專利名稱：一種耐高溫酶法合成菊粉的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菊粉的合成方法，尤其是一種耐高溫酶法合成菊粉的方法。
背景技術(shù)：
菊粉(inulin)是由果糖經(jīng)以β _2，1_糖苷鍵相連而成的直鏈多糖，在其還原端接一個葡萄糖基，聚合度為2-60，分子量在3500-5500之間。菊粉是目前發(fā)現(xiàn)的可溶性的膳食纖維之一，是體內(nèi)雙歧桿菌及乳酸菌的增強因子。其熱值低(1.5kcal/g),且溶解性極好，溫度越高，溶解性越好，10°C時水中的溶解度為60g/L，70°C時水中的溶解度為240g/L，90°C時水中的溶解度為330g/L。研究表明，其可以提高鈣、鐵、鋅等礦物質(zhì)的吸收率；可調(diào)節(jié)血液中的膽固醇，降低血壓及血糖，糖尿病人可食用；有較好的持水性能，可改善食品的組織結(jié)構(gòu)，使結(jié)構(gòu)緊密；可改善食品的味覺及口感，并具有持久性。因此，菊粉具有重要的健康、藥用開發(fā)價值。菊粉的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝是植物提取法，主要是從菊苣、菊芋中提取。植物提取法生產(chǎn)菊粉受氣候、種植、收獲、儲存等諸多條件影響，會造成品質(zhì)的不穩(wěn)定及價格波動。通過微生物途徑制備菊粉則可以解決上述植物提取菊粉所存在的問題。微生物途徑制備菊粉，是指通過微生物發(fā)酵生成菊粉合成酶，然后通過菊粉合成酶利用蔗糖合成菊粉。酶法合成菊粉可以避免傳統(tǒng)植物提取法生產(chǎn)菊粉的種種弊端，還可以通過控制酶合成條件生產(chǎn)出不同DP值的菊粉。目前，制約酶法合成生產(chǎn)菊粉的主要因素為，菊粉合成酶酶活較低且耐高溫性差，致使菊粉合成率較低，生產(chǎn)成本過高。篩選高產(chǎn)耐高溫菊粉合成酶系的菌株，并優(yōu)化發(fā)酵、合成、提取精制過程，是解決上述問題的關(guān)鍵所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在 于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種耐高溫酶法合成菊粉的方法，其具有工藝科學合理，菊粉合成效率高的優(yōu)點。本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:一種耐高溫酶法合成菊粉的方法，其特征在于:利用出芽胞桿菌為發(fā)酵菌種生產(chǎn)耐高溫菊粉合成酶，然后再利用耐高溫菊粉合成酶根據(jù)需要生產(chǎn)不同DP值菊粉，該方法的步驟為:⑴、培養(yǎng)出芽胞桿菌生產(chǎn)耐高溫菊粉合成酶:發(fā)酵原料經(jīng)高溫滅菌后打入種子罐及發(fā)酵罐中，出芽胞桿菌TKB28菌株經(jīng)過搖瓶、種子罐的二級接種后，按5%接種量接入發(fā)酵罐中，通入無菌空氣攪拌條件下，37°C恒溫發(fā)酵16小時左右，然后通過離心將菌體和發(fā)酵液分離，通過分子量20000的超濾膜濃縮菊粉合成酶溶液，測定所得菊粉合成酶濃縮液的酶活；⑵、合成菊糖反應(yīng):在底物濃度為20%的蔗糖溶液、溫度為70°C條件下，按1-1.5U/HiL的加入量加入高溫菊粉合成酶，初期pH值5.5，保溫8小時后當蔗糖濃度小于5%時，調(diào)節(jié)pH為7.0,同時通過流加蔗糖使蔗糖濃度維持在5-10%，12小時后停止流加；當反應(yīng)進行4小時后溶液中主要為DP值9 一 12的菊糖和葡萄糖及少量蔗糖，當12小時后反應(yīng)結(jié)束，溶液中主要為DP值21 — 25的菊糖和葡萄糖；⑶、除雜與制粉:反應(yīng)結(jié)束后的溶液通過微濾、離子交換樹脂除去料液中的少量不溶物、灰分、和色素，然后通過納濾膜去除葡萄糖及少量蔗糖，使菊粉的純度在95%以上，最后通過噴霧干燥制得高純度菊粉。