片段連接到質粒pAVE012中，轉化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通過限制酶切消化質粒DNA進行初步篩選。然后通過測序確認序列。將所得質粒命名為PAVE043。將人TNFa基因作為Nde I/Xho I片段克隆到該質粒中以產生pAVE044。載體pAVE034 和 pAVE035產生pAVE034的起始載體是pAVE012。通過退火寡核苷酸9和10，將ApL啟動子盒克隆到PAVE012中寡核苷酸9 (SEQ ID NO 39)5 ' AAT TCATCT CTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGAT ACTGAGCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸10 (SEQ ID NO 40)5' CTAGTGGGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCGCTCAGTATCACCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGATG將退火的寡核苷酸作為Xba 1/EcoR I片段連接到質粒pAVE012中，轉化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通過限制酶切消化質粒DNA進行初步篩選。然后通過測序確認序列。將所得質粒命名為PAVE034。將人TNF α基因作為Nde I/Xho I片段克隆到該質粒中以產生pAVE035。載體VE020 和 AVE021產生pAVE020的起始載體是pAVE012。通過退火寡核苷酸7和8，將λ pL啟動子盒克隆到PAVE012中寡核苷酸7 (SEQ ID NO 11)5' AATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸8 (SEQ ID NO 12)5 ' CTAGTGGGGAAT TGTGAGCGCT CACAAT T CCGCT CAGTAT CACCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGAT將退火的寡核苷酸作為Xba 1/EcoR I片段連接到質粒pAVE012中，轉化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通過限制酶切消化質粒DNA進行初步篩選。然后通過測序確認序列。將所得質粒命名為PAVE020。
將人TNFa基因作為Nde I/Xho I片段克隆到該質粒中以產生pAVE021。載體pAVE016 和 pAVE017產生pAVE016的起始載體是pAVE012。通過退火寡核苷酸15和16，將tac啟動子盒克隆到PAVE012中寡核苷酸15 (SEQ ID NO 13)5 ' AATTCCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸16 (SEQ ID NO 14)
5 ' CTAGTGGGGAAT TGTGAGCGCT CACAAT T CCACACAT T AT ACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGG將退火的寡核苷酸作為Xba 1/EcoR I片段連接到質粒pAVE012中，轉化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通過限制酶切消化質粒DNA進行初步篩選。然后通過測序確認序列。將所得質粒命名為pAVEO 16。將人TNFa基因作為Nde I/Xho I片段克隆到該質粒中以產生pAVE017。載體pAVE049產生pAVE049的起始載體是pAVE017。不改變tac啟動子盒。為增加兩個操縱基因之間91到124個堿基對的間隔，克隆進了 EcoR I接頭。這是由寡核苷酸19和20組成的。寡核苷酸19(SEQ ID NO 15)5' AATTCACCGGTGTACAGTCATGTACAACCGGTG寡核苷酸20 (SEQ ID NO 16)5' AATTCACCGGTTGTACATGACTGTACACCGGTG通過限制酶切消化質粒DNA進行初歩篩選。然后通過測序確認序列。將所得質粒命名為PAVE049。載體PAVE046產生分泌載體pAVE046的起始載體是pAVE027。將A Dl. 3Fab表達盒(圖1，SEQID NO 17)作為Nde I-BamH I片段進行克隆。通過限制酶切消化質粒DNA進行初步篩選。然后通過測序確認序列。將所得質粒命名為PAVE046。表I :pAVE載體匯總
