專利名稱：無寡肽的細胞培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及無寡肽的細胞培養基，其包含至少O. 5mg/L的多胺；本發明還涉及在所述包含至少O. 5mg/L的多胺的無寡肽細胞培養基中培養細胞的方法。本發明還涉及在包含至少O. 5mg/L的多胺的培養基中表達至少一種蛋白質的方法，并且涉及在包含至少
O.5mg/L的多胺的培養基中制造至少一種病毒的方法。
背景技術：
為了培養細胞、特別是真核細胞、更具體地說哺乳動物細胞，存在一種固有觀念，就是必須使用配有所需營養物質的專門培養基，這些營養物質用于細胞的有效生長并用于生產生物制品，尤其是生物藥物，例如諸如重組體蛋白、抗體、病毒、病毒抗原以及病毒狀顆粒。為了有效地生產所述生物制品，重要的是達到最佳細胞密度以及本身提高的蛋白質表達，以便獲得最大的產率。細胞培養基配方已經補充有許多添加劑，包括不明確的組分，像胎牛血清(FCS)、數種動物衍生蛋白和/或牛源蛋白質水解物、以及來源于植物或者酵母的蛋白質水解物。通常，血清或者血清衍生物質比如諸如白蛋白、轉鐵蛋白或者胰島素，可能包含不希望有的、可以污染細胞培養基的試劑和由此得到的生物制品。另外，需要對人血清衍生添加劑進行所有已知病毒的測試，包括可以經血清傳播的肝炎病毒和艾滋病病毒HIV。而且，牛血清和其衍生產物承擔著牛海綿樣腦病BSE污染的風險。此外，所有的血清衍生產物可能會被未知的物質污染。當在細胞培養基中使用來源于人或動物的血清或者蛋白質添加劑時，特別是如果該細胞被用于制造給藥于人的藥物或疫苗時，存在許多的問題(例如，不同批次的組合物品質發生變化，并且存在支原體、病毒或牛海綿樣腦病BSE的污染風險)。所以，人們進行了許多嘗試，以提供有效的宿主體系和培養條件，其不需要血清或者其他的動物性蛋白質化合物?；趤碓从谥参锘蚪湍傅牡鞍滋崛∥铮验_發了這樣的無血清培養基。例如，人們熟知的用于發酵工藝并且可以增強許多在合成培養基上不易生長的微生物、酵母和真菌的生長的大豆水解物。專利WO 96/26266描述到，大豆粉的木瓜蛋白酶消化液是碳水化合物的提供源和氮源，并且許多組分可以用于組織培養。Franek等(生物技術進展(2000) 16，688-692)描述了限定的大豆和小麥水解物肽組分的生長和生產率促進效果。WO 96/15231公開了一種無血清培養基，由合成的最低必需培養基和酵母提取物組成，用于脊椎動物細胞的增殖和病毒的生產工藝。在WO 98/15614中公開了一種培養基配方，其由包含大米肽和酵母提取物及其酶消化液的基礎細胞培養基和/或植物脂類組成，用于動物細胞的生長。WO 01/23527公開了一種培養基，其包含精制的大豆水解物，用于重組細胞的培養。WO 00/03000公開了一種培養基，其包含大豆水解物和酵母提取物，但還需要重組體形式的動物性蛋白質比如生長因子的存在。歐洲]專利EP-A-O 481 791描述了一種生物化學限定的用于培養工程菌CHO細胞的培養基，其不含由動物源分離的蛋白質、脂類和碳水化合物，其還包括重組胰島素或者胰島素類似物、1% O. 025% w/v的木瓜蛋白酶消化的大豆蛋白胨和腐胺。專利公開WO 98/08934描述了一種無血清真核細胞培養基，其包含水解大豆肽(I 1000mg/L)，
O.01 lmg/L的腐胺，和多種動物衍生組分包括白蛋白、胎球蛋白、各種激素及其他蛋白質。在上下文中，應當注意，已知標準培養基像DMEM/Ham' s F12中包含O. 08mg/L濃度的腐胺。 然而，植物和/或酵母水解物是寡肽和其他未知組分及雜質的不明確的混合物。另外，市場上可買到的許多水解物的品質變化極大。其結果是，在重組體蛋白或者病毒產品的生產中有很大的變化(高達3倍的變化)，這與使用的許多水解物(“批間偏差”)有關。這種不利因素影響到細胞的增殖以及各細胞的蛋白表達?？傊?，現有技術中已知的培養基補充了來源于動物、植物或酵母的蛋白質或多肽提取物；補充了重組形式的蛋白質，例如諸如胰島素、類胰島素生長因子或者其他生長因子。所以，為克服上述問題，人們很需要一種不含動物、植物和真菌蛋白和/或寡肽的細胞培養基。另外，目前還有一種需要，是提高表達的重組體蛋白產量或者任何其他的表達產品的產量，并且提供一種最佳的細胞培養基，用于生產生物制品比如人用藥物或者疫苗。

