專利名稱：犬瘟熱弱毒疫苗株f和h基因重組新城疫病毒活載體疫苗的構建及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及重組病毒疫苗領域，更具體地，本發明涉及一種表達犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H或HA)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，更具體地，重組新城疫LaSota弱毒疫苗是rLa_⑶VR-F或rLa_⑶VR-H。本發明還公開了制備所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和該重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備疫苗/試劑盒中的應用。
背景技術：
犬痕熱(⑶)是由犬痕熱病毒(Canine Distemper Virus, Q)V)感染引起的急性、高度接觸性傳染病。該病不但可以感染犬科動物，還能感染鼬科、浣熊科和貓科等多種動物，發病率高，幾乎可以達到100%，且臨床癥狀多樣，容易發生細菌、病毒的混合感染和繼發二次感染，死亡率更是可高達80%，素有“毀滅性傳染病”之稱[1]。近年來，Mee等從患 Pagets疾病的病人組織中檢測出犬瘟熱病毒核酸M，使得犬瘟熱成為繼狂犬病之后人畜共患的第二種疫病，引起了動物病毒學界及醫學界的普遍關注。犬痕熱病毒(caninedistemp virus,CDV)屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae),副粘病毒亞科(Paramyxovirinae),麻疫病毒屬(Morbillivirus),為單股不分節段的負鏈RNA病毒，其基因組長15690bp，編碼N、P、M、F、H、L和C蛋白。融合蛋白(fusion protein,F)，是位于CDV囊膜上的I型糖蛋白，介導病毒與感染細胞、感染細胞與非感染細胞間的融合，使病毒具有在宿主體內擴散的能力。研究發現雖然針對F蛋白的單抗不能完全中和CDV，但其誘導的免疫反應能阻止病毒感染，并且在有病毒增殖的情況下抑制癥狀的發生ο附著或血凝素蛋白(attachment protein or hemagglutinin protein, H 或 HA),是CDV囊膜表面上典型的II型糖蛋白，誘導機體產生中和抗體，是抗犬瘟熱病毒免疫的主要抗原。抗犬瘟熱病毒H蛋白單克隆抗體具有病毒中和活性，對試驗鼠的保護力強于抗F蛋白的單克隆抗體[4]。病毒通過H蛋白吸附到細胞表面的受體上，因此，H蛋白決定了犬瘟熱病毒宿主的特異性，并協助F蛋白使犬瘟熱病毒以囊膜與宿主細胞膜發生融合的方式進入宿主細胞[5]。F、H是產生中和抗體的重要抗原之一，在病毒免疫中占有重要地位。CD是可以預防的，主要通過給幼犬接種犬瘟熱弱毒苗進行免疫，但由于母源抗體的存在會直接干擾免疫效果，常常導致免疫失敗。因此研制不受犬只已有抗體干擾的疫苗廣品迫在眉睦。負鏈RNA病毒的反向遺傳操作(Reverse genetic)是通過操作病毒基因組cDNA制造新病毒的過程，其基本過程是①組裝完整的病毒基因組(或重組型基因組)cDNA克隆，5’末端精確地綴于T7啟動子后，3’末端精確綴于自我剪切的核酸酶序列和T7轉錄終止信號之前，構成基因組cDNA轉錄模板；②以基因組cDNA轉錄模板與啟動病毒復制必須的轉錄相關功能結構蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表達質粒(T7啟動子)一起，共轉染整合表達T7聚合酶的病毒復制許可細胞24-72小時后收獲培養上清，過濾后繼續敏感細胞傳代或接種雞胚尿囊腔拯救(rescue)病毒。對基因組cDNA進行突變、缺失或外源基因插入修飾后，通過反向遺傳操作系統(reverse genetic system,RGS系統)可獲得相應的突變或重組的負鏈RNA病毒。申請人:之前獲得授權的中國專利“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統及其應用”(申請號200510097997. 8，申請日2005年9月2日)已經建立了一種新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遺傳操作系統，并且成功拯救了野生型病毒株，并且為進一步開展新城疫病毒活載體疫苗研制及NDV病毒相關基礎奠定了堅實的基礎。

發明內容
