專利名稱：一種白唇竹葉青蛇毒中提取磷脂酶A₂的方法
技術領域：
本發明屬于生物提取領域，具體的說，涉及從一種白唇竹葉青蛇毒中提取磷脂酶 A2的方法。
背景技術：
磷脂酶Adphospholipase A2, PL A2)廣泛存在于蛇毒、蜂毒和蝎毒的動物毒液以及哺乳動物的胰腺液中，它是一種Ca2+依賴性酶，能專一的催化甘油磷脂的第二位脂酰鍵的水解，生成溶血磷脂和脂肪酸。該酶主要由一類結構相似、分子量在14KDa左右的蛋白家族組成，一般含有6到7對二硫鍵。磷脂酶A2幾乎存在于所有毒蛇的毒液中，除了酶活性夕卜，還具有多種生理、藥理作用，如心臟毒，細胞毒，肌肉毒，神經毒和神經生長因子等，并有抗凝血、溶血、降血壓、抗血小板聚集、誘導形成水腫及引起驚厥等作用。此外，磷脂酶A2還具有抑制細菌生長、誘導細胞凋亡和阻值HIV病毒進入宿主細胞的功能，是研究生物膜、月旨蛋白中磷脂結構和酶的非均相催化機理的重要工具酶。從20世紀50年代首次對眼鏡蛇蛇毒的磷脂酶A2進行研究開始(Wittcoff et al, 1951)，迄今已有100多種磷脂酶A2被純化出來，各種實驗表明不同種類的毒蛇含有的磷脂酶A2不盡相同，即使是同一種類的毒蛇，也可能由于生存環境的不同，而導致毒液中的磷脂酶A2的結構和活性有較大的差異。磷脂酶 A2這種特有的化學性質和復雜的生理功能，不僅對其進行生物學研究、結構特征及毒理研究具有重大的理論意義，而且作為藥物在治療腫瘤、心血管疾病等方面也有著重要的應用前景。白唇竹葉青為有毒蛇，主要見于廣州、四川、貴州、廣西、福建、云南等地。白唇竹葉青蛇毒屬于血液循環毒，因為其排毒量較小，人被咬傷后不會馬上致命，但是如果不及時采取治療措施，也會有生命危險。被白唇竹葉青咬傷后，傷者多表現為傷口劇烈疼痛，流血不止，患肢周圍紅腫，局部地方還會出現水皰、血皰，嚴重者還有可能出現吐血、便血等癥狀。 近年來對其毒液的研究報道主要有降纖酶、類凝血酶、5’ -核苷酸酶等，尚未有報道從白唇竹葉青蛇毒中分離制備磷脂酶A2的方法及其磷脂酶A2酶學性質的研究。

發明內容
為解決以上技術問題，本發明的目的在于提供一種白唇竹葉青蛇毒中提取磷脂酶 A2的方法。本發明目的是這樣實現的一種白唇竹葉青蛇毒中提取磷脂酶A2的方法，其特征在于按如下步驟進行(1)白唇竹葉青蛇毒預處理收集毒液，將毒液冷凍干燥成粉末狀備用，取粗毒凍干粉0. 3 Ig,溶解于5ml pH 5. 2-5. 8,0. 025 0. 05mol醋酸鈉緩沖液中，冷凍離心，取上清液待用；(2) CM-Sephadex C-50 陽離子交換層析用 pH 5. 2-5. 8,0. 025 0. 05mol/L 醋酸鈉緩沖液平衡CM-kphadex C_50陽離子層析柱；將步驟(1)中上清液上樣，用濃度范圍在0 0. 5mol/L NaCl的上述緩沖液梯度洗脫，檢測波長280nm，流速0. 5 lml/min，收集 :3ml/管，收集活性最強的峰I，冷凍干燥；(3) Sephadex G-75 凝膠層析用 pH 7. 5 8. 0，0. 01 0. 03mol/L Tris-HCl buffer平衡kphadex G_75柱，將步驟( 中收集的凍干樣品用相同緩沖液溶解后上樣，檢測波長280nm，流速0. 15ml/min，收集^iil/管，測各峰磷脂酶活性，收集活性最強的峰IV， 冷凍干燥；(4) Q-Sepharose FF預裝柱層析用 pH 7. 5 7. 8，0. 02 0. 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液平衡Q-kpharose FF預裝柱，將步驟(3)中制得凍干樣品用上述緩沖液溶解后上樣，用濃度范圍在0 0. 