專利名稱：一種液體耐高溫酸性甘露聚糖酶的制作方法
技術領域：
本發明屬于酶制劑領域，具體涉及一種液體耐高溫酸性甘露聚糖酶的制作方法。
背景技術：
甘露聚糖酶(endo-1, 4_β -mannanase)是一種新型的酶制劑,屬于一種半纖維素酶類，它除具有一般非淀粉多糖(NSP)酶類的作用——降解NSP，降低腸道粘度，促進營養物質的消化和吸收外；近來很多研究表明，甘露聚糖酶還是一種多功能的促生長劑，它可促進類胰島素生長因子IGF-I的分泌，促進蛋白質的合成，提高瘦肉率；同時，它還可消除豆類中富含的β_甘露聚糖對葡萄糖吸收的干擾，極大提高餅柏尤其是豆柏的能量消化率。實際使用中還可看出，添加了甘露聚糖酶后動物的抵抗力及整齊度都有提高。實踐證明，甘露聚糖酶已超脫了傳統酶制劑的作用，成為一種新型的促生長飼料添加劑。甘露聚糖酶可以分解玉米-豆柏型飼糧中的甘露聚糖為甘露寡糖。甘露寡糖作為一種生物化學益生素，可以改善腸道微生物組成，形成以雙歧桿菌和乳酸菌為優勢的腸道菌群。據報道，甘露寡糖可作為營養物質被雙歧桿菌和乳酸桿菌選擇性發酵利用，并促進其生長繁殖。但大腸桿菌、沙門氏菌等致病性菌卻因無法利用而導致饑餓死亡。除此之外，甘露寡糖可與病原菌細胞壁上的受體結合，從而阻止細菌與動物腸黏膜上的糖基結合，保護腸黏膜結構和功能的完整，又由于甘露寡糖為非消化性物質，這種復合物就順利通過胃腸道被排出體外，因而起到吸附腸道病原菌，對動物具有保健的作用。甘露寡糖不僅能連接到細菌上，而且能連接在毒素、病毒、真核生物上，結合后甘露寡糖可作為這些外源性抗原的助劑，緩解抗原的吸收，增強機體的細胞免疫和體液免疫。甘露寡糖不僅直接參與免疫調節而部分替代抗生素，在其與抗生素共用中，還能起到降低機體組織抗生素殘留的作用。在飼料加工過程和動物采食后，酶制劑一般要經受高溫高濕制粒的破壞，胃酸和胃蛋白酶的損害，能夠到達動物體內作用位點依然存留活性的那部分酶活稱為有效酶活。 這要求相應酶種具有良好耐熱耐酸性能、抗胃蛋白酶、胰蛋白酶特性等等。良好的飼料酶有較寬的溫度作用范圍，保證既能在動物體溫的溫度下表現有較高的酶活，又能對飼料高溫高濕制粒過程中表現出較好的耐受性；既能耐受胃酸的損害，在胃的酸性環境及小腸的中性環境下也能具有較高的酶活表現。近年來，甘露聚糖酶一般由畢赤酵母流加甲醇液體發酵后，板框過濾或碟片離心生產出一些較低品質的甘露聚糖酶。雖然也有報道甘露聚糖酶由黑曲霉固體發酵的研究， 但也未見其實際發酵生產及提取制造。本發明是由根霉固體發酵后，選用適合粗料分離的三足式離心機分離，生產出耐酸性耐高溫的甘露聚糖酶。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種液體耐高溫酸性甘露聚糖酶及其制作方法。本發明液體耐高溫酸性甘露聚糖酶的制作方法，其步驟包括浸泡按根霉固體發酵曲料水=I 8-16的重量比例投料，將曲料投入水中浸泡，浸泡用水pH調至4. 5，攪拌2-3小時，得混合液；
離心將混合液置于離心機中在轉速800-1200rpm的條件下離心10_15min ；
過濾取離心后的上清液置于過濾機中，加入占上清液重量7-10%的硅藻土，過濾獲得濾清液；
超濾濃縮膜分子量10000，濃縮至濾清液體積的1/8-1/12 ；
防腐穩定在濃縮液中加入防腐劑和穩定劑，其加入的重量比例是，濃縮液山梨醇 甘油:山梨酸鉀=85 10 5 :0. 1，攪勻。以上所說的離心機采用三足式離心機；過濾機為板框過濾機。由上述方法制作液體耐高溫酸性甘露聚糖酶也在本發明的保護范圍之內。上述液體耐高溫酸性甘露聚糖酶，其含甘露聚糖酶10000U / ml ο本發明的有益效果在于，和普通的由畢赤酵母流加甲醇液體發酵生產甘露聚糖酶等方法相比，無論是從耐酸性還是從耐熱性方面來看，都明顯的具有優勢
從耐酸性上看，本發明的甘露聚糖酶比AB MP1000耐酸性pHl. O,比和美酵素耐酸性 pH3. 5，比01畢赤酵母耐酸性pH2. 5，比BSA細菌耐酸性pHl. 5，比BSA米曲霉耐酸性pHl. 0， 比K畢赤酵母耐酸性pH2. 5 ；