權利要求
1.蛋白質表達系統，包括a)選自Τ7Α1、Τ7Α2、Τ7Α3、λ pL、λ pR、lacUV5、trp、trc、phoA 和 rrnB 的啟動子；和 b)至少ー種完全回文操縱基因序列 其中所述完全回文操縱基因序列與轉錄起始點重疊。
2.載體,包括a)選自Τ7Α1、Τ7Α2、Τ7Α3、λ pL、λ pR、lacUV5、trp、trc、phoA 和 rrnB 的啟動子；和 b)完全回文操縱基因序列，其中所述完全回文操縱基因序列與轉錄起始點重疊。
3.權利要求2的載體，進ー步包括蛋白質的表達盒。
4.權利要求2或3的載體，其中所述載體是質粒，優選自主復制質粒。
5.由權利要求2-4任一項的載體所轉化的宿主細胞。
6.生產重組蛋白質的方法，其包括使表達系統表達，該表達系統包括a)選自Τ7Α1、Τ7Α2、Τ7Α3、λ pL、λ pR、lacUV5、trp、trc、phoA 和 rrnB 的啟動子; b)完全回文操縱基因序列；和 c)重組蛋白質的表達盒； 其中所述完全回文操縱基因序列與轉錄起始點重疊。
7.權利要求1-6的任一項的表達系統、載體、宿主細胞或方法，其中所述操縱基因系統是 lac、gal、deo 或 gin。
8.權利要求1-7的任一項的表達系統、載體、宿主細胞或方法，其中采用了單個完全回文操縱基因序列，其優選位于啟動子的下游。
9.權利要求1-8的任一項的表達系統、載體、宿主細胞或方法，其中所述啟動子是ApL或 T7A3。
10.權利要求1-9的任一項的表達系統、載體、宿主細胞或方法，其中所述操縱基因具有序列 GGAATTGTGAGCGCTCACAATTCC (SEQ IDN0. 3 的核堿基 51-74)。
11.生產蛋白質的方法，其包括 a)培養用權利要求3的載體轉化過的宿主細胞；以及 b)回收蛋白質。
12.權利要求11的方法，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。
13.權利要求11或12的方法，其中所述載體是如權利要求4或7-10任一項的載體。
14.權利要求11-13的任ー項的方法，其中所述啟動子是ApL或T7A3。
15.權利要求11-14的任ー項的方法，其中所述操縱基因與轉錄起始點重疊。
16.蛋白質表達系統，包括用載體轉化的大腸桿菌宿主細胞，所述載體包括 a)啟動子；和 b)完全回文操縱基因序列 其特征在于所述啟動子不是T7，并且完全回文操縱基因序列與轉錄起始點重疊。
17.大腸桿菌載體，其包括 a)啟動子；和 b)完全回文操縱基因序列 其特征在于所述啟動子不是T7，并且完全回文操縱基因序列與轉錄起始點重疊。
18.權利要求17的載體,進ー步包括蛋白質的表達盒。
19.權利要求17或18的載體,其中所述載體是質粒,優選自主復制質粒。
20.由權利要求17-19任一項的載體所轉化的大腸桿菌宿主細胞。
21.生產重組蛋白質的方法，其包括使表達系統表達，該表達系統包括 a)啟動子； b)完全回文操縱基因序列；和 c)重組蛋白質的表達盒 其特征在于所述啟動子不是T7，并且完全回文操縱基因序列與轉錄起始點重疊。
22.權利要求16-21的任一項的表達系統、載體、宿主細胞或方法，其中所述操縱基因糸統是 lac、gal、deo 或 gin。
23.權利要求16-22的任一項的表達系統、載體、宿主細胞或方法,其中米用了位于啟動子下游的單個完全回文操縱基因序列。
24.權利要求16-23的任一項的表達系統、載體、宿主細胞或方法，其中所述啟動子是T7A1、T7A2、T7A3、λ pL、λ pR、lac、lacUV5、trp、tac、trc、phoA 和 rrnB。
25.權利要求16-24的任一項的表達系統、載體、宿主細胞或方法，其中所述與轉錄起始點重疊的操縱基因具有序列GGAATTGTGAGCGCTCACAATTCC (SEQ ID NO. 3的核堿基51-74)。
26.權利要求25的表達系統、載體、宿主細胞或方法，其中所述啟動子是XPL、tac或T7A3。
27.生產蛋白質的方法，其包括 a)培養用權利要求18的載體轉化過的宿主細胞；以及 b)回收蛋白質。
28.權利要求27的方法，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。
