專利名稱：用于犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株鑒別診斷rt-lamp檢測引物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明設計一套檢測毒株的引物，尤其涉及一套用于檢測犬瘟熱病毒野毒株的 RT-LAMP引物，屬于犬瘟熱病毒的檢測領域。
背景技術：
犬痕熱病毒(Canine distemper virus, CD V)屬于副粘病毒科 (Paramyxoviridae)，副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)，麻疫病毒屬(Morbillivirus)。 CDV為有囊膜的單股、負鏈、不分節段的RNA病毒，基因組全長15 690bp，主要編碼核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝蛋白⑶和大蛋白(L)6個結構蛋白。目前公認CDV只有一個血清型，但根據H基因氨基酸序列同源性高于95%的毒株可歸為同一基因型的原則，可將⑶V分為亞洲I型(Asia-I)、亞洲II型(Asia-II)、歐洲型 (Europe)、美國型(USA 或 America)、北極型(Arctic)和疫苗型(Vaccine 或 Old CDVs) 6 個不同基因型。犬瘟熱(Canine distemper，⑶)是由⑶V感染犬或其它肉食目動物所引起的急性、高度接觸性傳染病。臨床以雙相熱、紅疹、結膜炎及中樞神經系統損害為主要特征。 自1809年首次報道以來，該病已呈世界性分布，給養犬業、毛皮動物養殖業和野生動物保護業造成巨大危害。⑶感染可導致犬、貂、狐等的病死率達30% -80%，雪貂高達100%。 而對于CD的防治，除采用疫苗進行定期的免疫接種外，尚無特異性治療方法。而目前用于CD防制的主要為弱毒疫苗，弱毒疫苗大規模應用使得區分動物自然感染與疫苗免疫 (Diffreentiating Infected from vaccinated Animals,DIVA)變得非常困難。因此建立一種可以鑒別診斷CDV強、弱野毒感染的敏感而特異的檢測方法已勢在必行。目前CDV檢測方法有很多，包括病毒分離培養、動物接種試驗、血清學診斷方法、 RT-PCR、RT-nested PCR,Semi-nested PCR和實時熒光定量RT_PCR(Real time RT-PCR)等。 其中病毒分離和動物試驗不同程度的存在診斷周期長、操作繁瑣、檢出率低等不足；常規的血清學試驗又很難鑒別⑶V野毒感染和疫苗接種，而Real time RT-PCR方法對實驗儀器的要求很高。雖然單克隆抗體技術用于診斷在一定程度上彌補了這一缺陷，但是基于抗原抗體反應的檢測技術仍有一定的局限性(即敏感性不夠高等)，如膠體金檢測技術。上述方法或多或少存在缺陷，很難適合于基層實驗室的快速準確檢測。環介導等溫擴增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)方法是日本學者Notomi等在2000年發明的一項恒溫核酸擴增新技術。該技術特異性強、靈敏度高、成本低廉，特別適合在現場和基層部門應用。關于⑶V的RT-LAMP方法已有報道，但均不能用于⑶V野毒株和疫苗株的鑒別。為此，本研究建立了無需特殊的儀器、適合基層實驗室使用的快速、靈敏、特異、準確，且可用于CDV野毒株和疫苗株進行鑒別診斷的RT-LAMP方法
發明內容
本發明所要解決的結束問題是克服現有技術的不足，提供一套可用于檢測犬瘟熱病毒野毒株的RT-LAMP引物。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的本發明的一套用于區分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株的RT-LAMP引物，其特征在于所述RT-LAMP引物包括一對外引物和一對內引物，其中，所述的外引物的序列為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2所示，所述內引物的序列分別為SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。本發明還提供了一種用于區分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株的方法，其特征在于包括以下步驟配制25 μ L反應體系10 μ M引物F3和Β3各0.5 μ L，10 μ M引物FIP和BIP各 5 μ L,2. 5mM dNTPs 2. 5 μ L, 25mM MgCl2 5 μ L,5M Betaine 2. 5 μ L, 10 X ThermoBuffer
2.5 μ L, Bst DNA聚合酶20U,模板2 μ L,用去離子水補足25 μ L ;其中，引物F3和Β3為外引物，其序列分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示; 引物FIP和BIP為內引物，其序列分別為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示;PCR 反應程序62°C 45min ；80°C 2min ；觀察取5μ L PCR產物，經I %瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統觀察結果。進一步的，本發明提出了一種區分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株的試劑盒，其特征在于包含本發明所述的引物。更進一步的，本發明提出了所述的引物在制備區分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株感染試劑中的應用。