針對上述研究背景，本發明人為研制更安全有效、生產成本低廉的犬瘟熱活載體疫苗，在新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遺傳操作系統的基礎上，構建出表達犬瘟熱弱毒疫苗株Rockborn-20/8F或H蛋白的重組病毒rLa_CDVR_F或rLa_CDVR_H，通過Western-blot和免疫熒光試驗驗證犬瘟熱融合蛋白和血凝素蛋白的正確表達，進行兩株重組病毒的毒力檢測，并通過對小鼠和犬的免疫試驗對其免疫原性進行研究和評價。因此，本發明的一個目的是提供一種表達犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，其中優選所述犬瘟熱病毒融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，優選所述犬瘟熱病毒血凝素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。在一個實施方案中，所述編碼所述犬瘟熱病毒融合蛋白的基因的序列如SEQ IDNo. 2所示,和/或編碼所述犬痕熱病毒血凝素蛋白的基因的序列如SEQ ID No. 4所示。在一個實施方案中，通過反向遺傳操作技術在新城疫LaSota弱毒疫苗中表達所述犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)，優選用于表達所述犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的新城疫LaSota弱毒疫苗是AV1615(購自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心(CVCC))。在一個實施方案中，所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗為rLa_⑶VR-F或rLa-CDVR-H。本發明還有一個目的是提供根據本發明的重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備預防犬瘟熱和/或新城疫的疫苗中的應用。本發明還有一個目的是提供一種生產本發明的重組新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，該方法包括(I)構建轉錄質粒，該轉錄質粒包括其中插入編碼犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的基因的新城疫LaSota弱毒疫苗的基因組cDNA序列，優選所述新城疫LaSota弱毒疫苗是AV1615 ；(2)構建一個或多個轉錄輔助質粒，該輔助質粒包括編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；
(3)將所述轉錄質粒和轉錄輔助質粒共轉染所述新城疫LaSota弱毒疫苗復制許可的宿主細胞，培養轉染后的宿主細胞；和(4)收獲上清液，過濾后繼續敏感細胞傳代或接種雞胚尿囊腔拯救重組病毒株，
其中優選所述犬瘟熱病毒融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，優選所述犬瘟熱病毒血凝素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；更優選其中編碼所述犬瘟熱病毒融合蛋白的基因的序列如SEQ ID No. 2所示，和/或編碼所述犬瘟熱病毒血凝素蛋白的基因的序列如SEQ ID No. 4所不。在一個實施方案中，所述轉錄質粒是PBRN-FL-F或pBRN-FL_H，和/或所述轉錄輔助質粒分別是質粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L。本發明還有一個目的是提供根據本發明的方法制備的重組新城疫LaSota弱毒疫苗。本發明還有一個目的是提供根據本發明的重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備疫苗中的應用，所述疫苗用于受試者針對犬瘟熱的加強免疫，優選所述受試者已經用犬瘟熱 病毒(CDV)弱毒疫苗首次免疫,更優選所述受試者選自由犬科動物、鼬科動物、綜熊科動物和貓科動物組成的組，最優選犬科動物，特別是犬。本發明還有一個目的是提供一種用于預防犬瘟熱和/或新城疫的試劑盒，其在相同或不同包裝或容器中包括(a)犬瘟熱病毒(CDV)弱毒疫苗；(b)根據權利要求1-4中任何一項的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，優選為rLa_⑶VR-F、rLa_⑶VR-H或它們的混合物；和任選地(C)使用說明書，優選(a)和(b)是在試劑盒中的不同包裝或容器中，其中所述使用說明書指示(a)用于首次免疫，(b)用于加強免疫。非復制性活載體疫苗-新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)只在禽源組織中復制，具有宿主限制性，被其表達的外源蛋白與其它哺乳動物病毒表達載體相比，具有較高的表達效率，而且生產成本低廉。NDV活載體疫苗不需佐劑即可誘導機體產生比較廣泛的免疫，包括體液免疫和較強的細胞免疫，甚至粘膜免疫，是當今與未來疫苗研制與開發的主要方向之一。本研究選用單股負鏈RNA病毒反向遺傳操作系統-新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株為載體，構建了表達犬瘟熱弱毒疫苗株Rockborn-20/8 (CDV/R-20/8) F或H基因的重組 NDV疫苗株，為研制和應用安全、有效、生產成本低廉的新型犬瘟熱活載體疫苗及犬瘟熱的防制奠定基礎。