發明內容
本發明的一個目的在于提供一種無寡肽的細胞培養基。本發明的另一目在于提供在所述培養基中培養細胞的方法、以及有效表達重組體蛋白的方法，和/或有效生產病毒的方法。本發明的另一個目的在于除去動物、植物和/或酵母衍生水解物，從而提供不包含任何添加的補充蛋白質或寡肽的培養基。發明人驚訝地發現，在細胞培養基中添加至少O. 5mg/L的多胺可以帶來有益效果，不僅會促進細胞生長而且會提高單位細胞的蛋白質和/或病毒表達量。甚至在無寡肽的培養基中也可以取得所述料想不到的有益效果。進一步地，根據本發明的無寡肽培養基使得細胞生長保持一致，并且可以提高預期產物特別地是靶蛋白質比如重組體蛋白和/或病毒的產量，而與任何蛋白質水解物的品質或批次變化無關。細胞培養基中特定濃度多胺的具體補充具有提高細胞生長率、細胞比生產率和細胞最終密度的作用。因此，與本技術領域已知的培養基相比，根據本發明的培養基更有利于重組體蛋白表達、病毒生產和細胞生長速度。另外，根據本發明的無寡肽培養基免除了在細胞培養基中添加蛋白質水解物。


圖I為一圖，顯示了 GD8/6細胞在BAV培養基中培養時，在培養期間內2. Omg/L腐胺二鹽酸鹽的添加對體積FVIII-CoA生產率的影響，其中，體積FVIII-CoA生產率表示為[單位U/升L/天D]，培養時間表示為[天]。箭頭處為11天，腐胺二鹽酸鹽的添加量為(2. Omg/L)。
圖2為一表，顯示了 GD8/6細胞在BAV培養基中培養時，視需要與鐵(II)和銅(II)的附加補充組合使用的腐胺的添加共同對體積生產率(QP，表示為[單位Π/升L/天2]和細胞比生產率(qp，表示為[mU/106個細胞/天])、以及比生長速率μ (cf1，表示為單位生長率/天)的影響比較。
圖3為一表，其顯示了 GD8/6細胞在BAV培養基中培養時，腐胺和/或鳥氨酸對比生長速率(μ絕對值、μ相對值)和細胞比生產率(qp絕對值，表示為[mU/ΙΟ6個細胞/天；qp相對值，表示為％)的影響的比較。
圖4為一表，顯示了 GD8/6細胞在BAV培養基中培養時，腐胺和精胺對比生長速率(μ絕對值，μ相對值)和細胞比生產率(qp絕對值，qp相對值)的影響的比較。
圖5是一表，顯示了 GD8/6細胞在BAV培養基中培養時，腐胺和乙醇胺對比生長率(μ絕對值，μ相對值)和細胞比生產率(qp絕對值，qp相對值)的影響比較。
圖6所示為一圖，描述了 3. 6mg/L腐胺二鹽酸鹽的添加對平均MVA病毒滴度的影響，其中滴度表示為[TCID50/mLxl08]；-:未添加腐胺；Putr :添加了 3. 6mg/L的腐胺二鹽酸鹽。
圖7所示為一圖，描述了各種濃度的腐胺二鹽酸鹽的添加對平均MVA病毒滴度的影響，其中用[mg/L]表示濃度；用[TCID50/mLxl08]表示滴度。
具體實施例方式本發明的一個方面涉及一種包含至少O. 5mg/L的多胺的無寡肽細胞培養基。除非另作說明，本申請文件中的濃度值指的是游離堿形式的組分濃度。術語“多胺”指的是源于生物的多胺的任何基團，其是芳香族或者陽離子氨基酸衍生的有機聚陽離子。多胺由碳、氮和氫組成，并且包含兩個以上氨基基團。多胺具有一個以上正電荷和疏水性構架。該術語包含，例如，選自尸胺、腐胺、亞精胺、精胺、胍基丁胺、鳥氨酸及其組合物的分子。在本發明的一個具體實施方式
中，無寡肽的培養基包含鳥氨酸、或腐胺、或精胺、或其組合物。在根據本發明的無寡肽的細胞培養基的另一個實施方式中，多胺來源于非蛋白質水解物的提供源。在一種實施方式中，多胺通過合成方式制造。在本發明的一個具體實施方式
