專利名稱：一種無(wú)質(zhì)粒、無(wú)抗生素抗性篩選標(biāo)記的基因工程菌的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種無(wú)質(zhì)粒、無(wú)抗生素篩選標(biāo)記的基因工程菌的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
利用基因工程微生物生產(chǎn)有用物質(zhì)已成為物質(zhì)制造的新的模式。目前，通常采用含目的基因的質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)來(lái)構(gòu)建工程微生物。但是這種質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)往往存在質(zhì)粒易丟失、不穩(wěn)定、且質(zhì)粒的存在又將增加宿主菌的代謝負(fù)擔(dān)。更為嚴(yán)重的是質(zhì)粒往往又含有抗生素抗性篩選標(biāo)記，這將嚴(yán)重影響環(huán)境污染問(wèn)題，導(dǎo)致環(huán)境中抗生素耐藥菌泛濫，從而限制了含質(zhì)粒的基因工程菌的工業(yè)化進(jìn)程。為了解決質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)的上述缺陷，將目的基因整合到微生物染色體上是一個(gè)非常有效的方法。為此，許多科學(xué)家研發(fā)了許多質(zhì)粒來(lái)整合基因到染色體上。美國(guó)普渡大學(xué)Haldimann and Wanner (2001)開(kāi)發(fā)了一系列條件復(fù)制整合調(diào)節(jié)(CRIM)質(zhì)粒， 利用該質(zhì)粒可將事先連接到質(zhì)粒上的目的基因，通過(guò)簡(jiǎn)單的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，單拷貝地整合到大腸桿菌染色體上特定的卩遼菌體整合位點(diǎn)上(Haldimann, A. , Wanner, B. L. Journal of Bacteriology. 2001，183 :6384-6393)。但是，利用這些質(zhì)粒整合基因到大腸桿菌的染色體上后，質(zhì)粒上的抗生素抗性篩選標(biāo)記和復(fù)制子仍然保留在染色體上。所構(gòu)建的工程菌仍然存在抗生素抗性篩選標(biāo)記導(dǎo)致環(huán)境中耐藥菌泛濫的問(wèn)題。為克服他們的缺陷，臺(tái)灣Chiang et al.在他們工作的基礎(chǔ)上有開(kāi)發(fā)了一系列用于基因整合的質(zhì)粒，應(yīng)用這些質(zhì)粒同樣可將事先連接到質(zhì)粒上的目的基因，通過(guò)簡(jiǎn)單的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，單拷貝地整合到大腸桿菌染色體上特定的噬菌體整合位點(diǎn)上，而且所得到的工程菌不含抗生素抗性篩選標(biāo)記和復(fù)制子，可用于工業(yè)化生產(chǎn)(Chiang, C. -J. , Chen, P. T. , Chao, Y. P. Biotechnology Bioengineering 2008，101 =985-995)。但是，應(yīng)用上述2個(gè)團(tuán)隊(duì)的質(zhì)粒都只能將目的基因單拷貝地整合到大腸桿菌的染色體上，而實(shí)際工作中往往需要整合多拷貝的基因以提高基因的表達(dá)水平， 從而提高微生物的生產(chǎn)能力。為此，美國(guó)麻省理工學(xué)院Tyod et al.開(kāi)發(fā)了一種可提高整合基因拷貝數(shù)的質(zhì)粒PTGD，利用λ InCh基因組整合技術(shù)，將質(zhì)粒上的目的基因整合到大腸桿菌染色體上后，因質(zhì)粒上攜帶了抗生素抗性基因(與目的基因串列在一起)，可利用所謂的化學(xué)誘導(dǎo)染色體進(jìn)化技術(shù)，提高目的基因在染色體上的拷貝數(shù)(Tyo，K. E. J.，Ajikumar, P. K. , Stephanopoulos, G. Nature Biotechnology 2009,27:760-765)。