專利名稱：RSV的RNAi調節及其治療應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及呼吸道合胞病毒(RSV)的治療領域以及調節病毒復制的組合物和方法，更特別地說，本發明涉及寡核苷酸通過RNA干擾而對呼吸道合胞病毒的基因進行下調， 所述寡核苷酸通過吸入施用/鼻內施用而被局部施用至肺和鼻通道，或通過注射/靜脈內注射而施用至全身。
背景技術：
呼吸道由于其本來所具有的功能而暴露于大量的經空氣傳播的引起多種呼吸性疾病的病原體中。在發達國家，呼吸道的病毒感染是造成嬰兒住院的最常見原因，在美國每年約有91，000名嬰兒因此而住院，花費3億美元。人類呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒(PIV)是呼吸道疾病的兩種主要因素；它們感染上呼吸道以及下呼吸道，導致義膜性喉炎、肺炎和細支氣管炎(Openshaw，P. J. M. · Respir. Res. 3 (Suppl I)，S15-S20 (2002)， Easton, A. J.，et al.，CHn. Microbiol. Rev. 17，390-412 (2004))。單獨的 RSV 感染約 65% 的一歲以內的嬰兒，在嬰兒生命的最初兩年內幾乎全都被該病毒所感染。該病毒在老年人中也是疾病和死亡的主要原因。RSV感染后的免疫反應并不完全，而且也不能持久，因此在所有年齡組中都會發生重復感染。罹患過RSV細支氣管炎的嬰幼兒在以后的生命過程中容易發生哮鳴和哮喘。近40年來一直在進行關于可有效治療RSV的方法的研究以及關于RSV疫苗的研究，但是收效甚微(Openshaw, P. J. M. · Respir. Res. 3 (Suppl I), S15-S20(2002)，Maggon，K. et al, Rev. Med. Virol. 14,149-168 (2004)) 目前，臨床上尚無針對任一種RSV的疫苗。在諸如牛、山羊、豬、綿羊等非人類的動物體內也有這兩種病毒的病毒株的存在，導致農業、乳品業和肉業的損失(Easton, AJ. , et al. , CHn. Microbiol. Rev.17,390-412(2004))ο兩種RSV病毒都含有不分節的負鏈RNA基因組(nonsegmented negative-strandRNA genome)且均屬于副黏病毒(Paramyxoviridae)科。這些病毒所具有的多種特性致使對其難于進行預防和治療。由于RNA基因組缺乏復制校正閱讀能力，因而病毒基因組以高速率發生變異，這對于確定可靠的疫苗或抗病毒藥提供了巨大的挑戰(Sullender, ff. M. CHn. Microbiol. Rev. 13,1-15 (2000))。部分由于病毒發展出位于F基因上的抗性突變，因而RSV融合蛋白(F)這類有前途的抑制劑也已被放棄 (Razinkov, V,et. al.，Antivir. Res. 55,189-200(2002)，Morton,CJ. et al. Virology 311， 275-288(2003))。兩種病毒都與細胞蛋白相結合，從而為獲得用于疫苗的不含細胞的病毒物質增加了困難(Burke, E.，et al.，Virology 252,137-148 (1998), Burke, E.，et al.， J. Virol. 74，669-675 (2000)，Gupta, S.，et al.，J. Virol. 72，2655-2662 (1998))。最后，兩種病毒，尤其是RSV病毒的免疫性非常復雜(Peebles，R. S.，Jr.，et al.，Viral. Immunol. 16，25-34 (2003)，Haynes, L. M.，et al.，J. Virol. 11，9831-9844 (2003))。 使用未變性的RSV蛋白作為疫苗會導致"免疫增強"或疫苗增強性疾病(Polack，F. P. et al. J. Exp. Med. 196，859-865 (2002))。最近結束的多個抗-RSV的生物制藥項目強調了上述的全部問題。