專利名稱：采用復合est-ssr標記進行大白菜品種鑒定的方法
技術領域：
本發明屬于農業的蔬菜育種與應用技術領域，具體涉及12份大白菜雜交種品種鑒定方法，是一種基于復合EST-SSR標記的高效進行大白菜品種鑒定的方法。
背景技術：
隨著植物育種和種子產業的發展，植物新品種保護(Protection of New Varieties of Plant，簡稱PVP)作為知識產權的10種內容之一，其重要性越來越突出。培育和推廣新的優良品種是我國蔬菜育種發展的重要方向，因此新品種的準確鑒定不僅是新品種審定和保護的前提，也為辨別假冒偽劣種子，保護自身知識產權，維護育種家的切身利益提供保障和科學依據。因此，開發高效、準確的種子品種鑒定方法已成為種子科研單位和企業共同關注的課題。大白菜是原產于我國并廣受歡迎的蔬菜，栽培面積極廣，品種的差異直接影響這類蔬菜的生產和使用性能，因此對商用種子品種的鑒別尤為重要，同時新品種的登記測試以及資源種質遺傳性分析都需要有別于傳統的形態標記田間檢測的更加高效、準確、低成本以及操作方便的分子水平品種鑒定方法。近年來隨著分子生物學的發展，各種分子標記技術在雜交種品種鑒定中得到了大量應用。遺傳標記經過形態標記、細胞學標記、蛋白質標記發展到DNA標記。DNA標記是DNA 水平上遺傳多態性的直接反映，表現為核苷酸序列上的差異，因此標記在數量上幾乎是無限的。與以往遺傳標記相比，DNA標記還具有無表型效應，不受環境影響等優點，廣泛應用到種質資源研究、遺傳圖譜構建、目的基因定位和分子標記輔助選擇等方面，成為理想的快速進行種子品種鑒定的檢測方法之一，其中RAPD、RFLP、AFLP、SSR及ISSR標記等在雜交種品種鑒定中都有應用。簡單重復序列(Simplesequence repeat, SSR)也叫微衛星(Microsatellites )。與其它分子標記技術相比，SSR標記具有多態信息含量聞、共顯性遺傳、技術簡單、重復性好、特異性強等特點，已被廣泛應用于植物遺傳研究和育種實踐中。根據建立SSR標記的序列性質不同，SSR標記可分為基因組SSR ( Genomic SSR，gSSR)和表達序列標簽SSR (Expressed sequence tag SSR, EST-SSR)等。
常規SSR分子標記開發需要構建基因組文庫、制備探針和分子雜交等過程，極大地制約了其發展和應用。隨著功能基因組學的迅速發展，Gen Bank中積累了許多重要物種的大量EST (expressed sequence tag)序列，這些序列已經成為發展SSR標記(EST-SSR) 的重要來源。與來自基因組中SSR標記相比，不僅具有基因組SSR標記的多態性高、共顯性、重復性好的特點，而且開發成本相對低廉。同時EST-SSR標記位于基因的轉錄部分，因而與功能基因緊密連鎖。目前EST-SSR標記已經應用于水稻(Cho et a7.，2000)、葡萄( Scott et al. , 2000 )、小麥(Gupta et al. , 2003 ；Gao et al. , 2004 ； Nicot et al. , 2004 )、黑麥(Hackauf et a入，2002)、大麥(Thiel et a7. ,2003)和扁桃(Xu et a7. ,2004) 、玉米(Wang and Bowen, 1998)、甘鹿(Cordeiro et al. , 2001)等植物進行分子連鎖圖譜構建和遺傳多樣性分析。

發明內容
本發明的目的在于在分子標記最新研究成果的基礎上，發展EST-SSR多重標記組合及其檢測技術，擴大SSR標記的多態信息量，彌補其位點少的缺陷，一次擴增反應可以得到多個多態標記同時對大白菜多個品種進行鑒別。公開了一種采用復合EST-SSR標記進行大白菜品種鑒定的方法。為實現上述目的，本發明提供如下的技術方案
用于大白菜品種鑒定的EST-SSR引物，其特征在于，包括I套或II套EST-SSR復合引物，其中的I套EST-SSR復合引物包括
BCl 上游引物序列5’ - TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3，，BCl 下游引物序列5’ -CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3，；BC19 上游引物序列5’ - TTGAAACTTGGTTGACGACG -3’， BC19 下游引物序列5’ - TTCTTCTTTGCGGCTGATTT -3，；BC26 上游引物序列5’ -ATAACAACAACCTGCCCGAG _3’，BC26 下游引物序列5’ - GAAGCACAAGAACAGGGCTC -3’ ；