更具體地，本發明在現有技術已知的新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遺傳操作系統(參見ZL200510097997.8)的基礎上，構建了表達犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗rLa-CDVR-F和rLa-CDVR-H。兩重組株均與親本株一致，具有高雞胚生長滴度的特性和低致病性。重組株rLa-⑶VR-F免疫犬在初免和加強免疫后其體內⑶V中和抗體均彡2 ;接種rLa-⑶VR-H或接種rLa-CDVR-F/Η混合病毒液的免疫犬在初免后一周的CDV中和抗體效價平均值為2，而二次免疫后，中和抗體效價在一周后平均值分別達到37. 64和26. 24 ;CDV弱毒疫苗Rockborn-20/8 (CDV/R-20/8)接種組初次免疫一周中和抗體效價為19. 69，經rLa-⑶VR-F/H混合病毒液加強免疫后中和抗體平均值高達204. 06。這一結果表明，重組疫苗株rLa-⑶VR-H表達的H蛋白的免疫原性遠遠高于重組株rLa-⑶VR-F表達的F蛋白，但F蛋白在抗體滴度的維持方面呈現一定作用。rLa-⑶VR-F/H可不受⑶V抗體干擾，免疫增強效果顯著。這也為探尋新型犬瘟熱重組活載體疫苗奠定了基礎。


圖I.表達⑶VR F或H的重組型NDV基因組全長cDNA的構建；圖2.激光共聚焦觀察⑶VR-F或⑶VR-H蛋白在重組病毒感染細胞內的表達；
圖3. ffestern-blot檢測⑶V F或H抗原在重組新城疫病毒感染細胞的表達；圖4.重組疫苗滴鼻及肌肉注射免疫小鼠誘導產生的抗體滴度；圖5.重組疫苗肌肉免疫犬誘導產生的病毒中和抗體滴度；圖6. pBRN-FL-Pmel 的質粒圖譜；圖7.質粒pBS-NP的序列，帶下劃線的斜體部分是NP基因的編碼序列；圖8.質粒pBS-P的序列，帶下劃線的斜體部分是P基因的編碼序列；圖9.質粒pBS-L的序列，帶下劃線的斜體部分是L基因的編碼序列；圖10.質粒pBRN-FL-F的全序列；圖11.質粒pBRN-FL-H的全序列。
具體實施例方式下文將參考實施例詳細描述本發明，所述實施例僅是意圖舉例說明本發明，而不是意圖限制本發明的范圍。本發明的范圍由后附的權利要求具體限定。實施例I表達犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗的構建和生物學活性I材料和方法I. I 材料I. I. I細胞、病毒、重組質粒、雞胚和實驗動物HEp_2細胞(ATCC CCL-23)和BHK-21細胞(ATCC CCL-10)，培養基為含10%胎牛血清DMEM ;Vero_E6細胞由本實驗室保存；穩定表達T7聚合酶的重組痘病毒vTF7-3 (ATCC，VR-2153)購于ATCC ；NDV感染性克隆質粒pBRN-FL-Pmel以及輔助核蛋白(pBS_NP)、磷蛋白(pBS_P)和大聚合酶蛋白(pBS_L)重組質粒均由本實驗室構建并保存[6’7]，它們也可以根據ZL200510097997. 8的說明書實施例I進行構建；重組新城疫弱毒疫苗株rLaSotate’7](其也可以根據ZL200510097997. 8的說明書實施例I進行構建)和表達綠色熒光蛋白的重組犬瘟熱病毒rCDVR-EGFP[6’7]均由本實驗室克隆，拯救并保存；犬瘟熱弱毒疫苗株CDV/R-20/8購自軍事獸醫研究所；雞抗NDV、鼠抗CDV和犬抗CDV高免血清均由本研究室制備；新城疫血凝抑制試驗(HI)診斷抗原由哈爾濱維科生物技術開發公司生產并提供；9 11日齡SPF雞胚由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所SPF實驗動物中心提供；3周齡BALB/c小鼠(均為雌性)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；12周齡比格犬購自廣州醫藥工業研究院。I. I. 2 主要試劑和儀器rTaq 酶,Primer Star HS DNA Polymerase 均購自 TaKaRa公司；T4DNA連接酶及其它限制性內切酶均購自NEB公司；TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮)處理的胰酶、FITC (異硫氰酸熒光素)標記的兔抗雞IgG和山羊抗鼠IgG熒光抗體、TIRTC(羅丹明衍生物)標記山羊抗鼠IgG熒光抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG抗體和兔抗雞IgG抗體均購自Sigma公司；優化的無血清培養基opti_MEM、RNA提取試劑Trizol、鼠源反轉錄酶(M-MLV)試劑盒以及磷酸I丐轉染試劑盒(Calcium phosphateTransfection Kit)均購自Invitrogen公司；預染蛋白Marker購自Fermentas公司；膠回收試劑盒(Gel Extraction Mini Kit)及質粒小量提取試劑盒(Plasmid Mini Kit)均購自OMEGA公司；質粒中提試劑盒購自QIAGEN公司；熒光顯微鏡為Leica DMIRB，購自Leica公司。I. 2CDV/R-20/8融合蛋白(F)和血凝蛋白(H或HA)基因的獲取和序列分析從GenBank獲得⑶V弱毒疫苗株Rockborn基因組F和H基因的開放閱讀框(ORF)序列(F 基因 GenBank Accession No. AF026244. I ;H 基因 GenBank AccessionNo. GU266280. I)，設計兩對引物(見表I)，在上述兩種上游引物起始密碼子ATG前分別加入了基因起始、基因間隔、基因終止和利于真核表達的Kozak序列，并在上下游引物中引入Pme I限制酶識別序列，同時要保證重組病毒基因組cDNA全長總堿基數仍保持6的倍數。