中，多胺濃度至少為約O. 5mg/L ;在另一個實施方式中，多胺濃度至少為約lmg/L ;在另一種實施方式中，多胺濃度至少為約2mg/L ;在再一個實施方式中，多胺濃度至少為5mg/L ;在另一個實施方式中，多胺濃度至少為8mg/L ;并且在又一種實施方式中，多胺濃度至少為10mg/L。在本發明的一個具體實施方式
中，培養基中的多胺濃度范圍為約O. 5 30mg/L，在另一個實施方式中為約O. 5 20mg/L,在又一種實施方式中為約I. O 20mg/L,在再一種實施方式中為約2. O 20mg/L,在另一種實施方式中為約2 10mg/L,在再一實施方式中為約2 8mg/L,并且在另一種實施方式中為約2 5mg/L。如上所述濃度是純多胺的各自濃度。如果使用多胺衍生物或包含化合物的多胺，那么多胺基團的濃度在上述特定范圍內。例如，2mg/L腐胺二鹽酸鹽相當于約I. 095mg/L的腐胺濃度(無2HC1)。
根據本發明的術語“無寡肽的細胞培養基”，指的是無蛋白質的培養基，其不包含寡肽比如來源于蛋白質水解物的寡肽。在一種實施方式中，培養基不包含具有二十個以上氨基酸的寡肽。在本發明的一個實施方式中，培養基不包含具有十五個以上氨基酸的寡肽。在本發明的另一個實施方式中，培養基不包含具有十個以上氨基酸的寡肽。在一種實施方式中，培養基不包含具有七個以上氨基酸的寡肽；在另一個實施方式中，培養基不包含具有五個以上氨基酸的寡肽；在再一個實施方式中，培養基不包含具有三個以上氨基酸的寡肽。根據本發明的另一個實施方式，培養基不包含具有兩個以上氨基酸的寡肽。根據本發明的培養基可以可選地包含谷胱甘肽和/或至少一種穩定形式的谷氨酰胺，例如，L-丙氨酰-L-谷氨 酰胺。在此使用的術語“谷胱甘肽”描述了一種由氨基酸谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽，包括氧化型谷胱甘肽，即，二硫化谷胱甘肽，其為在氧化過程中通過在半胱氨酸巰基側鏈之間的二硫鍵形成的谷胱甘肽二聚物。在本發明的實施方式中，無寡肽的細胞培養基不包含具有三個以上氨基酸的寡肽，但可可選地包含谷胱甘肽。在另一個實施方式中，無寡肽的細胞培養基不包含具有兩個以上氨基酸的寡肽，但可可選地包含谷胱甘肽和/或至少一種穩定形式的谷氨酰胺。在根據本發明的培養基中，要避免的典型的蛋白和/或寡肽是那些在血清和血清衍生物中發現的蛋白和/或寡肽，比如，諸如白蛋白、轉鐵蛋白、胰島素或其他的生長因子、以及其重組體形式、或者是源于植物或酵母水解物的寡肽或其超濾形式。根據本發明的無寡肽的培養基可以基于任何通常為本領域的技術人員所熟知的基礎培養基，比如DMEM'Ham' s F12,Medium 199、McCoy或RPMI。該基礎培養基可以包含許多成分，包括氨基酸、維生素、有機鹽和無機鹽、以及碳氫化合物源，各個成分的含量應能維持細胞的培養，所述含量通常已為本領域的技術人員所熟知。該培養基可以包含輔助性物質，比如，緩沖物質例如碳酸氫鈉、抗氧化劑、抵消機械應力的穩定劑、或蛋白酶抑制劑。視需要，可以添加非離子型表面活性劑例如聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物和/或混合物(例如 Pluronic F68 , SERVA 公司)。在根據本發明的培養基的實施方式中，多胺控制著DNA合成和RNA合成、和/或細胞增殖、和/或細胞分化、和/或細胞膜穩定性、和/或抗氧化性DNA保護。在一種實施方式中，向無寡肽的細胞培養基中添加至少O. 5mg/L的多胺提高了在培養細胞中的蛋白質和/或病毒表達。在另一個實施方式中，通過在無寡肽的細胞培養基中添加至少O. 5mg/L的多胺，可以將培養細胞中的蛋白質表達或者病毒滴度提高至少50%。在再一個實施方式中，所述提高是至少60%。在又一個實施方式中，通過在無寡肽的細胞培養基中添加至少O. 5mg/L的多胺，將細胞比生產率提高至少兩倍；在另一個實施方式中，細胞比生產率提高至少三倍。