他們所得到的工程菌雖然基因的拷貝數(shù)因化學(xué)誘導(dǎo)染色體進(jìn)化得到了增加，但是他們使用的基因整合技術(shù)是 λ InCh基因組整合技術(shù)，需要4個(gè)步驟，比較復(fù)雜，整合效率低，而且工程菌仍然含有抗生素抗性篩選標(biāo)記，不適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的是提供一種無(wú)質(zhì)粒、無(wú)抗生素抗性篩選標(biāo)記的生物工程菌的構(gòu)建方法，以及由上述方法構(gòu)建得到的基因工程菌。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種無(wú)質(zhì)粒、無(wú)抗生素抗性篩選標(biāo)記的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟I)將表達(dá)整合酶的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，得到含有輔助質(zhì)粒的宿主細(xì)胞， 所述輔助質(zhì)粒帶有一個(gè)抗生素a抗性篩選基因；2)將目的基因連接到pXKF3T5b載體中，得到含有目的基因的pXKF3T5b載體；3)基因整合將含有目的基因的pXKF3T5b載體轉(zhuǎn)化入含有輔助質(zhì)粒的宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)過(guò)夜；4)輔助質(zhì)粒的去除挑選目的菌落，接入含三氯生的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，取少量上述培養(yǎng)過(guò)夜的細(xì)胞，在含三氯生的LB的平板上劃線分離，培養(yǎng)過(guò)夜，將長(zhǎng)出的單菌落同時(shí)點(diǎn)種到含三氯生、抗生素a的LB的平板上，培養(yǎng)過(guò)夜，挑選只在含三氯生的平板上生長(zhǎng)的菌落；5)抗性篩選基因β的去除挑選只在含三氯生的平板上生長(zhǎng)的紅色菌落，制備化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，然后將質(zhì)粒PCP20轉(zhuǎn)化到制備的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在三氯生+氨芐青霉素的LB平板上，培養(yǎng)過(guò)夜，挑取目標(biāo)菌落，接入含三氯生的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，取少量上述培養(yǎng)過(guò)夜的細(xì)胞，在含三氯生的LB的平板上劃線分離，培養(yǎng)過(guò)夜，將長(zhǎng)出的目標(biāo)單菌落同時(shí)點(diǎn)種到含三氯生、抗生素β、氨芐青霉素的LB的平板上，培養(yǎng)過(guò)夜，只在含三氯生的平板上生長(zhǎng)的紅色菌落就是整合菌；6)三氯生誘導(dǎo)染色體進(jìn)化通過(guò)不斷增加培養(yǎng)基中三氯生的濃度，誘導(dǎo)整合菌染色體進(jìn)化；7)進(jìn)化菌的發(fā)酵篩選將上述耐受不同濃度三氯生的菌種分別接到相應(yīng)濃度的三氯生培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，篩選目標(biāo)產(chǎn)物含量最高的工程菌即為無(wú)質(zhì)粒、無(wú)抗生素抗性篩選基因的生物工程菌。所述pXKF3T5b載體中含有含有2個(gè)FRT位點(diǎn)、抗生素β抗性篩選基因、復(fù)制子 (ori)、噬菌體整合位點(diǎn)(attP)、啟動(dòng)子(P)及其后面的多克隆位點(diǎn)(MCS)和終止子、連接在多克隆位點(diǎn)后的用于誘導(dǎo)染色體進(jìn)化的三氯生抗性基因(fabl)、連接在啟動(dòng)子和三氯生抗性基因(fabl)兩側(cè)的2個(gè)核苷酸序列相同的外源片段Al和A2 ;抗生素a抗性篩選基因與抗生素β抗性篩選基因?yàn)椴煌目剐曰颍也皇侨壬剐曰?fabl)。優(yōu)選的，步驟I)所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。優(yōu)選的，所述輔助質(zhì)粒能表達(dá)噬菌體ΗΚ022、Ρ21、Ρ22、λ或Φ80整合酶(Int)中任一種。優(yōu)選的，所述輔助質(zhì)粒為ρΑΗ121、ρΑΗ69、ρΑΗ123、ρΑΗ130和pINT-ts中任一種。優(yōu)選的，所述輔助質(zhì)粒中的抗生素a抗性篩選基因?yàn)榘逼S青霉素抗性篩選基因， 抗生素a為氨芐青霉素。