而且，步驟⑵合成菊糖反應(yīng)進行4小時后結(jié)束反應(yīng)，將所得反應(yīng)溶液進行步驟⑶除雜與制粉，得到DP值9 一 12、純度在95%以上的菊粉。而且，步驟⑵合成菊糖反應(yīng)進行12小時后結(jié)束反應(yīng)，將所得反應(yīng)溶液進行步驟⑶除雜與制粉，得到DP值21 — 25、純度在95%以上的菊粉。而且，所述的發(fā)酵原料包括:鹿糖 10 20重量份；蛋白胨 0.5 5重量份；無機鹽 0.2 2重量份。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是:1、本發(fā)明提出了最適的發(fā)酵條件，使出芽胞桿菌TKB28菌株所產(chǎn)的菊粉合成酶酶活有明顯的提高，發(fā)酵時間也相應(yīng)縮短； 提出采用最適的分段調(diào)控PH值、流加控制底物濃度、控制合成時間可獲得不同DP值的菊粉；在除雜過程中采用了微濾、離子交換、納濾等工藝使菊粉產(chǎn)品不但色澤低、雜質(zhì)少而且純度高，不但簡化生產(chǎn)工藝而且提高了得率，減少了原料和能源的消耗。2、本發(fā)明采用耐高溫菊粉合成酶法生產(chǎn)菊粉，在70°C的相對高溫下進行酶促反應(yīng)，克服了常溫下菊粉溶解度較低，大大提高了生產(chǎn)過程中反應(yīng)溶液中菊粉的濃度，提高了設(shè)備使用率，降低了單位成本。3、本發(fā)明采用分段調(diào)控pH值、同時通過流加控制底物濃度、并控制合成時間等技術(shù)手段控制酶促反應(yīng)，可獲得不同DP值段菊粉終產(chǎn)品，在同一生產(chǎn)方法下實現(xiàn)了產(chǎn)品種類的多樣性。4、本發(fā)明所提出的酶法生產(chǎn)菊粉，其反應(yīng)溶液中雜質(zhì)少、色素低、灰分少，除雜與精制比原有植物提取工藝簡單的多，通過納濾可較容易的獲得純度95%以上的高純菊粉。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例做進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。一種耐高溫酶法合成菊粉的方法，其利用出芽胞桿菌為發(fā)酵菌種生產(chǎn)耐高溫菊粉合成酶，然后再利用耐高溫菊粉合成酶根據(jù)需要生產(chǎn)不同DP值菊粉，該方法的步驟為:⑴、培養(yǎng)出芽胞桿菌生產(chǎn)耐高溫菊粉合成酶:發(fā)酵原料經(jīng)高溫滅菌后打入種子罐及發(fā)酵罐中，出芽胞桿菌TKB28菌株經(jīng)過搖瓶、種子罐的二級接種后，按5%接種量接入發(fā)酵罐中，通入無菌空氣攪拌條件下，37°C恒溫發(fā)酵16小時左右，然后通過離心將菌體和發(fā)酵液分離，通過分子量20000的超濾膜濃縮菊粉合成酶溶液，測定所得菊粉合成酶濃縮液的酶活；發(fā)酵原料包括:蔗糖200g ;蛋白胨50g ;無機鹽2g。蔗糖為碳源，蛋白胨為有機氮源，輔以少量無機鹽類形成發(fā)酵原料。
⑵、合成菊糖反應(yīng):在底物濃度為20%的蔗糖溶液、溫度為70°C條件下，按1-1.5U/HiL的加入量加入高溫菊粉合成酶，初期pH值5.5，保溫8小時后當蔗糖濃度小于5%時，調(diào)節(jié)pH為7.0,同時通過流加蔗糖使蔗糖濃度維持在5-10%，12小時后停止流加；當反應(yīng)進行4小時后溶液中主要為DP值9 一 12的菊糖和葡萄糖及少量蔗糖，當12小時后反應(yīng)結(jié)束，溶液中主要為DP值21 — 25的菊糖和葡萄糖；⑶、除雜與制粉:反應(yīng)結(jié)束后的溶液通過微濾、離子交換樹脂除去料液中的少量不溶物、灰分、和色素，然后通過納濾膜去除葡萄糖及少量蔗糖，使菊粉的純度在95%以上，最后通過噴霧干燥制得高純度菊粉。(4)、步驟⑵合成菊糖反應(yīng)進行4小時后結(jié)束反應(yīng)，將所得反應(yīng)溶液進行步驟⑶除雜與制粉，得到DP值9 一 12、純度在95%以上的菊粉。(5)、步驟⑵合成菊糖反應(yīng)進行12小時后結(jié)束反應(yīng)，將所得反應(yīng)溶液進行步驟⑶除雜與制粉，得到DP值21 — 25、 純度在95%以上的菊粉。