在再一個實施方式中，添加至少O. 5mg/L的多胺會導致蛋白質表達和/或病毒滴度提高到至少400%;在另一個實施方式中，提高到至少500%;在另一個實施方式中，提高到至少600% ;在另一種實施方式中，提高到至少700%。在一種實施方式中，通過在無寡肽的細胞培養基中添加至少O. 5mg/L的多胺，培養細胞的比生長速率可以被提高。在另一種實施方式中，所述比生長速率可以被提高10%。在再一個實施方式中，所述比生長速率可以被提高20%。在又一個實施方式中，所述比生長速率可以被提聞50%。在另一種實施方式中，所述比生長速率可以被提聞70%。在另一個實施方式中，所述比生長速率可以被提高80 %。在再一個實施方式中，所述比生長速率可以被提高90 %。在又一個實施方式中，所述比生長速率可以被提高100 %。在本發明的另一個實施方式中，對培養基以化學方法進行限定。在此使用的術語“以化學方法進行限定”指的是，培養基不包含任何不明確的補充物，比如，諸如動物組成部分、器官、腺體、植物、或酵母的提取物。因此，需要對以化學方法進行限定的培養基各組分進行精確地限定。本發明進一步涉及一種培養細胞的方法，包括下述步驟
(a)提供根據本發明的無寡肽的細胞培養基，以及
(b)在培養基中增殖細胞從而形成細胞培養物。本發明不局限于任何類型的細胞。細胞類型的例子包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、鳥類的細胞、細菌細胞、和酵母細胞。該細胞可以是例如干細胞、或用重組基因表達用載體轉化的重組細胞、或者用制造病毒產物用病毒轉染的細胞。該細胞也可以是，例如，生產所研究蛋白質的未進行重組轉化的細胞，例如產生抗體的B細胞，其可以例如通過類似Epstein Barr病毒感染的病毒感染而轉化成無限增殖狀態。該細胞也可以是例如初級細胞，例如雞胚細胞、或者原發細胞系。用于體外病毒生產的細胞是有用的。有用的細胞的具體例子包括BSC細胞、LLC-MK細胞、CV-I細胞、COS細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、RK細胞、TCMK-I細胞、LLCPK細胞、PK15細胞、LLC-RK細胞、MDOK細胞、BHK-21細胞、CHO細胞、NS-I細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、BHK細胞、293細胞、RK細胞、Per C6細胞、和雞胚細胞。根據本發明使用的細胞可以通過例如選自于分批培養、補料分批培養、灌注培養、和恒化培養的方法進行培養，所有這些方法通常是本技術領域所熟知的。本發明進一步涉及一種用于表達至少一種蛋白質比如異源蛋白或自體蛋白、或重組體蛋白的方法，包括下述步驟
a)提供細胞培養物；
b)將包含編碼至少一種蛋白質的序列的至少一種核酸序列導入所述細胞；
c)選擇攜帶所述核酸序列的細胞；以及
d)在包含至少O.5mg/L的多胺的培養基中表達細胞中的蛋白質。在本發明的一種實施方式中，步驟d)的培養基是根據本發明的無寡肽的培養基。在本發明的另一種實施方式中，步驟a)的細胞培養物已經在根據本發明的無寡肽的細胞培養基中進行過培養。在另一個實施方式中，步驟a)至d)在根據本發明的無寡肽的細胞培養基中進行。該包含至少一種蛋白質編碼序列的核酸序列可以是載體。該載體可以通過病毒傳遞，或者可以是質粒。該用于編碼蛋白質的核酸序列可以是特異基因或其生物學功能部分。在一種實施方式中，該蛋白質至少是凝血因子如Factor VIII的生物學活性部分，或者至少是包含在紅血球和血管生成素的產物中的蛋白質例如促紅細胞生成素的生物學活性部分，或者是單克隆抗體。在一種實施方式中，所述核酸序列包含編碼至少一種蛋白質的序列，該蛋白質選自于由凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、VffF, ADAMTS13和弗林蛋白酶所構成的
組。、