及所述的試劑盒在制備區分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株感染試劑中的應用。及所述的引物在制備檢測犬瘟熱病毒野毒株或疫苗株試劑中的應用。及所述的試劑盒在制備檢測犬瘟熱病毒野毒株或疫苗株試劑中的應用。本發明根據GenBank中⑶V H基因序列，設計RT-LAMP引物(因為H基因序列存在的差異是CDV基因型分類依據，所以根據H基因的堿基差異設計了專門針對CDV野毒株的RT-LAMP引物)，包括一對外引物F3/B3 (SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2)，一對內引物 FIP/BIP(SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示)，以樣品的cDNA為模板，利用Bst DNA聚合酶，在62°C恒溫條件下進行擴增。該方法可檢測出不同基因型的CDV野毒株，檢出極限為
3.5TCID50的CDV ;特異性試驗表明，該方法對CDV疫苗株、CPV以及其他常見犬源性病毒均無擴增反應。該方法無需特殊儀器，是一種適用于基層的快速、簡便的CDV野毒株鑒別方法。以本發明所設計的引物采用RT-LAMP檢測方法對各種基因型的CDV野毒株進行檢測，檢測結果均為陽性，而對CDV弱毒疫苗株、CPV以及其他常見犬源性病毒檢測結果均為陰性。應用本發明引物序列采用RT-LAMP檢測方法，可以非常準確的鑒別出CDV野毒株，具有特異性強、靈敏度高、重復性好等優點。本發明所設計的引物序列在犬瘟熱早期檢測和快速診斷中具有重要意義。


圖I為RT-LAMP敏感性試驗結果；I DL 2000 DNA Marker ；2 10_1 ；3 :1(Γ2 ；4 :1(Γ3 ；5 :1(Γ4 ；6 :1(Γ5 ；7 :1(Γ6 ；8 :陰性對
圖2為RT-LAMP特異性試驗結果；I CPV 模板；2 =CAV-I 模板；3 =CAV-II 模板；4 :CDV 模板；5 DL 2000 DNA Marker圖3為RT-LAMP重復性試驗結果。I DL2000 DNA Marker ；2~4 :不同代次的⑶V野毒株細胞培養物，同一時間提取 RNA模板；5-7 同一 CDV野毒株細胞培養物，分別在3個時間提取RNA模板
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例II材料和方法I. I病毒株和待檢材料Asia-I型和Asia-II型⑶V野毒株XDV弱毒疫苗株、CPV株、I型犬腺病毒(CAV-I) 株、II型犬腺病毒(CAV-II)株和狂犬病毒(RV)株均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所經濟動物組保存。待檢材料包括56份從東北地區不同養殖場送檢的臨床病例樣品。I. 2引物設計與合成參照GenBank中Q)V H基因序列，利用在線軟件Primer Explorer V4作為輔助， 設計RT-LAMP引物，其中包括2條外引物F3/B3和2條內引物FIP/BIP (表I)。表IRT-LAMP引物序列
_引物序列(5，-3，)_
F3 GCCTGTATTGGTCTCTGAG (SEQ ID NO: I)
B3 CTCCG TTCAGTATAACCGG ( SEQID NO: 2)
FIP TGCACATAGGGTAGGATTTTCT-
GAACAAGAGGAGCAAAAAAACT ( SEQ ID NO: 3)
BIP AGTTGCCTTCTTATGGGCGGATG-
TTAAGTTGAAGGTCAATGC( SEQ ID NO: 4)I. 3病毒RNA提取和cDNA合成I. 3. IRNA 的提取用QIAamp Viral RNA Kit提取試劑盒(QIAgen公司)提取病毒RNA，具體操作方法參照說明書進行。I. 3. 2cDNA 的合成
取1“1^病毒1 應，加入到2(^1^反轉錄反應體系中，內含44 1^ 5XRT Buffer、2yL dNTP Mixture (各 IOmM)、50pmoI 9_mer 隨機引物、IOU禽源反轉錄酶(AMVRT XL)和 20U RNA 酶抑制劑(HPRI)，42°C水浴lh，最后70°C 15min滅活反轉錄酶。I. 4RT-LAMP 方法的優化I. 4. I鎂離子濃度的優化以⑶V全長cDNA為模板，鎂離子的濃度在2. 5 6. 5mM,以O. 5mM遞增，每個反應重復3次。反應條件為62°C 60min,80°C 2min，產物于2%瓊脂糖凝膠電泳中觀察。1. 4. 2引物濃度的優化由于外弓丨物對實驗結果影響很小，所以實驗中固定外弓丨物濃度，對內引物濃度進行梯度稀釋(O. 8μΜ、1. 2μΜ、1. 6μΜ和2. O μ Μ)，每個濃度的引物重復3個反應，產物于 2%瓊脂糖凝膠電泳中觀察。I. 4. 3反應溫度的優化在完成以上所有條件優化基礎上進行反應溫度優化。反應溫度從61 °C 65°C，以 I°C依次遞增，每個溫度重復3次反應，產物于2%瓊脂糖凝膠電泳中觀察。I. 5擴增產物的檢測反應結束后，取6 μ L RT-LAMP擴增產物，于2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。I. 6RT-LAMP的敏感性試驗將104_ 6TCID5tl的⑶V野毒株細胞培養物用滅菌的去離子水進行連續10倍梯度稀釋，分別提取RNA反轉錄后，運用優化的RT-LAMP方法進行檢測。L 7RT-LAMP的特異性試驗提取CDV 疫苗株、Asia-I 型和 Asia-ΙΙ 型的 CDV 野毒株、CPV、CAV-I、CAV_II 和 RV 等病毒核酸，按照所建立的CDV RT-LAMP檢測方法進行特異性試驗。同時把CDV株F3和B3 之間的擴增條帶切膠回收，插入PMD18-T載體，然后測序驗證。