將犬瘟熱弱毒疫苗株CDV/R-20/8按MOI約為I. O的病毒量接種于Vero-E6細胞中，72h后收獲病毒液。Trizol法提取病毒液中的基因組RNA，利用上述兩對成對的引物經RT-PCR方法分別獲得F和H基因的PCR產物，經凝膠電泳回收后平端克隆到pBlueScr ip 11KS (+)載體的EcoR V位點，克隆產物分別命名為pBS-⑶VR-F和pBS-⑶VR-H，通過測序確保克隆的基因片段與病毒基因組DNA序列完全一致。表I.表達F或HA基因的全長基因組克隆質粒構建所用引物
y
引物名稱引物序列
...........V aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa^^^aaaaaaaaaaaaaa^^^^^^^j-^^MggMggMggmggagggagggaggaaaaaaaaaaaaaagm.wm.wm.T
OJVR^PF
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,…-1 CDVR-F-PR 5，-GACTGTTTAAACTCAGAGTGATCTCACATAGGA-3’
CDVR-H-PF 5 ^-GACTGTTTAAAClTTAGAAAAAAlllACGGGTAGAAlGrGCCGCCA CCATGCTCTCCTACCAAGACAAGGT-3，
CDVR-H-PR 5，-GACTGTTTAAACTCAGGGATTTGAACGGTTACATG-3 ’
.■■■■■■■■■■■wwwwwwwr.n.n.n.n.gsassassas^^^^HWWHWwwwwmaa.圈麵...........................................................................................................................................................................藝
Z注帶下劃線序列是F或H-特異性序列，限制性位點用粗體表示，Kozak序列用斜體表示，轉錄終止序列GE和轉錄起始序列Gs用加框表示。I. 3表達F或HA基因的重組病毒基因組全長cDNA的構建質粒pBS-CDVR-F 和 pBS_CDVR_H 分別經 Pme I 酶切處理后，回收 CDVR-F 或 CDVR-H片段，并與同樣經Pme I酶切去磷酸化的NDV感染性克隆質粒pBRN-FL-Pmelm連接，分別構建成表達⑶V/R-20/8F或H基因的重組基因組全長cDNA克隆，分別命名為pBRN_FL_F和pBRN-FL-HοI. 4重組病毒的拯救BHK-21細胞接種于35mM六孔板內，當細胞生長達80% 90%單層時，按MOI約為
O.01的病毒量接種表達T7聚合酶的重組痘病毒vTF7-3。vTF7_3預感染細胞Ih后，利用磷酸隹丐轉染試劑盒(Calcium Phosphate Transfection System),將轉錄質粒 pBRN-FL-F 或pBRN-FL-H 及輔助質粒 pBS-NP、pBS-P 和 pBS_L 分別以每孔 5 μ g、2. 5 μ g、I. 25μ g、l. 25 μ g共轉染BHK-21細胞，具體拯救方法見參考文獻m。收獲HA及HI實驗m結果均為陽性的尿囊液，-70°C凍存，并按常規方法分別接種于9 11日齡雞胚滴定每毫升病毒液EIDki含量。拯救出的重組病毒分別命名為rLa-⑶VR-F和rLa-⑶VR_H(在本文中有時也稱為rLa-CDVR-HA)。I. 5重組病毒的RT-PCR鑒定各取250 μ L重組病毒雞胚接種尿囊液，用Trizol經常規方法提取病毒基因組RNA。分別以 CDVR-F-PF 和 pBRN-8306-PR (5' -GACTGCATTCACTGATGAG-3')或 CDVR-H-PF和pBRN-8306-PR為引物，參照文獻Μ中所述進行RT-PCR擴增，對擴增的PCR產物進行測序和序列分析。I. 6激光共聚焦檢測F或HA蛋白的表達將rLaSota、rLa-CDVR-F、rLa-CDVR-H 和 rCDV/R-20/8 病毒液按 MOI 約為 I. O 感染BHK-21細胞，24h后3%多聚甲醛固定20min。IxPBST洗3x5min后，依次以I : 50稀釋的鼠抗⑶V高免血清和雞抗NDV高免血清為一抗孵育lh，再依次以I : 200稀釋TIRTC標記 山羊抗鼠IgG和FITC標記的兔抗雞IgG熒光抗體為二抗孵育lh。PBST洗滌完畢后，加入DAPI (2- (4-Amidinophenyl) -6-indolecarbamidine dihydrochloride,購自 sigma)對細胞進行染核處理。