優(yōu)選的，所述pXKF3T5b載體的結(jié)構(gòu)為在兩個(gè)FRT位點(diǎn)之間的一側(cè)依次含有片段 Al、啟動(dòng)子(P)及其后面的多克隆位點(diǎn)(MCS)、終止子(TTR)、用于誘導(dǎo)染色體進(jìn)化的三氯生抗性基因(fabl)、片段A2、噬菌體整合位點(diǎn)(attP)，在兩個(gè)FRT位點(diǎn)的另一側(cè)則依次含有抗生素β抗性篩選基因和復(fù)制子(如圖I所示)。優(yōu)選的，所述pXKF3T5b載體中的抗生素β抗性篩選基因?yàn)榭敲顾乜剐曰?kan),所述抗生素β為卡那霉素。優(yōu)選的，所述pXKF3T5b載體中的復(fù)制子為大腸桿菌的條件復(fù)制子(ori Ry).優(yōu)選的，所述pXKF3T5b載體中的噬菌體整合位點(diǎn)(attP)為attPHK、attPP21、attPA、 attP$80 和 attPP22 中的任一種。優(yōu)選的，所述pXKF3T5b 載體中的啟動(dòng)子為 PT5、PT7、Pta。、Ptrc> Pla。、PBAD、PLtet> PLlac 等啟動(dòng)子中的任一種。優(yōu)選的，步驟3)的具體操作為將5 μ I含有目的基因的pXKF3T5b載體加入到 100 μ I含有ρΑΗ121的宿主細(xì)胞中，冰上放置30 50分鐘；42°C熱擊90秒，馬上放到冰上 3 5分鐘；補(bǔ)加LB培養(yǎng)液600 μ 1，37。。225rpm搖床培養(yǎng)約45 60分鐘，然后于42 0CzjC 浴搖床中繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘；離心，棄上清液至剩約200 μ 1，滅菌槍頭吹打菌體至均勻；涂布棒涂布到LB平板(含I μ M三氯生和卡那霉素25 μ g/ml)，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。優(yōu)選的，步驟6)的具體操作為挑選只在含三氯生的平板上生長(zhǎng)的菌落，接種到含I μ M三氯生的LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C培養(yǎng)24h，然后轉(zhuǎn)接到含2 μ M三氯生LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C培養(yǎng)24h，剩余菌種制備甘油種于_80°C保存，將耐2μΜ三氯生的菌種繼續(xù)轉(zhuǎn)接到含4 μ M三氯生LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C培養(yǎng)24h，剩余菌種制備甘油種于_80°C保存，重復(fù)上述步驟，直至三氯生濃度為16 μ M為止。本發(fā)明的有益效果在于I)本發(fā)明方法通過(guò)簡(jiǎn)單的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，將目的基因整合到宿主菌的染色體上，然后利用化學(xué)誘導(dǎo)染色體進(jìn)化技術(shù)，將整合基因的拷貝數(shù)進(jìn)化到所需要的拷貝數(shù)，所得到的基因工程菌的篩選標(biāo)記是大腸桿菌本身的fabl基因(編碼烯酰-乙酰基載體蛋白還原酶)， 是三氯生抗性基因，因此所得到工程菌不會(huì)引起環(huán)境中抗生素耐藥菌泛濫，適合于工業(yè)化
生產(chǎn)；2)所構(gòu)建的工程菌因目的基因整合到染色體上，傳代過(guò)程中不會(huì)丟失，遺傳穩(wěn)定性高,生產(chǎn)性能穩(wěn)定。


圖I是本發(fā)明pXKF3T5b質(zhì)粒的物理圖譜；圖2是實(shí)施例I用于基因整合、三氯生誘導(dǎo)染色體進(jìn)化的質(zhì)粒pXKF3T5b的物理3是本發(fā)明的基因工程菌的構(gòu)建流程。
具體實(shí)施例方式下面以構(gòu)建無(wú)質(zhì)粒、無(wú)抗生素抗性篩選標(biāo)記產(chǎn)番茄紅素的工程大腸桿菌為例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。以下實(shí)施例中所采用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、 DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等都采用常規(guī)的方法，具體可參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黃培堂等譯，2002,北京科學(xué)出版社)。以下實(shí)施例中所用到的引物見(jiàn)表I。