在本發明的一種實施方式中，該核酸還包括其他適合于控制蛋白質表達的序列，比如啟動子序列、增強子、TATA框、轉錄起始位點、多聚接頭、限制酶切位點、聚A序列、蛋白質加工序列、選擇性標記等，它們通常已為本領域的技術人員所熟知。在本發明的一個具體實施方式
中，細胞選自于由CHO細胞、293細胞、和BHK細胞所構成的組。根據本發明的另一個實施方式，可以用重組載體轉化下述細胞系以便用于表達各產物用于生產重組凝血因子例如Fact or VII、和/或Factor VIII、和/或單克隆抗體的CHO細胞；用于生產重組紅細胞生成素的Epstein Barr病毒轉化BHK細胞；用于人抗體生產的無限增殖人B細胞。有用的細胞/蛋白質組合例如是CH0細胞/凝血因子VIII、CHO細胞/凝血因子￥11、010細胞/^0410^13、010細胞/弗林蛋白酶、和293細胞/凝血因子IX。在本發明的另一個實施方式中，與通過不在本發明培養基中培養的細胞進行的蛋白質表達相比，至少一種通過在根據本發明的培養基中培養的細胞所進行的蛋白質表達得到提聞。在另一個實施方式中，所述表達提聞至少10% ;根據另一種實施方式，提聞至少50%。本發明還涉及一種用于生產至少一種病毒或病毒的至少一部分的方法，包括下述步驟
a)提供細胞培養物；
b)用至少一種病毒感染該細胞；
c)選擇受病毒感染的細胞；以及
d)在包含至少O.5mg/L的多胺的培養基中于細胞內增殖至少一種病毒。在本發明的一種實施方式中，步驟d)的培養基是根據本發明的無寡肽的培養基。在本發明的另一種實施方式中，步驟a)的細胞培養物已經在根據本發明的無寡肽的細胞培養基中進行過培養。在另一個實施方式中，步驟a)至d)在根據本發明的無寡肽的細胞培養基中進行。用于根據本發明的方法中的病毒可以是任何病毒，例如痘病毒，比如牛痘或者減毒牛痘病毒；冠狀病毒，例如SARS病毒；正粘病毒，例如流行性感冒A或B病毒；副粘病毒；反向病毒，例如慢病毒；披膜病毒，例如羅斯河病毒；黃病毒，例如西尼羅河病毒，黃熱病毒，或者FSME病毒(即蜱傳腦炎病毒)；腸道病毒，例如甲型肝炎病毒；細小核糖核酸病毒；嵌沙樣病毒；皰疫病毒；或者腺病毒。在本發明的一個實施方式中，病毒是修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)。該病毒可以根據本發明進行增殖，用于各疫苗的生產。病毒可以是野生型-病毒、減毒病毒、重排病毒、或重組細胞病毒或其組合物，例如減毒體和重組體。另外，可以使用感染性核酸克隆，以代替用病毒感染細胞的所用實際病毒子。也可以使用裂解的病毒子?？梢允褂糜糜谏a病毒的方法來生產包含病毒、病毒抗原或病毒類顆粒的免疫原組成物。用于根據本發明的生產病毒的方法中的細胞可以選自于由哺乳動物細胞、昆蟲細胞、鳥類細胞、細菌細胞、和酵母細胞所構成的組。在一種實施方式中，用于根據本發明的生產病毒的方法中的細胞選自于由VeiO細胞和雞胚細胞所構成的組。
用于生產病毒或病毒一部分的細胞與病毒的有用組合是，例如=VeiO細胞/減毒牛痘、Vero細胞/牛痘、Vero細胞/甲型肝炎、Vero細胞/流感病毒、Vero細胞/西尼羅河病毒、VeiO細胞/SARS病毒、VeiO細胞/黃熱病毒、以及雞胚細胞/FSME病毒。在本發明的一種實施方式中，細胞/病毒組合是雞胚細胞/修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)。有用的培養方法包括分批培養、補料分批培養、灌注培養和恒化培養。以下用實施例進一步闡明本發明，但并不限制本發明。
實施例
實施例I :BAV培養基的制備
用包含無機鹽、氨基酸、維生素及其他組分的基本DMEM/Ham' s F12(l I)培養基(Life technologies公司，32500粉末)，制備無寡肽的培養基(BAV培養基)。還添加了L-谷氨酰胺(600mg/L)、抗壞血酸(20 μ Μ)、乙醇胺(25 μ M)、Synperonic (SERVA) (0. 25g/L)、亞硒酸鈉(50nM)。另外將下述必需氨基酸補充至細胞培養基一水L-天冬酰胺20mg/L、一水L-半胱氨酸鹽酸鹽15mg/L、L-胱氨酸二鹽酸鹽20mg/L、L_脯氨酸35mg/L、L_色氨酸 20mg/L。