5mol/L NaCl的上述緩沖液梯度洗脫，流速lml/min，lml/管，收集活性峰II，冷凍干燥即得純品。上述步驟(1)中采用咬皿擠壓法收集毒液，其中冷卻離心采用3000 5000r/min 離心10 15min。層析過程中均檢測OD^Onm吸光值，采用卵黃平板法測定磷脂酶活性。采用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量大小。采用卵黃平板測定磷脂酶A2活性稱取瓊脂糖0. 15g，加到IOOml含lmol/L NaCl, 0. 005M/L CaC12的溶液中，高溫滅菌15min，取新鮮雞蛋，乙醇無菌取蛋黃液。滅菌完后，等降溫至50°C后，按每IOOml培養基加蛋黃液細1充分混勻后，鋪板，待膠凝固后，打孔器打孔，每孔加入IOul待測樣品，50°C放置20h，觀察平板是否出現透明圈，如果有磷脂酶A2活性，就會出現透明圈；如果沒有，則不會出現透明圈。有益效果本發明從白唇竹葉青蛇毒中分離提取出了一種磷脂酶A2，制備方法簡單、便于操作、成本低廉，且所得磷脂酶A2純度較高。說明書附1為CM-kphadex C-50陽離子交換層析圖譜；圖2為kphadex G-75凝膠層析圖譜；圖3為Q-kpharose FF預裝柱層析圖譜；圖4為本發明制備磷脂酶A2的SDS-PAGE圖譜。
具體實施例方式實施例1(1)白唇竹葉青蛇毒預處理采用咬皿擠壓法收集毒液，將毒液冷凍干燥成粉末狀備用，取粗毒凍干粉0. 3g，溶解于5ml pH 5. 2，0. 025mol/L醋酸鈉緩沖液中，3000 5000r/min冷凍離心10 15min，取上清液待用。(2) CM-Sephadex C-50陽離子交換層析用pH 5. 2,0. 025mol/L醋酸鈉緩沖液平衡CM-kphadex C_50陽離子層析柱；將步驟(1)中上清液上樣，用濃度范圍在0 0. 5mol/ L NaCl的上述緩沖液梯度洗脫。檢測波長JSOnm，流速lml/min，收集:3ml/管(參看圖 1)。收集活性最強的峰I，冷凍干燥。(3) Sephadex G-75 凝膠層析用 pH 7. 5,0. 25mol/L Tris-HCl buffer 平衡 Sephadex G_75柱，將步驟O)中收集的凍干樣品用相同緩沖液溶解后上樣，檢測波長 280nm，流速0. 15ml/min，收集aiil/管(參看圖2)。測各峰磷脂酶活性，收集活性最強的峰IV，冷凍干燥。
(4) Q-Sepharose FF 預裝柱層析用 pH 7. 5,0. 25mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液平衡 Q-Sepharose FF預裝柱。將步驟(3)中制得凍干樣品用上述緩沖液溶解后上樣，用濃度范圍在O 0. 5mol/L NaCl的上述緩沖液梯度洗脫，流速lml/min，lml/管(參看圖3)。收集活性峰II，冷凍干燥即得純品。
(5)分子量測定使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為12%。結果如圖 4所示，經上述純化步驟，樣品顯示為一條蛋白帶，分子量為17200道爾頓。
實施例2
(1)白唇竹葉青蛇毒預處理采用咬皿擠壓法收集毒液，將毒液冷凍干燥成粉末狀備用，取粗毒凍干粉lg，溶解于5ml pH 5. 8,0. 03mol/L醋酸鈉緩沖液中，5000r/min冷凍離心15min，取上清液待用。