權(quán)利要求
1.一種無(wú)質(zhì)粒、無(wú)抗生素抗性篩選標(biāo)記的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟.1)將表達(dá)整合酶的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，得到含有輔助質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，所述輔助質(zhì)粒帶有一個(gè)抗生素a抗性篩選基因；.2)將目的基因連接到pXKF3T5b載體中，得到含有目的基因的pXKF3T5b載體；.3)基因整合將含有目的基因的pXKF3T5b載體轉(zhuǎn)化入含有輔助質(zhì)粒的宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)過(guò)夜；.4)輔助質(zhì)粒的去除挑選目的菌落，接入含三氯生的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，取少量上述培養(yǎng)過(guò)夜的細(xì)胞，在含三氯生的LB的平板上劃線分離，培養(yǎng)過(guò)夜，將長(zhǎng)出的單菌落同時(shí)點(diǎn)種到含三氯生、抗生素a的LB的平板上，培養(yǎng)過(guò)夜，挑選只在含三氯生的平板上生長(zhǎng)的菌落；.5)抗性篩選基因β的去除挑選只在含三氯生的平板上生長(zhǎng)的菌落，制備化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，然后將質(zhì)粒PCP20轉(zhuǎn)化到制備的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在三氯生+氨芐青霉素的LB 平板上，培養(yǎng)過(guò)夜，挑取目標(biāo)菌落，接入含三氯生的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，取少量上述培養(yǎng)過(guò)夜的細(xì)胞，在含三氯生的LB的平板上劃線分離，培養(yǎng)過(guò)夜，將長(zhǎng)出的目標(biāo)單菌落同時(shí)點(diǎn)種到含三氯生、抗生素β、氨芐青霉素的LB的平板上，培養(yǎng)過(guò)夜，只在含三氯生的平板上生長(zhǎng)的菌落就是整合菌；.6)三氯生誘導(dǎo)染色體進(jìn)化通過(guò)不斷增加培養(yǎng)基中三氯生的濃度，誘導(dǎo)整合菌染色體進(jìn)化；.7)進(jìn)化菌的發(fā)酵篩選將上述耐受不同濃度三氯生的菌種分別接到相應(yīng)濃度的三氯生培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，篩選目標(biāo)產(chǎn)物含量最高的工程菌即為無(wú)質(zhì)粒、無(wú)抗生素抗性篩選基因的生物工程菌；所述pXKF3T5b載體中含有含有2個(gè)FRT位點(diǎn)、抗生素β抗性篩選基因、復(fù)制子ipri )、噬菌體整合位點(diǎn)、啟動(dòng)子(P)及其后面的多克隆位點(diǎn)(MCS)和終止子、連接在多克隆位點(diǎn)后的用于誘導(dǎo)染色體進(jìn)化的三氯生抗性基因、fabT)、連接在啟動(dòng)子和三氯生抗性基因ifeibi)兩側(cè)的2個(gè)核苷酸序列相同的外源片段Al和A2 ;抗生素a抗性篩選基因與抗生素β抗性篩選基因?yàn)椴煌目剐曰颍也皇侨壬剐曰騣fabi) 0
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟I)所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述輔助質(zhì)粒能表達(dá)噬菌體ΗΚ022、Ρ21、Ρ22、λ或Φ80整合酶(Int)中任一種，輔助質(zhì)粒上的抗生素a抗性篩選基因?yàn)榘惫?jié)青霉素抗性篩選基因，抗生素a為氨節(jié)青霉素。