實施例2 :測定細胞數
可以用如 Schaerfe 等在文獻 Biotechnologie in LaborPraxis 10:1096-1103(1988)中所述的CASY 細胞計數器通過計數確定懸浮細胞或固定化細胞的細胞數；也可以通過朽1檬酸萃取和細胞核突光染色、接著用Nucleo Counter (Chemometec公司，丹麥)通過計數來測定細胞數。根據某一時間段⑴內懸浮細胞恒化培養物穩態下的細胞密度(Xt)增加值和/或稀釋率(D)，按照下述公式計算出比生長速率(μ ):μ = D+In(Xt/XO) /1實施例3 =FVIII活性的測定
通過顯色分析(Chromogenic，瑞典)測量凝血因子VIII (FVIII)的活性(參見圖I至5)。
實施例4 :體積生產率(QP)和細胞比生產率(qp)的計算
由生產體系中每天每升反應器體積產生的活性單位量(U/L/d)計算出體積生產率(QP)。
細胞比生產率(qp)被定義為每天每細胞數的蛋白特定生產量(U或者yg)。
實施例5 :細胞大規模培養條件
將重組體哺乳動物細胞(例如穩定表達Factor VIII的CHO細胞，比如⑶8/6細胞)的細胞培養物加入IOL生物反應器，在恒化培養基懸浮液中生長。恒定保持培養條件為37°C、氧飽和度20%、并且pH 7. O至7. I。培養基中恒定補料BAV培養基。
實施例6 :多胺的添加對FVIII表達的影響
如實施例5中描述的那樣，將GD8/6細胞加入IOL生物反應器，在恒化培養基中進行培養。連續進料BAV培養基培養11天后，導致生產率降低至100U/L/d。通過添加腐胺二鹽酸鹽(2mg/L)，體積FVIII表達量提高800% (參見圖I)。因此，對于⑶8/6細胞系而言，腐胺可以清楚地確定為細胞特異表達的驅動因子。
實施例7 :多胺和鐵(II)及銅(II)的添加對FVIII表達的影響
如在實施例5中描述的那樣，將GD8/6細胞在IOL生物反應器中進行恒化培養，直至、平均生產率為271U/L/D，同時細胞比生產率和比生長速率較低。通過添加腐胺二鹽酸鹽(2mg/L)，FVIII表達量增加到870U/L/D，這主要是因為細胞比生產率被提高。以不同于原來包含在大豆水解物中的典型濃度而額外補充的鐵(II)和銅(II)導致了比生長速率提高大約至O. 60CT1，并且可以實現將細胞的比生產率提高至高于1700mU/106個細胞/天。在這些條件下，高于2685U/L/D的體積生產率被獲得。進一步地，細胞密度的提高導致體積生產率超過3000U/L/D。在可比的發酵條件下，使用包含培養基的大豆水解物時的最大體積生產率是2000 2500U/L/D，表明僅包含腐胺和2種附加金屬離子的以化學方法進行限定的培養基優于以前該工藝中任何包含被研究的培養基配方的大豆水解物(參見圖2)。
實施例8 :細胞小規模培養條件
在工作容積為200mL的Techne旋轉燒瓶中，在37°C，不控制pH和p02的條件下，以分批補料形式用GD8/6細胞進行懸浮培養的小規模實驗。該培養基中供給如上限定的BAV培養基，另外補充有腐胺二鹽酸鹽、鳥氨酸鹽酸鹽、精胺四鹽酸鹽、或乙醇胺、或其組合物，補充物的濃度范圍為0-18mg/L(相當于0-10mg/L的非鹽酸鹽形式的生物胺(參見圖3至5)。
實施例9 :數種多胺和多胺組合物的添加對FVIII表達的影響