從耐熱性上看，本甘露聚糖酶比AB MP1000耐高溫3-5°C，比和美酵素耐高溫約13°C， 比01畢赤酵母耐高溫約12°C，比BSA細菌耐高溫30°C，比BSA米曲霉耐高溫2 V，比K畢赤酵母耐高溫約13°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作更進一步的說明，以便本領域的技術人員更了解本發明，但并不因此限制本發明。實施例I
浸泡按根霉固體發酵曲料與水按I :8的比例混合，浸泡水用乙酸調PH4. 5，攪拌3小
時；
離心在轉速IOOOrpm的條件下在三足式離心機中離心IOmin,離心后取上清液；
板框過濾加入8%硅藻土，用板框過濾機過濾獲得濾清液；
超濾濃縮膜分子量10000，濃縮至濾清液體積的1/9. 5 ；
防腐穩定按濃縮液山梨醇甘油山梨酸鉀=85 10 5 :0. I的比例在濃縮液中加入穩定劑、防腐劑，攪勻。材料的來源
曲料由根霉固體發酵而成
本發明所用檢測方法——酶活性檢測方法具體檢測方法如下
分光光度法甘露聚糖酶活力測定 A. I甘露聚糖酶活力測定
A. I. I定義在pH為5. 5，溫度為37°C條件下，每分鐘從濃度為3 mg/ml的甘露聚糖 (Sigma G0753)溶液中降解釋放I μ mo I還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位U。A. I. 2試劑和溶液A. I. 2. I氫氧化鈉溶液,濃度C (NaOH)為200 g/L
稱取氫氧化鈉20. O g,加水溶解,定容至100 ml οA. I. 2. 2 乙酸溶液，濃度 c (CH3COOH)為 O. I mol/L
吸取冰乙酸O. 60 ml，加水溶解，定容至100 ml。A. I. 2. 3 乙酸鈉溶液，濃度 c (CH3COONa)為 O. I mol/L
稱取三水乙酸鈉I. 36 g，加水溶解，定容至100 ml。A. I. 2. 4 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，c (CH3COOH — CH3COONa)為 O. I mol/L, pH 值
為 5. 5 :
稱取三水乙酸鈉23. 14 g，加入冰乙酸I. 70 ml。再加水溶解，定容至2000 ml。測定溶液的PH值。如果pH值偏離5. 5，再用乙酸溶液(A. 1.2. 2)或乙酸鈉溶液(A. I. 2. 3)調節至 5. 5oA. I. 2. 5 甘露糖溶液，C (C6H12O6)為 10. Omg/ml
稱取無水D-甘露糖I. OOOg,加水溶解，定容至IOOml。A. 1.2.6 0.6% (w/v)的甘露聚糖溶液
稱取甘露聚糖(Sigma G0753)0.60g，加入80ml乙酸一乙酸鈉緩沖溶液。磁力攪拌，同時緩慢加熱，直至甘露聚糖完全溶解(注在攪拌加熱的過程中可以補加適量的緩沖液，但是溶液的總體積不能超過100ml。)。然后停止加熱，繼續攪拌30min，用乙酸一乙酸鈉緩沖溶液定容至100ml。甘露聚糖溶液能立即使用，使用前適當搖勻。4°C避光保存，有效期為3 天。A.1.2.7DNS 試劑
稱取3，5- 二硝基水楊酸3. 15g (化學純)，加水500 ml，攪拌5 S，水浴至45°C。然后逐步加入100 ml氫氧化鈉溶液(A. 1.2. 1)，同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明(注意在加入氫氧化鈉過程中，溶液溫度不要超過48°C。)。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91. O g、苯酚 2. 50 g和無水亞硫酸鈉2. 50 g。繼續45°C水浴加熱，同時補加水300 ml，不斷攪拌，直到加入的物質完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1000 ml。用燒結玻璃過濾器過濾。取濾液，儲存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7天后可以使用，有效期為6個月。A. I. 3儀器、設備