29.權利要求27或28的方法，其中所述載體是如權利要求19或22-26的任一項的載體。
30.權利要求27-29的任ー項的方法，其中所述啟動子是ApL、tac_T7A3。
31.基于完全回文操縱基因序列的蛋白表達系統，其包括 a)酵母啟動子；和 b)完全回文操縱基因序列。
32.載體，其包括 a)酵母啟動子；和 b)完全回文操縱基因序列。
33.權利要求32的載體，進ー步包含蛋白質的表達盒。
34.權利要求32或33的載體，其中所述載體是自主復制的質粒。
35.權利要求32或33的載體，其中所述載體是整合型質粒。
36.由權利要求32到35任一項的載體所轉化的酵母宿主細胞。
37.權利要求36的宿主細胞，其中所述宿主細胞是巴斯德畢赤酵母、啤酒糖酵母、多形漢遜酵母、乳克魯維酵母或粟酒裂殖酵母。
38.生產蛋白質的方法，其包括使表達系統表達，該表達系統包括 a)酵母啟動子；和 b)完全回文操縱基因序列；和c)蛋白質的表達盒。
39.權利要求38的生產重組蛋白質的方法，其包括使表達系統表達，該表達系統包括
40.權利要求32-40的任一項的表達系統、載體、宿主細胞或方法，其中所述操縱基因序列是 lac、gal、deo 或 gin。
41.權利要求31-40的任一項的表達系統、載體、宿主細胞或方法,其中米用了兩種完全回文操縱基因序列，優選ー種操縱基因序列位于啟動子的下游，并且一種操縱基因序列位于啟動子的上游。
42.權利要求41的表達系統、載體、宿主細胞或方法，其中所述操縱基因序列間隔85到150個堿基對，優選間隔91或92個堿基對。
43.生產蛋白質的方法，其包括 a)培養用權利要求33的載體轉化過的酵母；以及 b)回收蛋白質。
44.權利要求43的方法，所述酵母是巴斯德畢赤酵母、啤酒糖酵母、多形漢遜酵母、乳克魯維酵母或粟酒裂殖酵母。
45.權利要求43或44的方法，其中所述載體是權利要求33和40-42的任ー項中的載體。
46.生產蛋白質的方法，其包括在哺乳動物細胞培養物中使表達系統表達，該表達系統包括 a)哺乳動物啟動子；和 b)兩種或更多種完全回文操縱基因序列，至少ー種操縱基因序列位于啟動子的下游，并且至少ー種操縱基因序列位于啟動子的上游；和 c)重組蛋白質的表達盒。
47.權利要求46的方法，其包括 a)制備包含以下成分的表達盒哺乳動物啟動子；兩種或更多種完全回文操縱基因序列，至少ー種操縱基因序列位于啟動子的下游，并且至少ー種操縱基因序列位于啟動子的上游；和蛋白質的表達盒； b)將表達系統送遞到哺乳動物宿主細胞中； c)在哺乳動物宿主細胞的細胞培養物中使所述表達系統表達。
48.權利要求46或47的方法,其中所述操縱基因序列選自lac、gal、deo或gin。
49.權利要求46-48的任ー項的方法，其中所述操縱基因序列間隔85到150個堿基對，優選間隔91或92個堿基對。
50.權利要求46-49的任ー項的方法，其中所述表達系統整合到宿主細胞基因組中。
51.權利要求46-50的任ー項的方法，其中所述表達系統是染色體外的。
52.權利要求46-51的任ー項的方法，其中所述哺乳動物細胞是人、鼠或倉鼠細胞。
53.權利要求52的方法，其中所述細胞是中國倉鼠卵巢細胞。
54.權利要求46-53的任ー項的方法，其包括另外的回收蛋白質的步驟。
55.權利要求46-54的任ー項的方法，其中所述啟動子是hCMV啟動子。
56.載體，其包括 a)哺乳動物啟動子；和b)兩種或更多種完全回文操縱基因序列，至少ー種操縱基因序列位于啟動子的下游，并且至少ー種操縱基因序列位于啟動子的上游；和 c)重組蛋白質的表達盒。
57.權利要求56的載體，其中所述載體是非整合型質粒。
58.權利要求56或57的載體,其中所述操縱基因序列選自lac、gal、deo或gin。
59.權利要求56-58的任一項的載體，其中所述啟動子是hCMV啟動子。
60.哺乳動物細胞，優選中國倉鼠卵巢細胞，其包含權利要求56-59的任一項的載體。
全文摘要
本發明涉及表達系統。具體地，提供了基于完全回文操縱基因序列的蛋白質表達系統。表達系統包括啟動子；以及完全回文操縱基因序列，其中啟動子不是T7。優選采用表達系統來通過發酵生產重組蛋白質。
文檔編號C12N15/63GK102690834SQ20121005681
公開日2012年9月26日 申請日期2007年2月1日 優先權日2006年2月3日
發明者B·V·卡拉, C·D·J·倫農, I·J·霍奇森 申請人:富士膠片戴奧辛思生物技術英國有限公司