權(quán)利要求
1.一種耐高溫酶法合成菊粉的方法，其特征在于:利用出芽胞桿菌為發(fā)酵菌種生產(chǎn)耐高溫菊粉合成酶，然后再利用耐高溫菊粉合成酶根據(jù)需要生產(chǎn)不同DP值菊粉，該方法的步驟為: (I)、培養(yǎng)出芽胞桿菌生產(chǎn)耐高溫菊粉合成酶:發(fā)酵原料經(jīng)高溫滅菌后打入種子罐及發(fā)酵罐中，出芽胞桿菌TKB28菌株經(jīng)過搖瓶、種子罐的二級接種后，按5%接種量接入發(fā)酵罐中，通入無菌空氣攪拌條件下，37°C恒溫發(fā)酵16小時左右，然后通過離心將菌體和發(fā)酵液分離，通過分子量20000的超濾膜濃縮菊粉合成酶溶液，測定所得菊粉合成酶濃縮液的酶活； ⑵、合成菊糖反應(yīng):在底物濃度為20%的蔗糖溶液、溫度為70°C條件下，按1-1.5U/mL的加入量加入高溫菊粉合成酶，初期PH值5.5，保溫8小時后當蔗糖濃度小于5%時，調(diào)節(jié)PH為7.0，同時通過流加蔗糖使蔗糖濃度維持在5-10%，12小時后停止流加；當反應(yīng)進行4小時后溶液中主要為DP值9 一 12的菊糖和葡萄糖及少量蔗糖，當12小時后反應(yīng)結(jié)束，溶液中主要為DP值21 — 25的菊糖和葡萄糖； ⑶、除雜與制粉:反應(yīng)結(jié)束后的溶液通過微濾、離子交換樹脂除去料液中的少量不溶物、灰分、和色素，然后通過納濾膜去除葡萄糖及少量蔗糖，使菊粉的純度在95%以上，最后通過噴霧干燥制得高純度菊粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種耐高溫酶法合成菊粉的方法，其特征在于:步驟⑵合成菊糖反應(yīng)進行4小時后結(jié)束反應(yīng)，將所得反應(yīng)溶液進行步驟⑶除雜與制粉，得到DP值9 一12、純度在95%以上的菊 粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種耐高溫酶法合成菊粉的方法，其特征在于:步驟⑵合成菊糖反應(yīng)進行12小時后結(jié)束反應(yīng)，將所得反應(yīng)溶液進行步驟⑶除雜與制粉，得到DP值21 - 25、純度在95%以上的菊粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種耐高溫酶法合成菊粉的方法，其特征在于:所述的發(fā)酵原料包括: 蔗糖 1(Γ20重量份； 蛋白胨0.5飛重量份； 無機鹽0.2 2重量份。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種耐高溫酶法合成菊粉的方法，以蔗糖為主要原料，利用篩選得到的高產(chǎn)耐高溫菊粉合成酶系的出芽胞桿菌TKB28菌株為發(fā)酵菌種生產(chǎn)耐高溫菊粉合成酶，然后再利用耐高溫菊粉合成酶根據(jù)需要生產(chǎn)不同DP值菊粉，包括培養(yǎng)出芽胞桿菌生產(chǎn)耐高溫菊粉合成酶、合成菊糖反應(yīng)及除雜與制粉三個步驟。本發(fā)明除了能解決傳統(tǒng)植物提取法生產(chǎn)菊粉之原料產(chǎn)量與品質(zhì)的不可控性弊端外，還解決了制約酶法生產(chǎn)菊粉產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的菊粉合成酶酶活較低且耐高溫性差，致使菊粉合成率較低，生產(chǎn)成本過高的技術(shù)瓶頸。
文檔編號C12P19/18GK103088088SQ20121059459
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者國華, 溫冰, 趙瓊, 周英彪, 王珺, 韓慧 申請人:天津市工業(yè)微生物研究所