A. I. 3. I實驗室用樣品粉碎機或碾缽。A. I. 3. 2 分樣篩孔徑為 O. 25 mm (60 目)。A. I. 3. 3 分析天平感量 O. 001 g。A. I. 3. 4 pH if :精確至 0. 01。A. I. 3. 5磁力攪拌器附加熱功能。A. I. 3. 6電磁振蕩器。A. I. 3. 7燒結玻璃過濾器孔徑為O. 45 μ m。A. I. 3. 8 離心機:4000 r/min。A. I. 3. 9恒溫水浴鍋溫度控制范圍在30— 60°C之間，精度為O. 1°C。A. I. 3. 10秒表每小時誤差不超過5s。A. I. 3. 11分光光度計能檢測350— 800nm的吸光度范圍。A. I. 4分析步驟A. I. 4. I標準曲線的制作
吸取緩沖液(A. I. 2. 4) 4. 0ml，加入DNS試劑5. 0ml，沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，用水定容至25. Oml，制成標準空白樣。分別吸取甘露糖溶液(A.I. 2. 5) I. 00,2. 00,3. 00,4. 00,5. 00,6. 00 和 7. 00ml，分
別用緩沖液(A. I. 2. 4)定容至100ml，配制成濃度為O. 10—0. 70mg/ml D-甘露糖標準溶液。分別吸取上述濃度系列的甘露糖標準溶液各2. OOml (做二個平行)，分別加入到刻度試管中，再分別加入2ml水和5mlDNS試劑。電磁振蕩3s，沸水浴加熱5min。然后用自來水冷卻到室溫，再用水定容至25ml。以標準空白樣為對照調零，在540nm處測定吸光度OD值。以甘露糖濃度為Y軸、吸光度OD值為X軸，繪制標準曲線。每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標準曲線。A. I. 4. 2試樣溶液的處理
固體樣品應粉碎或充分碾碎，然后過60目篩(孔徑為O. 25 mm)，按照附錄B中建議的稱樣量稱取試樣兩份，精確至O. 001 g。加入50 ml乙酸一乙酸鈉緩沖溶液(A. 1.2.4)。磁力攪拌30 min，再用緩沖溶液(A. I. 2. 4)定容至100 ml，在4°C條件下避光保存24h。上離心機離心3 min。取O. 5ml上清液，再用緩沖溶液(A. I. 2. 4)做適當稀釋。(稀釋后的待測酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在O. 04—0. 08 u/ml之間)。液體樣品可以直接用緩沖溶液(A. I. 2. 4)進行稀釋、定容。稀釋后的待測酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在O. 04—0. 08 u/ml之間)。A. I. 4. 3 測定步驟
吸取10. Oml甘露聚糖溶液(A. I. 2. 6)，37°C平衡lOmin。吸取10. Oml經過適當稀釋的酶液,37°C平衡lOmin。吸取2. OOml經過適當稀釋的酶液(已經過37°C平衡)，加入到刻度試管中，再加入 5mlDNS試劑，電磁振蕩3s。然后加入2. Oml甘露聚糖溶液(A. I. 2. 6)，37°C保溫30min,沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫,加水定容至25ml,電磁振蕩3s。以標準空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光度AB。吸取2. Oml經過適當稀釋的酶液(已經過37°C平衡)，加入到刻度試管中，再加入 2. Oml甘露聚糖溶液(A. I. 2. 6)(已經過37°C平衡)，電磁振蕩3s，37°C精確保溫30min。加入5. OmlDNS試劑，電磁振蕩3s，酶解反應。沸水浴加熱5min，用自來水冷卻至室溫，加水定容至25ml，電磁振蕩3s。以標準空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光度AE。A. I. 5 計算
