專利名稱：銀杏內生真菌的分離純化方法
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域，特別涉及一種其發酵物具有抑制植物病原真菌的活性的微生物。
背景技術：
在農業生產過程中控制農作物病蟲草害的主要手段是化學農藥防治，其對減輕病蟲草危害，保證糧食豐產豐收，起到積極的作用。但是由于自然界生物之間相互依存、相互制約，過分依賴化學農藥的毒殺作用，產生一些地區發生盲目濫施農藥的現象，特別是一些殘效期長和毒性大的農藥使用，導致一系列食品安全、人類健康和生存環境問題。目前化學 防治的危害逐步被人們所認識，研制安全、高效、環保的新型農藥已成為發展的方向和研究的主題。生物農藥因對人、畜低危險性，使用安全，對環境友好，不易產生抗性等優點，成為新農藥產業發展的熱點和重點。植物內生真菌(Endophytic fungi)是指生活在植物組織內或生活史中的某一階段生活在植物組織內，對植物組織不引起明顯變化的真菌，包括那些生活史中某一階段能營造表生生活的腐生菌，對宿主暫時沒有傷害的潛伏性病原菌(Latent pathogens)和菌根菌(Mycorhiza fungi)。植物內生真菌具有明顯的多樣性和普遍性。在目前所有研究過內生真菌的植物中，都有其存在，少則十幾種，多則近百種。植物內生真菌與宿主植物長期的共生過程中，構建了內生真菌特殊的生長環境，使得內生真菌能夠產生許多與結構新穎、生理活性獨特的天然化合物。具有安全、無殘留、不在人畜體內積累、防治效果專一等優點，為農藥先導化合物和新型生物農藥的研究和應用開拓了美好前景。當前利用植物中分離的內生真菌獲得生理活性物質已成為研究熱點，已有多項研究表明植物內生真菌能產生新型的抑菌活性的物質。如White等從禾本科植物中分離的內生真菌枝頂孢(Acremoniumcoenophilum)對多種體外培養的農作物病原真菌有抑制作用。Findlay從黑云杉(Piceamariana)中分離到內生真菌(Conoplea elegantala)的液體發酵產物中分離出兩個新的苯并卩比咯類活性成分，對由絲核菌(Rhizoctonia spp.)和鐮刀菌(Fusarium spp.)引起的病害有很好的防效，水稻立枯病、惡苗病等病害有良好的防治作用。顧愛國從苦皮藤內生真菌(Fusarium proliferatum)中分離到恩鐮孢菌素(eniatinns)類化合物,其對植物病原真菌菌絲生長和孢子萌發均有顯著抑制作用。銀杏(Ginkgo biloba L.)素有裸子植物“活化石”和“植物界熊貓”之稱，是中國特有的珍貴樹種，在漫長的生長期中幾乎不感染病蟲害，壽命極長。根據內共生理論推斷，銀杏中很有可能存在著特殊的內生真菌，通過產生特殊的次生代謝產物幫助增強銀杏的抗病害能力。

發明內容
本發明的目的在于提供一種分離自中國安徽省合肥市銀杏(Ginkgo biloba L)植物活體中，且其發酵產物具有較強的抑制植物病原真菌活性的微生物，即銀杏內生真菌。
本發明所描述的銀杏內生真菌命名為腐皮鐮孢菌(Fusarium solani T_7),現保藏在國家知識產權局指定的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期2011年7月20日，保藏編號為CGMCCNo. 5089 o本發明所描述的銀杏內生真菌系從中國安徽省合肥市銀杏(Ginkgo biloba L)植物活體中分離得到的。本發明銀杏內生真菌的具體分離純化操作步驟如下(I).銀杏組織的準備采集銀杏的根、莖、葉；(2).銀杏組織的表面消毒與無菌檢測將步驟(I)采集的根依次在濃度70%的酒精中浸泡lmin、在濃度0. 2%的次氯酸鈉溶液中浸泡2min ;將采集的莖依次在濃度70%的酒精中浸泡50s、在濃度0. 2%的次氯酸鈉溶液中浸泡90s ;將采集的葉片依次在濃度70%的酒精中浸泡40s、在濃度0. 2%的次氯酸鈉溶液中浸泡60s ;將浸泡過的根、莖、葉用無菌 水沖洗3次，陰干，得到消毒后的根、莖、葉；用消毒手術刀將消毒后的根、莖、葉分別切成
0.5cmX0. 5cm大小的根塊、莖塊、葉塊；接著將一部分根塊、莖塊、葉塊直接種植于第一塊馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，溫度24 28°C恒溫培養，培養3 7天；將另一部分根塊、莖塊、葉塊進行無菌檢測采用組織印跡法，將根塊、莖塊、葉塊置于第二塊馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板上輕輕滾動或緊貼培養基放置2min，接著移去根塊、莖塊、葉塊，在溫度28°C恒溫培養，培養7天，無雜菌長出即說明消毒后的根塊表面、莖塊表面、葉塊表面無菌；所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基配方為馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂18克、蒸餾水I升；使用前馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基在溫度121°C、壓力0. IMPa下滅菌3Omin ；(3).