RSV 基因組含有單股負鏈 RNA (single strand of negative sense RNA),該 RNA 為 15，222 核苷酸，產生 11 種主要蛋白(Falsey, A. R. , and E. E. Walsh, 2000, Clinical Microbiological Reviews 13:371-84·)。其中的兩種蛋白即F(融合)和G(粘附)糖蛋白為主要的表面蛋白，且對于誘導保護性免疫是最重要的。SH(小疏水性)蛋白、M(基質) 蛋白以及M2(22kDa)蛋白與病毒外殼相關連，但并不誘導保護性免疫反應。已發現N(主要核殼相關蛋白)、P (磷蛋白)、以及L (主要聚合酶蛋白)蛋白與病毒體RNA相關連。推測 NSl和NS2這兩種非結構性蛋白參與宿主-病毒相互作用，但在傳染性病毒體中并不存在。人類RSV株已被分成主要的兩組，即A和B。已證明G糖蛋白是RSV蛋白中最具趨異性的蛋白。據認為RSV G糖蛋白在兩組RSV中以及在兩組RSV內的易變性對RSV引起疾病每年發作的能力是很重要的。G糖蛋白具有289-299個氨基酸(依RSV株而不同)，具有 90kDa的細胞內、跨膜以及高糖基化的柄結構(stalk structure),并具有肝素結合結構域。 糖蛋白以分泌型和膜結合型存在。目前還沒有用于成功治療RSV感染的方法(Maggon K and S. Bank, 2004，Reviews in Medical Virology 14:149-68)。多數情況下RSV對下呼吸道的感染為自限性疾病。關于如何對患有該疾病的嬰幼兒和兒童進行治療或認為嬰幼兒和兒童何時應該入院或可以出院并不存在權威性的指導方針和標準。RSV感染時可能發生缺氧，這種缺氧可通過鼻插管供氧來處理。對患有呼吸衰竭、休克、或反復呼吸暫停的兒童進行機械通風可降低死亡率。 一些醫生的處方使用類固醇。但是，一些研究已經表明，類固醇治療并不能對因患有細支氣管炎而住院的嬰幼兒或兒童的臨床過程有所影響。這樣，單獨使用皮質類固醇或與支氣管擴張藥聯合使用可能對除了健康的通氣不暢的患者之外的細支氣管炎的治療是無效的。在患有諸如支氣管肺發育不良(bronchopulmonary dysphasia)和氣喘哮喘等潛在性心肺疾病的嬰幼兒和兒童中也使用過類固醇。利巴韋林是一種具有抗病毒活性的鳥苷類似物，自20世紀80年代中期開始已將該藥物用于治療患有RSV細支氣管炎的嬰幼兒和兒童，但是許多評估其用途的研究已表現出該藥物的使用顯示出相矛盾的結果。目前在許多研究中心限于對免疫妥協患者以及患有嚴重疾病的患者使用利巴韋林。有研究表明RSV細支氣管炎的嚴重性與血清視黃醇濃度降低相關，但是在對患有 RSV細支氣管炎的住院兒童所進行的試驗表明，補充維生素A并末帶來有益效果。已證實， 靜脈注射1500mg/kg的RSV免疫球蛋白或吸入100mg/kg免疫球蛋白對于RSV下呼吸道感染基本上也并未表現出有益效果。在發達國家，對RSV下呼吸道感染的治療通常限于對癥治療。由于抗病毒治療花費昂貴且在功效上缺少一致性，因而該種治療通常僅限于在危及生命的時候使用。在發展中國家，氧氣為主要的治療手段(在可利用時)，并且降低死亡率的唯一途徑是進行預防。RNA干擾或"RNAi"最初是由Fire及其合作者創造出的用于描述下述發現的術語即，當將雙鏈RNA(dsRNA)引入至螺蟲(worm)中時,其能夠阻斷基因表達(Fire et al, Nature 391 :806_811，1998)。短的dsRNA在包括脊椎動物在內的許多生物體中介導基因特異性的轉錄后沉默，并為研究基因功能提供新的手段。已有人提出將RNAi作為開發新型治療劑的方法。但是，迄今為止這些大部分還僅停留在建議的階段，并無證據表明RNAi可在治療中應用。因此，目前需要對于安全有效的抗RSV疫苗，特別需要用于嬰幼兒和兒童的抗RSV 疫苗。還需要對所有年齡人群中的RSV感染以及在免疫妥協個體中的RSV感染的治療方法。也需要用于鑒別針對RSV的保護性免疫反應的科學方法從而能對該疾病的致病機理進行研究，并有利于對治療劑以及疫苗的篩選。本發明提供了對調節或預防RSV感染有效的方法以及組合物，從而克服了以往在本領域中所存在的缺陷。更特別地，本發明通過提供下述的iRNA試劑而推進了現有技術，所述iRNA試劑在體內和體外具有降低RSV水平、對兩種主要的RSV亞型均有效果、并且該類分子具有治療活性。

