專利名稱：天山凍土中產低溫中性蛋白酶菌株篩選及培養方法
技術領域：
本發明涉及ー種從新疆天山凍土中篩選得到的產低溫中性蛋白酶菌株Pseudomonas sp.(假單胞菌屬)N_8 ;本發明還涉及該菌株的特性及發酵條件的優化。
背景技術：
天山凍土屬于我國高海抜高山常年凍土，凍土環境中微生物產生一系列適應低溫、寡營養、強輻射、凍融等極端因子的分子機制，為低溫微生物生理多祥性提供了可能。低溫酶由于在低溫環境下具有較高的酶活性，有助于在保證催化效率的前提下降低反應溫度和縮短反應時間，從而大幅度節約能源，因而在食品加工、日化產品、皮革加工等需要低溫催化的行業如中具有較高的開發利用價值。目前發現產低溫蛋白酶的菌有假單胞 菌屬(Psedomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、氣單抱菌屬(Aeromonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、弧菌屬(Vibrio)。這些低溫菌在永久性低溫環境下經過長期的進化適應，已有著適應低溫環境的特殊結構與生理生化機制。它們所產生的低溫蛋白酶也有著獨特的生理生化特征與結構特征。有關低溫微生物的資源勘探與代謝活性產物研究，已成為國際微生物學研究的熱點之一，我國的ー些研究機構也積極開展低溫蛋白酶生產菌株的篩選エ作。
發明內容
本發明的目的從新疆天山凍土中篩選得到的產低溫中性蛋白酶菌株，經鑒定為假單胞菌N-8 (Pseudomonas sp. N-8)，2012年6月26日保藏于中國典型培養物保藏中心(中國.武漢.武漢大學)，保藏編號為CCTCC NO M 2012251。通過單因素試驗和正交實驗對其發酵條件進行優化。I、菌株篩選方法，包括以下步驟(I)初篩吸取富集后的培養液用倍比稀釋法制不同的稀釋度移入初篩平板中，涂勻，15°C培養。待菌落長好后，挑選透明圈較大菌株，斜面保存。(2)復篩以40°C為上限生長溫度，即在該溫度不生長的菌株為耐冷菌。將初篩得到的產蛋白酶菌株在初篩平板上點樣，在40°C不生長的菌株，為試驗菌株。以酪蛋白為底物，采用福林(Folin)試劑顯色法測定酶活，進ー步篩選出產酶能力強的菌株。2、菌株生長特性、形態觀察及生理生化試驗(I)生長特征該菌株生長范圍為0_40°C，最適生長溫度為20°C，最適生長pH為7. O ；(2)菌體特征革蘭氏陰性菌，菌體呈桿狀，細胞單個，大小為(O. 5-0. 8) X (2. 0-3. 2) μ m，有莢膜，有鞭毛；(3)菌落特征在酪蛋白平板上，菌落呈圓形，乳白色，不透明，表面光滑，邊緣整齊，易挑取，產生明顯的透明圈；(4)生理生化特征該菌株接觸酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽(還原)反應為陽性，能水解明膠，硫化氫試驗、伏一普ニ氏試驗(VP)、甲基紅試驗(MR)為陰性，不能發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、纖維ニ糖、鼠李糖、棉子糖。3、發酵條件優化(I)通過單因素試驗和正交實驗對其發酵培養基進行優化。表I培養基組成的正交試驗設計與結果
權利要求
1.天山凍土中產低溫中性蛋白酶菌株篩選方法，包括以下步驟 (1)初篩吸取富集后的培養液用倍比稀釋法制不同的稀釋度移入初篩平板中，涂勻，15°C培養。待菌落長好后，挑選透明圈較大菌株，斜面保存。
(2)復篩以40°C為上限生長溫度，即在該溫度不生長的菌株為耐冷菌。將初篩得到的產蛋白酶菌株在初篩平板上點樣，在40°C不生長的菌株，為試驗菌株。以酪蛋白為底物，采用福林(Folin)試劑顯色法測定酶活，進ー步篩選出產酶能力強的菌株。
2.根據權利要求I所述的ー種Pseudomonassp. N_8,具有以下特征 (1)生長特征該菌株最適生長溫度為20°C;最適生長pH為7. O ; (2)菌體特征革蘭氏陰性菌，菌體呈桿狀，細胞單個，大小為(O.5-0. 8) X (2. 0-3. 2)μ m，有莢膜，有鞭毛； (3)菌落特征在酪蛋白平板上，菌落呈圓形，乳白色，不透明，表面光滑，邊緣整齊，易挑取，產生明顯的透明圈； (4)生理生化特征該菌株接觸酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽(還原)反應為陽性，能水解明膠，硫化氫試驗、伏一普ニ氏試驗(VP)、甲基紅試驗(MR)為陰性，不能發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、纖維ニ糖、鼠李糖、棉子糖。
3.ー種利用Pseudomonas sp. N_8產低溫中性蛋白酶發酵條件的優化 (1)通過單因素試驗和正交實驗對其發酵培養基進行優化，最佳培養基配方為(g/L)葡萄糖10，酵母粉8，酪蛋白20, K+O. 4 ； (2)通過單因素試驗和正交實驗對其培養條件進行優化，最佳培養條件為種齡24h，起始PH7，接種量4%，裝液量50mL/250mL。
全文摘要
本發明是從新疆天山凍土中篩選得到的產低溫中性蛋白酶菌株Pseudomonas sp.(假單胞菌屬)N-8。該菌株為革蘭氏陰性菌，菌體呈桿狀，細胞單個，大小為(0.5-0.8)×(2.0-3.2)μm，有莢膜，有鞭毛；在酪蛋白平板上，菌落呈圓形，乳白色，不透明，表面光滑，邊緣整齊，易挑取，產生明顯的透明圈。該菌株最適生長溫度為20℃；最適生長pH為7.0。通過單因素試驗和正交實驗對其發酵條件進行優化，確定最佳發酵培養基配方為(g/L)葡萄糖10，酵母粉8，酪蛋白20，K+0.4，pH7.0；最佳培養條件為種齡24h，起始pH7，接種量4％，裝液量50mL/250mL。
文檔編號C12N1/02GK102864099SQ20121022873
公開日2013年1月9日 申請日期2012年7月4日 優先權日2012年7月4日
發明者楊瑞金, 祁丹丹, 趙偉 申請人:江南大學