使用激光共聚焦顯微鏡對處理完畢的樣品進行觀察并拍照。I. 7ffestern-Blot 檢測 F 或 H 抗原表達將rLaSota、rLa-CDVR-F、rLa-CDVR-H 和 rCDV/R-20/8 病毒液按 MOI 為 5. O 感染單層BHK-21細胞，24h后將5% DMEM換成優化培養基opti-MEM，同時每孔加入8yL的TPCK(O. 25μ g/μ L)。待80% 90%細胞脫落后離心收集細胞，用細胞裂解液裂解后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、電轉印，5%脫脂乳封閉過夜。一抗為I : 100稀釋的犬抗⑶V高免血清檢測F蛋白和H蛋白。二抗為I : 2000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗犬IgG。DAB(二氨基聯苯胺)顯色試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)顯色3 5min后去離子水終止反應，觀察結果。同時設空白BHK-21細胞為陰性對照。2 結果2. I表達F或H基因的重組病毒基因組全長cDNA的構建和重組病毒的拯救在新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統基礎上，利用PCR手段在CDV/R-20/8株F或H基因兩端引入轉錄調控GE、GS序列和Pme I酶切位點后，插入同樣經Pme I酶切處理的NDV感染性克隆pBRN-FL-Pmel，分別構建成表達犬瘟熱弱毒疫苗株⑶V/R-20/8F或H基因的重組NDVcDNA克隆pBRN_FL_F，pBRN-FL-H (如圖I所示)。以CDVR-F-PF或CDVR-H-PF 分別和 pBRN-8306-PR(5' -GACTGCATTCACTGATGAG-3')為引物，利用 PCR 方法擴增出2495bp和2333bp的產物與預期結果相符，經測序鑒定已證實插入NDV全長cNDA克隆的片段大小和方向均正確。為了從克隆的cDNA中拯救出感染性重組病毒，分別以pBRN-FL-F或pBRN-FL-H與表達NDV NP、P、L蛋白的輔助質粒共轉染BHK-21細胞。休克、換液72h后，收獲細胞培養上清轉接于9 11日齡的SPF雞胚，繼續培養5天后收獲血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗結果陽性的尿囊液作為拯救病毒的Fl代。病毒樣品經SPF雞胚連續傳代3次后，提取病毒液RNA，進一步的RT-PCR及序列分析結果顯示，F3代重組病毒基因組的預期位點正確插入了 CDV/R-20/8株F或H基因及其引入的轉錄調控序列。以上結果表明，通過反向遺傳操作技術，利用NDV LaSota疫苗株基因組cDNA克隆成功救獲了具有感染性的重組子代病毒rLa-CDVR-F 株和 rLa-CDVR-H 株。
2. 2共聚焦檢測檢測F或H蛋白表達為能更直觀地觀察重組病毒在細胞內F或H蛋白表達量和錨定的位置，將親本株rLaSota(即通過反向遺傳操作技術由AV1615獲得的疫苗株)和重組株rLa-⑶VR-F，rLa-CDVR-H，rCDV/R-20/8分別感染BHK-21細胞24h后固定，以雞抗NDV高免血清和鼠抗⑶V高免血清為一抗，FITC標記的兔抗雞IgG和TIRTC標記山羊抗鼠IgG熒光抗體為二抗，DAPI染核處理制備共聚焦樣品。通過激光共聚焦觀察到親本株rLaSota感染的細胞內只有NDV蛋白表達(圖2，B，C);在重組株rLa-⑶VR-F和rLa-⑶VR-H感染的BHK-21細胞中有NDV和⑶V兩類蛋白，且犬瘟熱病毒的兩種糖蛋白F和H均位于宿主細胞膜上(圖2，G，K)，而重組病毒r⑶V/R-20/8感染的細胞內只有⑶V蛋白表達(圖2，N，0)。結果顯示重組病毒表達了 F或H蛋白。2. 3ffestern-Blot 檢測 F 或 H 蛋白表達將重組病毒株rLa-CDVR-F，rLa-CDVR-H和親本株rLaSota分別感染的BHK-21細胞裂解后進行SDS-PAGE電泳，轉印至尼龍膜后，以重組疫苗株r⑶V/R-20/8免疫制備的犬高免血清為一抗、HRP-標記的兔抗犬IgG為二抗，進行Western-blot檢測。圖3d中顯示 分子量為60kDa的多肽與重組毒rLa-⑶VR-F感染細胞所表達的H)前體蛋白大小相一致。重組病毒rLa-⑶VR-H感染的BHK-21細胞中檢測到一種85kDa的多肽(圖3e)，這與完全糖基化的犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的大小相一致。在親本株rLaSota感染組(圖3b)和空白(圖3c)BHK-21細胞中均未檢測到⑶VR-F和H的特異性產物。這些結果顯示犬瘟熱病毒F和H抗原分別在重組新城疫病毒感染細胞中獲得了正確表達。實施例2重組病毒的致病性試驗、對小鼠的免疫保護試驗和對犬的免疫試驗I.材料與方法I. I重組病毒的致病性試驗按O. I. E標準方法[9]對重組病毒rLa-⑶VR-F和rLa_⑶VR-H F3代進行平均雞胚致死時間(MDT)、腦內致死指數(ICPI)及靜脈內致病指數(IVPI)等致病性指標測定。