發明內容
本發明是基于對下述內容的論證而完成的，即，通過體內和體外試驗已證實鼻內施用以及腸胃外施用iRNA試劑可抑制RSV ;以及已經鑒定出來自RSV的P、N和L基因的有效的iRNA試劑可降低RSV的A亞型和B亞型的RNA水平。本發明基于上述發現提供了用于降低受試體內RSV mRNA水平、RSV蛋白水平以及RSV病毒效價的特定組合物和方法，所述受試體例如為人等哺乳動物。本發明特別提供了由下述核苷酸組成、基本上由下述核苷酸組成、或含有下述核苷酸的iRNA試劑，所述核苷酸為RSV的一個基因中的至少15個或更多個連續核苷酸，所述 RSV的基因特別為RSV的P、N和L基因；本發明更特別地提供含有選自表I (a_c)中的一個序列中的15個或更多個連續核苷酸。iRNA試劑優選每條鏈由少于30個核苷酸的連續核苷酸組成，例如由每條鏈為21-23個核苷酸的連續核苷酸組成，所述連續核苷酸如表I (a-c) 中所提供。所述雙鏈iRNA試劑可具有平頭末端，更優選該試劑雙鏈的一個或兩個3'末端具有1-4個核苷酸的突出。更進一步地，所述iRNA試劑可以僅含有天然來源的核糖核苷酸亞單元，也可將其合成為在所述試劑所含有的核糖核酸亞單元的一個或多個糖或堿基中進行了一處或多處修飾。還可對iRNA試劑進行修飾從而使之與諸如膽固醇等經選擇用于改善對試劑的穩定性、分布或細胞吸收的配體相連接。所述iRNA試劑可進一步為獨立的形式或為用于本文所述方法的藥物組合物的一部分，特別是作為被配制為用于輸送至肺或鼻通道的藥物組合物或被配制為用于腸胃外施用的藥物組合物。所述藥物組合物可以含有一種或多種iRNA試劑，在一些實施方式中，所述藥物組合物會含有兩種或更多種iRNA試劑，每種iRNA試劑針對一種RSV基因的一個不同的片段或針對兩種不同的RSV基因。本發明進一步提供用于降低細胞中的RSV病毒mRNA水平的方法。如對下文的進一步所述，所述方法包括對受試體施用本發明的iRNA試劑中的步驟。本發明的方法利用與 RNA干擾相關的細胞機制來選擇性降低細胞中的病毒mRNA，其包括使細胞與本發明的抗病毒iRNA試劑中的一種相接觸的步驟。該方法可直接應用于細胞，或可通過將本發明的iRNA 試劑/藥物組合物中的一種施用至受試體而應用于哺乳動物受試體。細胞中病毒mRNA的降低導致所產生的病毒蛋白的量的降低，而組織中病毒mRNA的降低導致復制病毒效價的降低(如實施例所示)。本發明的方法和組合物，例如所述方法以及iRNA試劑組合物可以本文所述的任意劑量和/或劑型進行應用，并且還可以本文所述的任意施用途徑進行應用。更為重要的是iRNA試劑可通過鼻內施用并能抑制呼吸組織中的病毒復制。下文的描述中將結合附圖對本發明的一個或多個實施方式進行詳細描述。所述說明書、附圖以及權利要求將對本發明的其它特征、目的以及優點進行清楚說明。為完成所有目的，將所引用的文獻、專利以及專利申請全文以參考的方式并入至本申請中。


圖I顯示iRNA試劑對RSV的體外抑制。利用實施例中所述的空斑形成試驗來檢測表I (a-c)中所提供的iRNA試劑的抗RSV活性。每一條柱(豎條)表示表I (a_c)中所提供的一種iRNA試劑，例如，柱I為表Ia中的第一試劑，等等。鑒別出活性iRNA試劑。圖2顯示iRNA試劑在體外抑制RSV的劑量響應。利用實施例中所述的空斑形成試驗采用4種濃度對選自表I的活性試劑的抗RSV活性進行檢測。發現所檢測的活性iRNA 試劑具有劑量依賴性反應。圖3顯示iRNA試劑在體外對RSV B亞型的抑制。利用實施例中所描述的空斑形成試驗來檢測圖2中所提供的iRNA試劑對B亞型的抗RSV活性。B亞型受到了所檢測的 iRNA試劑的抑制。圖4顯示iRNA試劑在體內對RSV的抑制。利用實施例中所描述的小鼠模型來檢測圖中所描述的試劑的抗RSV活性。所述iRNA試劑在體內能可有效降低病毒效價。圖5顯示AL-DP-1730對RSV的體內抑制。利用實施例中所提供的方法來檢測 AL-DP-1730的劑量依賴性活性。所述試劑顯示出劑量依賴性反應。圖6顯示iRNA試劑在體內對RSV的抑制。如實施例所述檢測圖中所描述的iRNA 試劑在體內的抗RSV活性。圖7顯示iRNA試劑在體內對RSV的抑制。如實施例所述檢測圖中所描述的iRNA 試劑在體內的抗RSV活性。圖8A顯示利用局部遞送的iRNA試劑在體內對RSV的抑制。圖8B顯示利用氣霧劑遞送的iRNA試劑在體內對RSV的抑制。利用實施例中所提供的方法來檢測圖中所描述的iRNA試劑在體內的抗RSV活性。圖9顯示iRNA試劑在體內對RSV感染的保護。在RSV激發之前對圖中所描述的 iRNA試劑進行檢測以檢測其保護活性。