(2) CM-Sephadex C-50陽離子交換層析用pH 5.8,0. 03mol/L醋酸鈉緩沖液平衡 CM-Sephadex C-50陽離子層析柱；將步驟(1)中上清液上樣，用濃度范圍在0 0. 5mol/L NaCl的上述緩沖液梯度洗脫。檢測波長280nm，流速0.5ml/min，收集:3ml/管。收集活性最強的峰I，冷凍干燥。
(3) Sephadex G-75 凝膠層析用 pH 7. 8,0. 2mol/L Tris-HCl buffer 平衡 Sephadex G_75柱，將步驟O)中收集的凍干樣品用相同緩沖液溶解后上樣，檢測波長 280nm,流速0. 15ml/min,收集^iil/管。測各峰磷脂酶活性，收集活性最強的峰IV，冷凍干O
(4)Q-Sepharose FF 預裝柱層析用 pH 7. 8，0. 4mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液平衡 Q-Sepharose FF預裝柱。將步驟(3)中制得凍干樣品用上述緩沖液溶解后上樣，用濃度范圍在0 0. 5mol/L NaCl的上述緩沖液梯度洗脫，流速lml/min, lml/管。收集活性峰II， 冷凍干燥即得純品。
權利要求
1.一種白唇竹葉青蛇毒中提取磷脂酶A2的方法，其特征在于按如下步驟進行(1)白唇竹葉青蛇毒預處理收集毒液，將毒液冷凍干燥成粉末狀備用，取粗毒凍干粉 0. 3 lg，溶解于5ml pH 5. 2-5. 8,0. 025 0. 05mol醋酸鈉緩沖液中，冷凍離心，取上清液待用；(2)CM-Sephadex C-50 陽離子交換層析用 pH 5. 2-5. 8,0. 025 0. 05mol/L 醋酸鈉緩沖液平衡CM-kphadex C_50陽離子層析柱；將步驟(1)中上清液上樣，用濃度范圍在0 0. 5mol/L NaCl的上述緩沖液梯度洗脫，檢測波長280nm，流速0. 5 lml/min，收集:3ml/ 管，收集活性最強的峰I，冷凍干燥；(3)Sephadex G-75 凝膠層析用 pH 7. 5 8. 0,0. 01 0. 03mol/L Tris-HCl bufferG-75柱，將步驟O)中收集的凍干樣品用相同緩沖液溶解后上樣，檢測波長280nm，流速0. 15ml/min，收集^iil/管，測各峰磷脂酶活性，收集活性最強的峰IV，冷凍干燥；(4)Q-Sepharose FF 預裝柱層析用 pH 7. 5 7. 8,0. 02 0. 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液平衡Q-kpharose FF預裝柱，將步驟(3)中制得凍干樣品用上述緩沖液溶解后上樣， 用濃度范圍在0 0. 5mol/L NaCl的上述緩沖液梯度洗脫，流速lml/min，lml/管，收集活性峰II，冷凍干燥即得純品。
2.根據權利要求1所述一種白唇竹葉青蛇毒中提取磷脂酶A2的方法，其特征在于所述步驟(1)中采用咬皿擠壓法收集毒液，其中冷卻離心采用3000 5000r/min離心10 15min。
全文摘要
本發明公開了一種白唇竹葉青蛇毒中提取磷脂酶A2的方法，通過白唇竹葉青蛇毒預處理；CM-Sephadex C-50陽離子交換層析；Sephadex G-75凝膠層析；Q-Sepharose FF預裝柱層析得到純品。本發明從白唇竹葉青蛇毒中分離提取出了一種磷脂酶A2，制備方法簡單、便于操作、成本低廉，且所得磷脂酶A2純度較高。
文檔編號C12N9/16GK102533694SQ201210061100
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月9日 優先權日2012年3月9日
發明者余曉東, 和七一, 鄧疆渝 申請人:重慶師范大學