銀杏組織內生真菌的分離培養當步驟(2)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板上銀杏的根塊、莖塊、葉塊周圍長出菌絲時，采用尖端菌絲挑取法，接種于第三塊馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，溫度24 28°C恒溫培養，培養3 10天，長出完整菌落，即為銀杏內生真菌；銀杏內生真菌的菌落質地較薄，菌落表面絨狀，中央為淡黃色，四周為白色，無色素產生，背面帶黃色至黃褐色；本發明所述的銀杏內生真菌菌株ITS基因組由597個堿基(bp)組成，系列如下I TTCGMCCGGC CTTATTGATA TGCTTAAGTT CAGCGGGTAT TCCTACCTGA51 TTCGAGGTCA ACATTCAGAA GTTGGGTGTT TTACGGCGTG GCCGCGCCGC101 TCTCCAGTTG CGAGGTGTTA GCTACTACGC AATGGAAGCT GCGGCGGGAC151 CGCCACTGTA TTTGGGGGAC GGCGTTGTGC CCGCAGGGGG CTTCCGCCGA201 TCCCCAACGC CAGGCCCGGG GGCCTGAGGG TTGTAATGAC GCTCGAACAG251 GCATGCCCGC CAGAATACTG GCGGGCGCAA TGTGCGTTCA AAGATTCGAT301 GATTCACTGA ATTCTGCAAT TCACATTACT TATCGCATTT CGCTGCGTTC351 TTCATCGATG CCAGAGCCAA GAGATCCGTT GTTGAAAGTT TTAATTTATT401 TGCTTGTTTA CTCAGAAGAA ACATTATAGA AACAGAGTTA GGGGGTCCTC451 TGGCGGGGGC GGCCCGTGTT ACGGGGCCGT CTGTTCCCGC CGAGGCAACG501 TTATAGGTAT GTTCACAGGG TTGATGAGTT GTATAACTCG GTAATGATCC551 CTCCGCTGGT TCACCAACGG AGACCTTGTT ACGACTTTTT ACTTCCA
本發明所述的銀杏內生真菌命名為腐皮鐮孢菌(Fusarium solani T_7),現保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期2011年7月20日，保藏編號為CGMCC No. 5089。發明所描述的微生物菌種經形 態觀察、培養特征和分子生物學ITS基因序列分析，確認其分類學地位屬于鐮孢菌屬，命名為Fusarium solani T-7。以ITS基因序列同源性為基礎構建形成包括菌株T-7在內的相關真菌的系統發育樹，結果看出，Fusarium solani T-7 與 Fusarium solani FMR 7988 的 ITS 序列同源達到100%。沒有堿基的差別。銀杏內生真菌菌落培養特征銀杏內生真菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基上溫度25°C培養7天，菌落直徑達到7. 3cm,質地較薄，菌落表面絨狀，中央為淡黃色，四周為白色，無色素產生，背面帶黃色至黃褐色。見圖I。銀杏內生真菌形態特征銀杏內生真菌的產孢細胞多產生于氣生菌絲，通常有分支，于頂端產生長筒形的單瓶梗；大型分生孢子呈馬特型，大多具有1-2個隔，大小10-15 X 3-4 ym，小型分生孢子呈卵形，大小5-8 X 3-4 ii m。見圖2。厚垣孢子呈球形,多成串生于菌絲頂端,直徑5_8 y m。見圖3。銀杏內生真菌的分子生物學特征采用分子生物學PCR技術，DNA測序分析，內生真菌的ITS基因由597個堿基組成。銀杏內生真菌的DNA序列與Genbank中的相關序列比對了 597個堿基，同源性為100%。以ITS序列為基礎構建的系統發育樹,腐皮鐮孢菌T-7與Fusarium solani FMR7988的進化距離最近。見圖4，采用MEGA4. I軟件，鄰位連接法顯示腐皮鐮孢菌T-7與相關種的ITS rDNA系統發育樹，進行1000次的相似度重復計算，圖中發育樹節點只顯示Bootstrap值大于50%數值。