將如在實施例8中描述的用BAV培養基培養的GD8/6細胞進行離心，接著轉移到工作容積為200mL的Techne旋轉燒瓶中，并且用限定的培養基以約1-2E06個細胞/mL的細胞密度培養，該培養基中補充有如圖3、4和5中所示的乙醇胺、腐胺、鳥氨酸、和/或精胺。作為生物胺路徑中腐胺的前體的鳥氨酸可以以依賴濃度的方式部分地代替腐胺。將不同濃度的鳥氨酸添加至包含腐胺二鹽酸鹽的培養基中，導致比FVIII生產率和比生長速率的額外提高(參見圖3)。然而，不是根據本發明的多胺的乙醇胺，既不能以任何研究的濃度代替腐胺，而且在包含腐胺的培養基中乙醇胺濃度的提高也不能導致體積生產率和比生長速率的顯著提高(參見圖5)。在相似條件下的進一步實驗顯示，作為生物胺路徑中的另一個中間體的精胺也可以以依賴濃度的方式代替腐胺(參見圖4)。
實施例10 :多胺的添加對MVA病毒生產的影響
將雞胚的初級細胞培養物加入Techne旋轉燒瓶(工作容積200mL)，使用未補充或補充了 3. 6mg/L腐胺二鹽酸鹽的無肽的培養基(FM培養基)進行培養。
用包含無機鹽、氨基酸、維生素及其他組分的基本M199培養基(Life technologies公司，31150粉末)，制備了 FM培養基。還添加了 NaHCO3 (添加量4. 4g/L)，硫酸慶大霉素(50 μ g/L)和硫酸新霉素(50 μ g/L)。
用MVA病毒感染細胞培養物，并且在TCID50試驗中分析上清液的病毒滴度。通過添加腐胺，平均病毒滴度(各樣品η = 16個)可以提高大約50% (參見圖6)。
實施例11 :數個劑量的多胺的添加對MVA病毒生產的影響
將雞胚的初級細胞培養物加入Techne旋轉燒瓶(工作容積200mL)，使用未補充或補充了 3. 6mg/L和9mg/L腐胺二鹽酸鹽的無肽的培養基(CEM培養基)進行培養。
用包含無機鹽、氨基酸、維生素及其他組分的基本DMEM/Ham' s F12(l I)培養基(Life technologies 公司，32500 粉末)，制備 CEM 培養基。還添加了 NaHCO3 (2g/L)、L_ 谷氨酰胺(600mg/L)、抗壞血酸(20 μ Μ)、乙醇胺(25 μ Μ), Synperonic (SERVA 公司)(O. 25g/L)、亞硒酸鈉(50nM)、FeSO4 ·7Η20(600 μ g/L)、硫酸慶大霉素(50 μ g/L)和硫酸新霉素(50 μ g/L)。另外將必需氨基酸補充至細胞培養基。另外將下述必需氨基酸補充至細胞培養基一水L-天冬酰胺20mg/L、一水L-半胱氨酸鹽酸鹽15mg/L、L_胱氨酸二鹽酸鹽20mg/L、L_脯氨酸 35mg/L、L-色氨酸 20mg/L。
用MVA病毒感染細胞培養物，并且在TCID50試驗中分析上清液的病毒滴度。通過添加 9mg/L腐胺，平均病毒滴度(各樣品η = 4個)可以提高大約60% (參見圖7)。
權利要求
1.一種無寡肽的細胞培養基，其包含至少O. 5mg/L的多胺。
2.如權利要求I所述的無寡肽的細胞培養基，其特征在于，所述多胺選自于由尸胺、腐胺、亞精胺、精胺、胍基丁胺、鳥氨酸及其組合物所構成的組。
3.如權利要求I所述的無寡肽的細胞培養基，其特征在于，所述多胺通過合成方式制造。
4.如權利要求I所述的無寡肽的細胞培養基，其特征在于，所述多胺以約O.5 30mg/L的濃度存在于所述培養基中。
5.如權利要求I所述的無寡肽的細胞培養基，其特征在于，所述培養基不包含具有二十個以上氨基酸的寡肽。
6.如權利要求I所述的無寡肽的細胞培養基，其特征在于，所述培養基不包含具有三個以上氨基酸的寡肽，可選地包含谷胱甘肽。
7.如權利要求I所述的無寡肽的細胞培養基，其特征在于，所述培養基不包含具有兩個以上氨基酸的寡肽，可選地包含谷胱甘肽和/或至少一種穩定形式的谷氨酰胺。
8.如權利要求I所述的無寡肽的細胞培養基，其特征在于，所述培養基以化學方法進行限定。
9.一種用于培養細胞的方法，包括下述步驟 (a)提供如權利要求I所述的無寡肽的細胞培養基，以及 (b)在培養基中增殖細胞從而形成細胞培養物。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述細胞選自于由哺乳動物細胞、昆蟲細胞、鳥類細胞、細菌細胞、和酵母細胞所構成的組。