I. 2重組病毒對小鼠的免疫試驗將4周齡雌性BALB/c小鼠分為四組，每組15只，重組株rLa_⑶VR-F，重組株rLa-CDVR-H，rLa-CDVR-F/Η 混合病毒液(I I)以約 108_ 5EID5(I/100 μ L 劑量(半數雞胚感染量(EID5tl))經滴鼻和肌注兩種途徑分別免疫，每只130yL，第四組為正常對照組，采用相同方式免疫親本株rLaSota。免疫28天后重組病毒均以相同劑量和相同途徑加強免疫小鼠。初次和加強免疫14天后小鼠眼眶后靜脈叢取血。由于分離的血清量較少不足以進行中和抗體檢測，因此采用間接ELISA試驗進行抗體滴定。通過間接ELISA方陣試驗確定純化的r⑶V/R-20/8最適抗原包被濃度為5 μ g/mL后，以此濃度包被96孔ELISA板，4°C過夜放置。次日取出用I % BSA室溫封閉Ih后，加入待檢血清和陰、陽性血清進行倍比稀釋，于25°C放置lh，隨后以I : 4000稀釋的HRP標記山羊抗鼠IgG為二抗進行間接ELISA檢測。I. 3重組病毒對犬的免疫試驗分別將重組疫苗株rLa-CDVR-F、rLa-CDVR-H及rLa-CDVR-F/Η混合病毒液以2xl09·5EID50的劑量經肌肉注射接種于12周齡比格犬各5只，同時取犬瘟熱弱毒疫苗株Rockborn-20/8 (CDV/R-20/8)免疫同齡比格犬5只作為對照。免疫后第四周以rLa-CDVR-F/H混合病毒液對所有免疫組進行加強免疫。采集免疫后一周的犬前臂靜脈血，分離血清進行熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)檢測。血清樣品首先經56°C水浴滅活補體，隨后將連續4倍至128倍倍比稀釋好的血清與含100個TCID5tl (半數組織感染量)的r⑶VR-EGFP病毒等體積混合，37°C孵育Ih后每孔加入100 μ L Vero-E6細胞懸液。每個樣品作4個重復，同時設陽性、陰性血清對照。感染72h后用突光顯微鏡觀察結果。被檢血清的病毒中和抗體(virus neutralize antibody,VNA)滴度為能保護50%細胞孔不出現病變的血清最高倍數。2 結果 2. I重組病毒的致病性分析重組病毒株rLa-CDVR-F和rLa-CDVR-H F3代的半數雞胚感染量(EID5tl)分別為IO8.5/0· ImL和IO8-6Vo. ImL ;雞胚平均致死時間分別為130. 8h和135. 2h，遠遠大于90h，屬于溫和或緩發型毒株。該結果表明重組株保持了 LaSota弱毒疫苗親本毒株對雞胚良好的高滴度生長適應和低致病特性。2. 2重組病毒對小鼠的免疫保護試驗分別將親本毒 rLaSota，重組病毒 rLa-CDVR-F，rLa-CDVR-H (即 rLa-CDVR-HA)和混合病毒液rLa-⑶VR-F/H(即rLa-⑶VR-F+HA)經滴鼻和肌注兩種途徑免疫4周齡的BALB/c小鼠，免疫四周后以相同方式進行加強。對采集的血清樣品利用間接ELISA試驗方法檢測抗體滴度。結果顯示，初免和加強免疫后重組株rLa-⑶VR-F與親本株rLaSota所免疫血清OD值均為陰性值，未檢測到抗體；而重組株rLa-⑶VR-H和混合免疫組rLa-⑶VR-F/H初免兩周后抗體濃度分別為2. 05 μ g/mL和I. 91 μ g/mL ;加強免疫兩周后抗體滴度顯著增加,分別達到58. 87 μ g/mL和44. 76 μ g/mL (如圖4所示)。2. 3重組病毒對犬的免疫試驗將重組弱毒疫苗株rLa-CDVR-F，rLa-CDVR-H、rLa-CDVR-F/Η混合病毒液以及Rockborn-20/8 (CDV/R-20/8)分別接種12周齡比格犬。并于初次免疫后4周用rLa-⑶VR-F/H混合病毒液進行加強免疫。通過中和試驗對所采集血樣的中和抗體滴度(virus neutralize antibody, VNA)進行檢測。結果顯示，重組株rLa-CDVR-F免疫犬在初免和加強免疫后其體內⑶V中和抗體均< 2 ;接種rLa-⑶VR-H或接種rLa-⑶VR-F/H混合病毒液的免疫犬在初免后一周的CDV中和抗體效價平均值為2,而進行二次免疫后，抗體滴度顯著升高，產生的中和抗體效價在一周后平均值分別達到37. 64和26. 24 ；Rockborn-20/8 (CDV/R-20/8)接種組初次免疫一周中和抗體效價為19. 69，經rLa-CDVR-F/H混合病毒液加強免疫后中和抗體平均值高達204. 06 (圖5)。3.討論犬瘟熱呈世界性分布，敏感宿主范圍廣，而且可在大量不相關的動物種類中進行種間傳播，因此免疫接種預防犬瘟熱病毒感染具有重要的公共衛生意義。目前，國內外常用疫苗主要分為滅活苗和弱毒疫苗兩種，CDV滅活苗因免疫原性差，生產成本高而逐漸被弱毒疫苗、尤其聯苗取代。國內常用的犬瘟熱弱毒疫苗為雞胚成纖維細胞源弱毒株(Ondersteppot)和犬細胞培養適應毒株(Rockborn),犬痕熱弱毒疫苗雖然非常有效,但其本身易受母源抗體干擾，而且⑶V弱毒疫苗對溫度敏感、熱穩定性差，對于疫苗的運輸和保存條件要求很高。此外CDV弱毒疫苗對部分免疫缺陷犬和野生食肉動物不安全，易出現變態反應等問題。因此，尋求更安全有效、生產成本低廉的新型疫苗已經成為當前國內外學者的研究熱點。Norrby等用單抗親和層析方法純化⑶V的H、F蛋白抗原接種犬[1°]，這種基因工程亞單位疫苗雖然呈現較好的免疫原性，但其生產成本高。