銀杏內生真菌發酵培養特征液體培養基蛋白胨15克，葡萄糖20克，氯化鈣0. 5克，磷酸氫二鉀0. I克，硫酸亞鐵0. 01克，硝酸鈉I克,水1000毫升，pH自然。培養溫度28°C±1°C。發酵時間5-7天。發酵培養特征培養第I天，菌體為少量淡粉色的粉末；培養第3天，淡粉色的細粉末減少，出現粉色的小菌絲球；培養第5天，粉紅色菌絲球繼續增多，并且體積變大，發酵液為橙紅色；培養第7天，出現大量紅色的菌絲球，體積也變大，發酵液為橙紅色。內生真菌的發酵工藝如下菌種一活化一一級種子培養一培養(28°C ±1°C，5_7天)一接種(接種針三環)一二級種子培養一培養(搖床160轉/分，28°C ±2°C，2-3天)一接種(接種量5%)—發酵(250毫升三角瓶，28°C ±2°C，5-7天)一銀杏內生真菌發酵物。上述發酵工藝中，銀杏內生真菌菌種的發酵條件如下(I)發酵方式液體發酵。(2)種子培養一級種子培養為馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基；二級種子培養為液體培養基。馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基的制備取新鮮去皮馬鈴薯200克，切成小塊，加蒸餾水I升煮沸25分鐘，過濾棄馬鈴薯，濾液加蒸餾水補足至I升，加入葡萄糖20克，pH自然，加入瓊脂18克煮沸即可。液體培養基的制備取蒸餾水I升，加入蛋白胨15克，煮沸，然后分別加入葡萄糖20克，氯化鈣0. 5克，磷酸氫二鉀0. I克，硫酸亞鐵0. 01克，硝酸鈉I克，全部溶解，蒸餾水補足至I升，PH自然即可。以上培養基在使用前均在溫度121 °C、壓力0. IMPa下滅菌30min。(3)發酵培養發酵培養基為液體培養基， pH自然。(4)培養時間菌種活化培養5-7天，種子搖床培養時間2-3天，發酵培養時間5_7天。(5)培養溫度種子培養溫度28°C ±2°C，發酵培養溫度28°C ±2°C。(6)發酵完畢，發酵液在無菌條件下過濾除去菌絲體，取發酵液過0. 22微米過濾器后，即為銀杏內生真菌的抗菌發酵液。本發明所述的銀杏內生真菌抗菌發酵液的抗菌試驗I.植物病原真菌辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici),番爺枯萎病菌(Fusariumoxysporum),蘋果腐爛病菌(Cytospora mandshurica),蘋果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides),梨黑星病菌(Venturia pirina),小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)。2.內生真菌的培養將銀杏內生真菌接入250毫升三角瓶中(裝有50毫升液體培養基)，置于(28±2)°C搖床上(160轉/分鐘)旋轉培養7天，無菌條件下過濾除去菌絲體，發酵液樣品備用。3.病原微生物的培養取病原菌的斜面培養物分別接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板活化，在(28±2) °C恒溫箱中培養5天。4.抑制菌絲生長速率法測定抗菌活性在100毫升的無菌三角瓶中加入6毫升抗菌發酵液樣品和54毫升馬鈴薯葡萄糖瓊脂無菌融化的培養基，搖勻，分別各取10毫升置于直徑為9厘米無菌培養皿內制成平板，冷卻后在每個培養基平面放入I個供試病原菌菌餅(直徑為6毫米)，菌餅的菌絲面貼在培養基表面，將平板置于28±1°C培養96小時。采用十字交叉法測定菌落生長直徑，用下述公式計算抑制率
I,對照菌落直徑一處理菌落直徑 M^iKmm(Zo)=對照菌落直徑xl0°表I :本發明所述的腐皮鐮孢菌T-7對六種植物病原微生物的抗菌結果
權利要求
1.銀杏內生真菌的分離純化方法，其特征在干 (1).銀杏組織的準備采集銀杏的根、莖、葉； (2).銀杏組織的表面消毒與無菌檢測將步驟(I)采集的根依次在濃度70%的酒精中浸泡I min、在濃度O. 2%的次氯酸鈉溶液中浸泡2min ;將采集的莖依次在濃度70%的酒精中浸泡50s、在濃度O. 2%的次氯酸鈉溶液中浸泡90s ;將采集的葉片依次在濃度70%的酒精中浸泡40s、在濃度O. 2%的次氯酸鈉溶液中浸泡60s ;將浸泡過的根、莖、葉用無菌水沖洗3次，陰干，得到消毒后的根、莖、葉；用消毒手術刀將消毒后的根、莖、葉分別切成O. 