11.一種用于表達至少一種蛋白質的方法，包括下述步驟 (a)提供細胞培養物； (b)將至少一種包含編碼至少一種蛋白質的序列的核酸序列導入所述細胞； (c)選擇攜帶所述核酸序列的細胞；以及 (d)在包含至少O.5mg/L的多胺的培養基中表達細胞中的蛋白質。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述培養基是如權利要求I所述的無寡肽的培養基。
13.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述蛋白質選自于由凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、VffF, ADAMTS13和弗林蛋白酶所構成的組。
14.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述細胞是CHO細胞、293細胞或BHK細胞。
15.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述細胞/蛋白質組合選自于由CHO細胞/凝血因子VII、CH0細胞/凝血因子VIII、CH0細胞/ADAMTS13、CH0細胞/弗林蛋白酶、和293細胞/凝血因子IX所構成的組。
16.一種用于生產至少一種病毒的方法，包括下述步驟 (a)提供細胞培養物； (b)用至少一種病毒感染所述細胞； (C)選擇受病毒感染的細胞；以及 (d)在包含至少O. 5mg/L的多胺的培養基中于細胞中增殖所述至少一種病毒。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述培養基是如權利要求I所述的無寡肽的培養基。
18.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述病毒選自于由痘病毒、冠狀病毒、正粘病毒、副粘病毒、反向病毒、披膜病毒、黃病毒、腸道病毒、細小核糖核酸病毒、嵌沙樣病毒、皰疹病毒、以及腺病毒所構成的組。
19.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述病毒選自于由牛痘病毒、SARS病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、慢病毒、羅斯河病毒、西尼羅河病毒、黃熱病毒、FSME病毒、以及甲型肝炎病毒所構成的組。
20.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述細胞是Veix)細胞或雞胚細胞。
21.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述細胞/病毒組合選自于由VeiO細胞/減毒牛痘、Vero細胞/牛痘、Vero細胞/甲型肝炎、Vero細胞/流感病毒、Vero細胞/西尼羅河病毒、Vero細胞/SARS病毒、Vero細胞/黃熱病毒、雞胚細胞/FSME病毒、以及雞胚細胞/修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)所構成的組。
全文摘要
本發明涉及無寡肽的細胞培養基，其包含至少0.5mg/L的多胺；本發明還涉及在所述包含至少0.5mg/L的多胺的無寡肽細胞培養基中培養細胞的方法。本發明還涉及在包含至少0.5mg/L的多胺的培養基中表達至少一種蛋白質的方法，并且涉及在包含至少0.5mg/L的多胺的培養基中制造至少一種病毒的方法。
文檔編號C12N5/071GK102643777SQ20121006038
公開日2012年8月22日 申請日期2007年1月3日 優先權日2006年1月4日
發明者利奧波德·格里伯格, 曼弗雷德·賴特, 沃爾夫岡·蒙特, 阿圖爾·米特雷爾 申請人:巴克斯特保健股份有限公司, 巴克斯特國際公司