II套EST-SSR復合引物，包括BCl上游引物序列5’ - TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3，，BCl 下游引物序列5’ - CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3，；BC9 上游引物序列5’ -ACCTTCCGTCTCTGGGTCTT -3’，BC9 下游引物序列5’ - TTTTGAACGAGGTGGAGGAC -3’ ； BClO 上游引物序列5’ - GAATCCTTTGGAAACGACGA _3’，BClO 下游引物序列:5’ -GGGGACACAATTCTCCTGAA -3’ ；BC16 上游引物序列5’ - CTTGCAAATGACCTGCTTGA -3’， BC16 下游引物序列5’ - GGGAGTTGGAGATGAGGTGA -3’ ；BC27 上游引物序列5’ -ATCCAAAAGGAAGAATCCCG _3’，BC27 下游引物序列5’ - AAACGAGAATTTTCCTGCGA -3’ 。本發明進一步公開了采用復合EST-SSR標記進行大白菜品種鑒定的方法，其特征在于按如下步驟的步驟進行
(O采用權利要求I所述的復合EST-SSR引物對供試品種樣品模板DNA進行PCR擴增，其中的PCR擴增反應的總體積為10 μ L，擴增反應體系為2XGoTaq Master Mixes 5 μ L，上游和下游引物10 μ mo I/L各O. 25 μ L，供試品種大白菜雜交種基因組DNA模板，濃度 50 ng/yL，lyL，雙蒸水補足10 μ L ;PCR反應程序為94°C預變性5 min，35個擴增循環 (940C I min,53. 5°C 45 sec, 72°C 45 sec) ;72°C延伸 7 min，4°C保存；
(2)對PCR擴增產物進行凝膠電泳，非變性聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，凝膠組分為去離子水 21mL，10XTBE 3 mL,40% PAG 6 mL, TMED 30 μ L，10% 過流酰胺 300 μ L ;設定電壓250 V，電泳I h，關閉電源，進行染色；染色過程銀染8 10 min，迅速水洗，NaOH顯色數分鐘，直至條帶清晰即可，再次水洗；
(3)通過分析EST-SSR結果，比較12份大白菜品種間多態性位點的差異，確定2套復合引物的多態率及多態信息量；在相同遷移率位置上進行“1，0”標注，構建12份大白菜品種的SSR分析譜帶數據，通過數據分析復合引物是否可對12份大白菜品種進行完全的區分， 同時構建12份大白菜品種的指紋圖譜；
其中所述的上游和下游引物lOymol/L各O. 25yL，指的是I套EST-SSR復合引物中BCl上游引物O. 25 μ L、BCl下游引物O. 25 μ L，BC19上游引物O. 25 μ L、BC19下游引物 O. 25μ L，BC26上游引物O. 25μ L、BC26下游引物O. 25 μ L，或II套EST-SSR復合引物中BCl上游引物0. 25 u L、BCl下游引物0. 25 u L，BC9上游引物0. 25 u L、BC9下游引物0. 25 u L， BClO上游引物0. 25 u L, BClO下游引物0. 25 u L, BC16上游引物0. 25 u L, BC16下游引物 0. 25 u L, BC27上游引物0. 25 u L、BC27下游引物0. 25 Uし本方法通過對12份供試大白菜雜交種進行DNA提取、PCR擴增和EST-SSR分析， 確認了這套技術和組合可以表達大白菜品種間的多態性，能夠高效準確的對大白菜品種進行鑒定。用于對大白菜品種進行鑒定的2套復合EST-SSR引物組合如表I所示。表I引物序列表如下
權利要求
1.用于大白菜品種鑒定的EST-SSR引物，其特征在于，包括I套或II套EST-SSR復合引物，其中的I套EST-SSR復合引物包括BCl 上游引物序列5’ - TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3，，BCl 下游引物序列5’ -CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3，；BC19 上游引物序列5’ - TTGAAACTTGGTTGACGACG -3’， BC19 下游引物序列5’ - TTCTTCTTTGCGGCTGATTT -3，；BC26 上游引物序列:5，-ATAACAACAACCTGCCCGAG _3’，BC26 下游引物序列5’ - GAAGCACAAGAACAGGGCTC -3’ ；II套EST-SSR復合引物，包括BCl上游引物序列5’ - TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3，，BCl 下游引物序列5’ - CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3，；BC9 上游引物序列5’ -ACCTTCCGTCTCTGGGTCTT -3’，BC9 下游引物序列5’ - TTTTGAACGAGGTGGAGGAC -3’ ； BClO 上游引物序列5’ - GAATCCTTTGGAAACGACGA _3’，BClO 下游引物序列:5’ -GGGGACACAATTCTCCTGAA -3’ ；BC16 上游引物序列5’ - CTTGCAAATGACCTGCTTGA -3’， BC16 下游引物序列5’ - GGGAGTTGGAGATGAGGTGA -3’ ；BC27 上游引物序列5’ -ATCCAAAAGGAAGAATCCCG _3’，BC27 下游引物序列5’ - AAACGAGAATTTTCCTGCGA -3’ 。
2.一種采用復合EST-SSR標記進行大白菜品種鑒定的方法，其特征在于按如下步驟的步驟進行(1)采用權利要求I所述的復合EST-SSR弓丨物對供試品種樣品模板DNA進行PCR擴增，其中的PCR擴增反應的總體積為10 μ L，擴增反應體系為2XGoTaq Master Mixes 5 μ L，上游和下游引物10 μ mo I/L各O. 25 μ L，供試品種大白菜雜交種基因組DNA模板，濃度 50 ng/yL，lyL，雙蒸水補足10 μ L ;PCR反應程序為94°C預變性5 min，35個擴增循環 (940C I min, 53. 5°C 45 sec, 72°C 45 sec) ;72°C延伸 7 min，4°C保存；(2)對PCR擴增產物進行凝膠電泳，非變性聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，凝膠組分為去離子水 21mL，10XTBE 3 mL,40% PAG 6 mL, TMED 30 μ L，10% 過流酰胺 300 μ L ;設定電壓250 V，電泳I h，關閉電源，進行染色；染色過程銀染8 10 min，迅速水洗，NaOH顯色數分鐘，直至條帶清晰即可，再次水洗；(3)通過分析EST-SSR結果，比較12份大白菜品種間多態性位點的差異，確定2套復合引物的多態率及多態信息量；在相同遷移率位置上進行“1，0”標注，構建12份大白菜品種的SSR分析譜帶數據，通過數據分析復合引物是否可對12份大白菜品種進行完全的區分， 同時構建12份大白菜品種的指紋圖譜；其中所述的上游和下游引物lOymol/L各O. 25 μ L，指的是I套EST-SSR復合引物中BCl上游引物O. 25 μ L、BCl下游引物O. 25 μ L，BC19上游引物O. 25 μ L、BC19下游引物O.25μ L，BC26上游引物O. 25μ L、BC26下游引物O. 25 μ L，或II套EST-SSR復合引物中BCl 上游引物O. 25 μ L、BCl下游引物O. 25 μ L，BC9上游引物O. 25 μ L、BC9下游引物O. 25 μ L， BClO上游引物O. 25 μ L、BClO下游引物O. 25 μ L，BC16上游引物O. 25 μ L、BC16下游引物O.25 μ L, BC27 上游引物 O. 25 μ L、BC27 下游引物 O. 25 μ L。
全文摘要
本發明公開了一種采用復合EST-SSR標記進行大白菜品種鑒定的方法。該方法以12份大白菜雜交種的基因組DNA為模板，通過對大白菜EST序列的分析，合成了30對核心EST-SSR引物。經過篩選，得到2套標記組合完全鑒別了12份大白菜品種的差異，經田間驗證試驗引物穩定性良好，且與田間試驗結果較為吻合，確認了這套技術和組合可以表達大白菜品種間的多態性，能夠高效準確的對大白菜品種進行鑒定。本發明的檢測方法在4h之內即可完成種子品種鑒定工作，具有高效、準確、低成本、操作方便等優勢。可以有效的對大白菜種子真偽進行監控，保護了作物品種，防止假冒偽劣品種進入市場，也為新品種登記測試以及資源種質遺傳性分析提供了有力的技術手段。
文檔編號C12N15/11GK102586459SQ20121006837
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月15日 優先權日2012年3月15日
發明者蘭青闊, 朱珠, 王永, 程奕, 趙新, 郭永澤, 陳銳 申請人:天津市農業科學院中心實驗室