應用DNAStar軟件對序列進行分析，并在GenBank中對序列進行BLAST分析，用以驗證擴增產物的特異性。I. 8RT-LAMP的重復性試驗取等量的3份不同代次的CDV株細胞培養物，提取RNA，反轉錄后，進行RT-LAMP檢測，用以檢測批內重復性。取等量的3份不同代次的CDV毒株細胞培養物，不同時間提取病毒RNA，反轉錄后，在同一反應條件下進行獨立的RT-LAMP，用以檢測批間重復性。2 結果2. I優化的RT-LAMP反應條件通過對RT-LAMP反應條件的優化，確定最佳的反應體系為反應體系為25 μ L : 1(^]\1引物卩3和83各0.54 1^，1(^]\1引物？1 和81 各54 1^，2.51111 dNTPs 2. 5μ L,25mM MgCl2 5μ L,5M Betaine 2. 5 μ L, IOXThermo Buffer 2. 5 μ L, Bst DNA 聚合酶 20U，模板
2μ L，用去離子水補足25 μ L。反應條件為62°C 45min ；80°C 2min。2. 2RT-LAMP 的敏感性運用優化的RT-LAMP方法進行檢測，檢測為陽性的最低稀釋度為10°_6(3. 5TCID50) (圖I所示)。2. 3RT-LAMP 的特異性所建立的⑶V RT-LAMP檢測方法可以檢測出不同基因型的⑶V野毒株，而對⑶V 弱毒疫苗株、CPV、CAV-I, CAV-II和RV檢測結果均為陰性(圖2所示)。測序結果分析表明，擴增的214bp的片段與CDV的H基因序列(FJ409464)同源性為100%。2. 4RT-LAMP 的重復性2. 4. I批內重復性取不同代次的CDV野毒株細胞培養物，同一時間提取RNA，反轉錄后，在同一反應條件下進行獨立的RT-LAMP檢測，3次檢測結果無明顯差異(圖3所示)。2. 4. 2批間重復性取同一 CDV野毒株細胞培養物，分別3個時間提取RNA，反轉錄后，進行一次 RT-LAMP檢測，3個重復結果無明顯差異(圖3所示)。
權利要求
1.一套用于區分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株的RT-LAMP引物，其特征在于所述 RT-LAMP引物包括一對外引物和一對內引物，其中，所述的外引物的序列為SEQ ID NO :1和 SEQ ID NO :2所示，所述內引物的序列分別為SEQ ID NO :3和SEQ ID N0:4所示。
2.一種用于區分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株的方法，其特征在于包括以下步驟配制25 μ L反應體系10 μ M引物F3和Β3各O. 5 μ L，10 μ M引物FIP和BIP各5 μ L，2.5mM dNTPs 2. 5 μ L,25mM MgCl2 5 μ L,5M Betaine 2. 5 μ L,10 X ThermoBuffer 2. 5 μ L, Bst DNA聚合酶20U,模板2μ L,用去離子水補足25 μ L ;其中，引物F3和Β3為外引物，其序列分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；引物 FIP和BIP為內引物，其序列分別為SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4所示；PCR 反應程序62°C 45min ；80°C 2min ；觀察取5μ L PCR產物，經I %瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統觀察結果。
3.—種區分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株的試劑盒，其特征在于包含權利要求I所述的引物。
4.權利要求I所述的引物在制備區分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株感染試劑中的應用。
5. 權利要求2所述的試劑盒在制備區分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株感染試劑中的應用。
6. 權利要求I所述的引物在制備檢測犬瘟熱病毒野毒株或疫苗株試劑中的應用。
7.權利要求2所述的試劑盒在制備檢測犬瘟熱病毒野毒株或疫苗株試劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一套用于區分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株的RT-LAMP引物及其應用，所述RT-LAMP引物包括一對外引物和一對內引物，其中，外引物的序列為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示；內引物的序列分別為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示。以本發明所設計的引物采用RT-LAMP檢測方法對各種基因型CDV野毒株進行檢測，檢測結果均為陽性，而對犬瘟熱疫苗株、犬細小病毒以及其他常見犬源病毒檢測結果均為陰性。應用本發明引物序列采用RT-LAMP檢測方法，可以非常準確地區分CDV野毒株和CDV疫苗株，具有特異性強、靈敏度高、重復性好等優點。
文檔編號C12Q1/68GK102586485SQ20121006346
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月12日 優先權日2012年3月12日
發明者劉大飛, 劉春國, 張洪英, 戚亭, 曲連東 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所