5cmXO. 5 cm大小的根塊、莖塊、葉塊；接著將一部分根塊、莖塊、葉塊直接種植于第一塊馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，溫度24 28°C恒溫培養，培養3 7天; 將另一部分根塊、莖塊、葉塊進行無菌檢測采用組織印跡法，將根塊、莖塊、葉塊置于第二塊馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板上輕輕滾動或緊貼培養基放置2 min，接著移去根塊、莖塊、葉塊，在溫度28°C恒溫培養，培養7天，無雜菌長出即說明消毒后的根塊表面、莖塊表面、葉塊表面無菌；所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基配方為馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂18克、蒸餾水I升；使用前馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基在溫度121°C、壓カ·O.IMPa 下滅菌 30 min ； (3).銀杏組織內生真菌的分離培養當步驟(2)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板上銀杏的根塊、莖塊、葉塊周圍長出菌絲時，采用尖端菌絲挑取法，接種于第三塊馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，溫度24 28°C恒溫培養，培養3 10天，長出完整菌落，即為銀杏內生真菌；銀杏內生真菌的菌落質地較薄，菌落表面絨狀，中央為淡黃色，四周為白色，無色素產生，背面帯黃色至黃褐色； 本發明所述的銀杏內生真菌菌株ITS基因組由597個堿基(bp)組成，系列如下 ·ITTCGMCCGGC CTTATTGATA TGCTTAAGTT CAGCGGGTAT TCCTACCTGA ·51TTCGAGGTCA ACATTCAGAA GTTGGGTGTT TTACGGCGTG GCCGCGCCGC ·101 TCTCCAGTTG CGAGGTGTTA GCTACTACGC AATGGAAGCT GCGGCGGGAC ·151 CGCCACTGTA TTTGGGGGAC GGCGTTGTGC CCGCAGGGGG CTTCCGCCGA ·201 TCCCCAACGC CAGGCCCGGG GGCCTGAGGG TTGTAATGAC GCTCGAACAG ·251 GCATGCCCGC CAGAATACTG GCGGGCGCAA TGTGCGTTCA AAGATTCGAT ·301 GATTCACTGA ATTCTGCAAT TCACATTACT TATCGCATTT CGCTGCGTTC ·351 TTCATCGATG CCAGAGCCAA GAGATCCGTT GTTGAAAGTT TTAATTTATT ·401 TGCTTGTTTA CTCAGAAGAA ACATTATAGA AACAGAGTTA GGGGGTCCTC · 451 TGGCGGGGGC GGCCCGTGTT ACGGGGCCGT CTGTTCCCGC CGAGGCAACG · 501 TTATAGGTAT GTTCACAGGG TTGATGAGTT GTATAACTCG GTAATGATCC · 551 CTCCGCTGGT TCACCAACGG AGACCTTGTT ACGACTTTTT ACTTCCA 本發明所述的銀杏內生真菌命名為腐皮錸孢菌(Fusarium solani T-7),現保藏在中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2011年7月20日，保藏編號為 CGMCC No. 5089。
全文摘要
本發明涉及銀杏內生真菌的分離純化方法。包括以下操作步驟(1).銀杏組織的準備采集銀杏的根、莖、葉，溫度4℃條件下保藏；(2).銀杏組織的表面消毒與無菌檢測；(3).銀杏組織內生真菌的分離培養。本發明所描述的銀杏內生真菌命名為腐皮鐮孢菌(FusariumsolaniT-7)，現保藏在國家知識產權局指定的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2011年7月20日，保藏編號為CGMCCNo.5089。本發明的銀杏內生真菌具有廣譜抗菌活性的腐皮鐮孢菌T-7(FusariumsolaniT-7)菌株的微生物學地位，同時發現該菌對供試六種植物病原真菌具有較為明顯的抑制菌絲生長作用。本發明利用植物內生真菌資源，以求獲得抗植物病原真菌病害新型農用抗生素類天然成分。
文檔編號C12R1/77GK102676398SQ201210067829
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月14日 優先權日2012年3月14日
發明者吳祥為, 唐俊, 操海群, 李學德, 柏鈺, 花日茂, 郭正彥 申請人:安徽農業大學