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述pXKF3T5b載體的結(jié)構(gòu)為兩個(gè)FRT位點(diǎn)的一側(cè)按順時(shí)針?lè)较蛞来魏衅蜛l、啟動(dòng)子(P)及其后面的多克隆位點(diǎn)(MCS)、終止子(TTR)、用于誘導(dǎo)染色體進(jìn)化的三氯生抗性基因Γ/ /)、片段A2、噬菌體整合位點(diǎn)6 巧，在兩個(gè)FRT位點(diǎn)的另一側(cè)則含有抗生素β抗性篩選基因和復(fù)制子。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述pXKF3T5b載體中的抗生素β抗性篩選基因?yàn)榭敲顾乜剐曰騉a/ )，所述抗生素β為卡那霉素。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述pXKF3T5b載體中的復(fù)制子為大腸桿菌的條件復(fù)制子WriR Y)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述pXKF3T5b載體中的曬菌體整合位點(diǎn)iattP)為和aii/k中的任一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述pXKF3T5b載體中的啟動(dòng)子為 Ρ/^、Pfsc、Pfrc、Plac、Pm 、FVtet、FVlac 等啟動(dòng)子中的任一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因工程菌的制備方法，其特征在于，步驟3)的具體操作為 將5μ I含有目的基因的pXKF3T5b載體加入到100 μ I含有ρΑΗ121的宿主細(xì)胞中，冰上放置30 50分鐘；42°C熱擊90秒，馬上放到冰上3 5分鐘；補(bǔ)加LB培養(yǎng)液600 μ 1，37°C 225rpm搖床培養(yǎng)約45 60分鐘，然后于42°C水浴搖床中繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘；離心，棄上清液至剩約200 μ 1，滅菌槍頭吹打菌體至均勻；涂布棒涂布到LB平板(含I μ M三氯生和卡那霉素25 μ g/ml)，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟6)的具體操作為挑選只在含三氯生的平板上生長(zhǎng)的菌落，接種到含I μ M三氯生的LB 液體培養(yǎng)基的試管中，37°C培養(yǎng)24h，然后轉(zhuǎn)接到含2μΜ三氯生LB 液體培養(yǎng)基的試管中，37°C培養(yǎng) 24h，剩余菌種制備甘油種于一 80°C保存，將耐2μΜ三氯生的菌種繼續(xù)轉(zhuǎn)接到含4μ M三氯生LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C培養(yǎng)24h，剩余菌種制備甘油種于-80°C保存，重復(fù)上述步驟，直至三氯生濃度為16 μ M為止。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種無(wú)質(zhì)粒、無(wú)抗生素抗性篩選標(biāo)記的基因工程菌的構(gòu)建方法，該方法以pXKF3T5b質(zhì)粒為載體，將目的基因轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，然后依次通過(guò)表達(dá)整合酶輔助質(zhì)粒的去除、整合載體中的卡那霉素抗性基因的去除、三氯生誘導(dǎo)染色體進(jìn)化和進(jìn)化菌的發(fā)酵篩選等步驟，得到一種無(wú)質(zhì)粒、目的基因拷貝數(shù)高的基因工程菌，且由于pXKF3T5b質(zhì)粒的篩選標(biāo)記是大腸桿菌本身的fabI基因(編碼烯酰-乙酰基載體蛋白還原酶)，是三氯生抗性基因，因此所得到的工程菌無(wú)抗生素抗性篩選標(biāo)記，不會(huì)引起環(huán)境中抗生素耐藥菌泛濫，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。另外，所構(gòu)建的工程菌因目的基因整合到染色體上，傳代過(guò)程中不會(huì)丟失，遺傳穩(wěn)定性高，生產(chǎn)性能穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102604983SQ20121006010
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月8日
發(fā)明者劉紫琦 申請(qǐng)人:劉紫琦