XD = [ (AE - AB) XK + CO] X 1000 /M/t (I)
X = XD · Df(2)
式中
XD —試樣稀釋液的甘露聚糖酶活力，U/ml ；
AE —酶反應液的吸光度；
AB —酶空白樣的吸光度；
K 一標準曲線的斜率；
CO 一標準曲線的截距；M 一甘露糖的分子量(180. 2)；； t —酶解反應時間，min ；
1000 —轉化因子，Immol = 1000 μ mol。XD值應在O. 04 — O. 08 U/ml之間。如果不在這個范圍內，應重新選擇酶液的稀釋度，再進行分析測定。X 一試樣中甘露聚糖酶的活力，U/g或U/ml ；
Df —試樣的總稀釋倍數。A. I. 6結果允許偏差
同一試樣兩個平行測定值的相對誤差不超過8. 0%，二者的平均值為最終的酶活力測定值(保留三位有效數字)。本發明所使用的設備均為本行業常用設備，包括浸泡罐、三足式離心機、混液罐、 板框、清液罐、超濾器。pH 性質
配制A溶液0. 05mol/l的檸檬酸溶液，B溶液0. lmol/1的磷酸氫二鈉溶液，將A. B兩種溶液按一定比例混合，并以A或B調整pH至2. 5,3. 0,3. 5,4. O……8. 5的緩沖液。用蒸餾水配制底物溶液。準確稱取酶樣品I. Og于50ml容量瓶中，加入40ml蒸餾水，磁力攪拌30min，靜置一段時間，用蒸餾水定容。再以不同PH的緩沖液作適當稀釋，按照測定方法進行測定酶活。
權利要求
1.一種液體耐高溫酸性甘露聚糖酶的制作方法，包括下述的步驟浸泡根霉固體發酵曲料，再將混合液離心去渣后過濾，再將濾液超濾濃縮，得濃縮液， 在濃縮液中加入防腐劑和穩定劑，制得液體甘露聚糖酶。
2.根據權利要求I所述液體耐高溫酸性甘露聚糖酶的制作方法，其所述根霉固體發酵曲料浸泡、離心、過濾、超濾、防腐穩定各步驟的具體條件如下浸泡按根霉固體發酵曲料水=I 8-16的重量比例投料，將曲料投入水中浸泡，浸泡用水pH調至4. 5，攪拌2-3小時，得混合液；離心將混合液置于離心機中在轉速800-1200rpm的條件下離心10_15min ；過濾取離心后的上清液置于過濾機中，加入占上清液重量7-10%的硅藻土，過濾獲得濾清液；超濾濃縮膜分子量10000，濃縮至濾清液體積的1/8-1/12 ；防腐穩定在濃縮液中加入防腐劑和穩定劑，其加入的重量比例是，濃縮液山梨醇 甘油:山梨酸鉀=85 10 5 :0. 1，攪勻。
3.根據權利要求2所述液體耐高溫酸性甘露聚糖酶的制作方法，其中所述的離心機為三足式離心機。
4.根據權利要求2所述液體耐高溫酸性甘露聚糖酶的制作方法，其中所述的過濾機為板框過濾機。
5.按照權利要求1、2所述的任一方法制得的一種液體耐高溫酸性甘露聚糖酶。
全文摘要
本發明屬于酶制劑領域，具體涉及一種液體耐高溫酸性甘露聚糖酶的制作方法。該方法包括下述的步驟浸泡根霉固體發酵曲料，再將混合液離心去渣后過濾，再將濾液超濾濃縮，得濃縮液，在濃縮液中加入防腐劑和穩定劑，制得液體甘露聚糖酶。本發明的有益效果在于，和普通的由畢赤酵母流加甲醇液體發酵生產甘露聚糖酶等方法相比，無論是從耐酸性還是從耐熱性方面來看，本發明的方法生產的甘露聚糖酶其耐酸性強，耐熱性高。
文檔編號C12N9/42GK102586209SQ20121006828
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月15日 優先權日2012年3月15日
發明者郭芳坤 申請人:濟南諾能生物工程有限公司