Cherpillod P et al (2000)將⑶V強毒株A75/17的F、H、N基因克隆進真核表達載體pCI，構建了 pCI_N、pCI_F、pCI-H三種質粒，混合肌注免疫犬，三次免疫后四周攻強毒發現，該DNA疫苗對免疫犬提供了保護力。但由于其存在安全隱患而未得到推廣。以活病毒作為載體表達外源基因能夠最大程度接近編碼蛋白的天然狀態，保持蛋白的抗原性，并可激發細胞免疫、體液免疫和局部粘膜免疫，是所有疫苗形式中最為理想的免疫方式。本研究中，我們以負鏈RNA病毒反向遺傳操作系統(reverse genetic system,RGS)成功建立的新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株作為活病毒表達載體。由于新城疫病毒活載體疫苗在哺乳動物中不能進行有效復制，便不會造成病毒在免疫個體中或未免疫群體及整個環境的交叉傳播，這一特性表明其具有很高的安全性。而且其作為活載體疫苗 的有效性和安全性也已在靈長實驗動物獲得證實，被國際學術界認為是防治重大烈性緊急傳染病極有希望的安全、有效活病毒疫苗載體。Ge JY[12]等已采用此NDV載體表達了狂犬病病毒ERA株的糖蛋白基因，免疫鼠和犬后，不僅表現出安全性，而且能夠有效持久地保護動物抵抗狂犬病毒的攻擊。我們采用同樣的策略，分別構建了表達犬瘟熱弱毒疫苗株Rockborn (CDVR)-20/8的融合蛋白(F)或血凝素蛋白(H)的重組新城疫病毒rLa-CDVR-F和rLa-⑶VR-H，經Western-blot和免疫熒光試驗驗證插入的外源蛋白能正確表達并發揮其相應的生物學功能。很多研究證實，麻疹病毒屬的融合蛋白具有很低的免疫原性。雖然Malvoisin和ffild(1990)[13]已經證明了具有中和活性的抗F單抗能被分離到，但是一直以來都認為在體外試驗中融合抗體只具有很低的中和活性。1992年，Taylor等[14’15]采用CPV和VV載體分別重組了 MV的H、F基因，通過動物實驗也證實了不論是接種CP-MVF重組疫苗還是接種VV-MVF重組疫苗的犬體內均未誘導產生MV中和抗體。這與本研究中免疫了重組株rLa-CDVR-F的小鼠和犬體內均未產生中和抗體的試驗結果相一致。免疫試驗中通過對犬體內中和抗體的持續檢測發現，共同免疫了 rLa-CDVR-F/Η比單獨免疫rLa-CDVR-H的犬體內中和抗體下降緩慢。這也表明犬瘟熱的融合蛋白在維持抗體滴度方面呈現一定的作用。犬瘟熱的血凝素蛋白具有較高的免疫原性，我們研究發現，免疫了重組株rLa-⑶VR-H或共同免疫了 rLa-⑶VR-F/H的小鼠一次免疫就能誘導產生與對照組有顯著差異的IgG抗體；而免疫犬在初免后雖然中和抗體滴度很低，但進行二次免疫后，抗體滴度大幅提高。這也與Taylor等學者的研究結果相一致。但是免疫犬只在再次接種后一周抗體滴度顯著升高，但二周后迅速下降，抗體持續周期較短(數據未顯示)，這一特點與CDV弱毒疫苗免疫極其相似；因此，二次或多次加強免疫，對誘導高水平的免疫反應并維持長時間的有效保護反應具有極為重要意義。但考慮到CDV抗體對CDV弱毒疫苗的干擾作用，CDV弱毒疫苗多次加強免疫可能導致免疫失敗，因此，在CDV弱毒疫苗首次免疫的基礎上，本實驗采用rLa-⑶VR-F/H對Rockborn (⑶VR) -20/8免疫組進行加強免疫，加強后一周的中和抗體滴度高達204，加強效果非常顯著。重組活載體疫苗rLa-⑶VR-F和rLa_⑶VR-H平均每毫升雞胚接種尿囊液病毒滴度可達109_5EID5(l/mL，對溫度不敏感，凍干疫苗產品可常溫運輸不會導致疫苗滴度下降；雞胚接種的生產成本低遠遠低于CDV弱毒疫苗，操作簡單便于大規模生產；NDV活載體疫苗經實驗驗證對哺乳動物呈一過性感染，不會在哺乳動物體內進行擴散，相比較于CDV弱毒疫苗具有更高的安全性，尤其對于水貂等經濟動物安全性尤為重要。此項研究為進一步探索犬瘟熱重組活病毒疫苗的應用奠定了基礎，重組活載體疫苗有望部分取代傳統CDV弱毒疫苗成為防制犬瘟熱更廉價、安全的新型重組基因工程活載體疫苗。參考文獻[I]周慶國，張更利.犬瘟熱與常見相似疾病臨診特征的比較[J].畜牧與獸醫，2000，32 (3) 32 33.[2]Mee AP,Dixon JA,Hoyland JA,Davies M,Selby PL,Mawer EB.Detection ofcanine distemper virus in 100% of Paget’ s disease samples by in situ-reversetransciptase polymerase chain reaction. 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權利要求
1.一種表達犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，其中優選所述犬瘟熱病毒融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，優選所述犬瘟熱病毒血凝素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
2.根據權利要求I的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，其中編碼所述犬瘟熱病毒融合蛋白的基因的序列如SEQ ID No. 2所示，和/或編碼所述犬瘟熱病毒血凝素蛋白的基因的序列如 SEQ ID No. 4 所示。
3.根據權利要求I或2的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，其中通過反向遺傳操作技術在新城疫LaSota弱毒疫苗中表達所述犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)，優選用于表達所述犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的新城疫LaSota弱毒疫苗是AV1615。
4.根據權利要求1-3中任何ー項的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，其為rLa_⑶VR-F或rLa-CDVR-H。
5.根據權利要求1-4中任何ー項的重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備預防犬瘟熱和/或新城疫的疫苗中的應用。
6.ー種生產權利要求1-4中任何ー項的重組新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，該方法包括 (1)構建轉錄質粒，該轉錄質粒包括其中插入編碼犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的基因的新城疫LaSota弱毒疫苗的基因組cDNA序列，優選所述新城疫LaSota弱毒疫苗是AV1615 ； (2)構建ー個或多個轉錄輔助質粒，該輔助質粒包括編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白⑵的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列； (3)將所述轉錄質粒和轉錄輔助質粒共轉染所述新城疫LaSota弱毒疫苗復制許可的宿主細胞，培養轉染后的宿主細胞；和 (4)收獲上清液，過濾后繼續敏感細胞傳代或接種雞胚尿囊腔拯救重組病毒株， 其中優選所述犬瘟熱病毒融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，優選所述犬瘟熱病毒血凝素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；更優選其中編碼所述犬瘟熱病毒融合蛋白的基因的序列如SEQ ID No. 2所示，和/或編碼所述犬瘟熱病毒血凝素蛋白的基因的序列如SEQ ID No. 4所示。
7.根據權利要求6的方法，其中所述轉錄質粒是pBRN-FL-F或pBRN-FL_H，和/或所述轉錄輔助質粒分別是質粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L。
8.根據權利要求6-7中任何ー項的方法制備的重組新城疫LaSota弱毒疫苗。
9.根據權利要求1-4中任何ー項的重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備疫苗中的應用，所述疫苗用于受試者針對犬瘟熱的加強免疫，優選所述受試者已經用犬瘟熱病毒(CDV)弱毒疫苗首次免疫，更優選所述受試者選自由犬科動物、鼬科動物、綜熊科動物和貓科動物組成的組，最優選犬科動物，特別是犬；還優選所述疫苗是通過滴鼻或肌肉注射對所述受試者進行免疫。
10.用于預防犬瘟熱和/或新城疫的試劑盒，其在相同或不同包裝或容器中包括(a)犬瘟熱病毒(⑶V)弱毒疫苗；(b)根據權利要求1-4中任何ー項的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，優選為rLa-⑶VR-F、rLa-⑶VR-H或它們的混合物；和任選地(c)使用說明書，優選 (a)和(b)是在試劑盒中的不同包裝或容器中，其中所述使用說明書指示(a)用于首次免疫，(b)用于加強免疫。
全文摘要
本發明涉及一種表達犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，更具體地，重組新城疫LaSota弱毒疫苗是rLa-CDVR-F或rLa-CDVR-H。本發明還公開了制備所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和該重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備疫苗/試劑盒中的應用。
文檔編號C12N15/85GK102816741SQ201210056899
公開日2012年12月12日 申請日期2012年3月6日 優先權日2012年3月6日
發明者步志高, 陳化蘭, 葛金英, 夏咸柱, 王喜軍, 高玉偉 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所, 哈爾濱維科生物技術開發公司, 長春西諾生物科技有限公司