具體實施例方式為易于說明，術語"核苷酸"或"核糖核苷酸"在本文中是參考RNA試劑的一個或多個單體亞單元而進行使用的。可以理解，在修飾的RNA或核苷酸替代物的情況下，本文所使用的詞語“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可指在一個或多個位置被修飾的核苷酸或在一個或多個位置的替代物取代部分，如下文的進一步描述。本文所述的"RNA試劑"為未修飾的RNA、修飾的RNA、或核苷替代物，上述物質在本文中進行描述或為RNA合成領域的公知常識。當描述了許多修飾的RNA以及核苷替代物， 優選的實施例包括對核酸酶的抗性強于未經修飾的RNA的物質。優選的實例包括具有下述修飾的物質2’糖修飾；單鏈突出修飾、優選3’單鏈突出修飾，或，尤其是，如果是單鏈化， 包括一個或多個磷酸基團或一個或多個磷酸基團類似的5’修飾。本文所述"iRNA試劑"(其為"干涉RNA試劑"的簡稱)為能夠下調RSV等靶基因的表達的RNA試劑。不希望囿于任何理論，但iRNA試劑可以通過多種機制中的一種或多種而發揮作用，所述機制包括靶mRNA的轉錄后裂解，有時在本領域中將其稱為RNAi ;或包括轉錄前或翻譯前機制。iRNA試劑可以為雙鏈(ds) iRNA試劑。本文所述"ds iRNA試劑"(其為"雙鏈iRNA試劑的簡稱")為具有多于一條鏈、優選雙鏈的iRNA試劑，其中鏈間的雜交可形成雙鏈結構的區域。本處所述“鏈”指的是核苷酸的連續序列(包括非天然或修飾核苷酸)。兩條或多于兩條鏈可以形成單獨分子的一部分，或者每一條鏈形成單獨分子的一部分，或者它們可以通過例如連接子等彼此共價連接從而形成一個分子，所述連接子例如為聚乙二醇連接子。至少一條鏈可以包括與靶RNA 充分互補的區域。將該鏈稱為“反義鏈”。dsRNA試劑中的含有與反義鏈互補的區域的另一條鏈被稱為“正義鏈”。但是，dsiRNA試劑也可由單個的RNA分子來形成，所述單個的RNA 分子至少部分地自身互補以形成包括雙鏈體區域的例如發夾結構或者鍋柄狀結構。在這種情況下，術語“鏈”指的是RNA分子中的一個區域，該區域與同一 RNA分子中的另一區域互補。盡管在哺乳動物中長鏈的ds iRNA試劑可以誘導通常為有害的干擾素反應，但短鏈的ds iRNA試劑卻并不誘發該干擾素反應，至少并不會誘發對細胞和/或宿主有害程度的干擾素反應。本發明的iRNA試劑包括下述的分子，該分子足夠短以至于不會在哺乳動物細胞中誘發有害的干擾素反應。通過向哺乳動物細胞施用iRNA試劑(例如按本文所述進行配制)可以用于沉默RSV基因的表達并同時避免有害的干擾素反應。本文中將足夠短而不會誘發有害的干擾素反應的分子稱為siRNA試劑或siRNA。本文所用"siRNA試劑" 或"siRNA"是指例如ds iRNA試劑等iRNA試劑，其足夠短以至于不會在人類細胞中誘導有害的干擾素反應，例如，其具有少于30個核苷酸對的雙鏈區域。本文所述包括ds iRNA試劑和siRNA試劑的分離的iRNA試劑可通過例如RNA降解來介導基因的沉默。為方便起見，該基因也被稱為靶基因。優選地，被沉默的RNA為RSV 基因的基因產物，特別為P、N或L基因的產物。本文所用短語“介導RNAi ”指的是試劑采用序列特異性方式來沉默靶基因的能力。 “沉默靶基因”指的是下述過程，籍由該過程，當含有和/或分泌某一靶基因產品的細胞與所述試劑相接觸時，與未接觸所述試劑的類似細胞相比，未接觸所述試劑時所含有和/或分泌的該基因的某一產物減少了至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %。 該靶基因的所述產物例如可以為信使RNA(mRNA)、蛋白質、或調節成分。在本發明的抗病毒應用中，靶基因的沉默將導致細胞中或受試體中“病毒效價”的降低。本文所述"病毒效價的降低"指的是由進行病毒靶基因的沉默的細胞所產生的可生存病毒數目的降低，或在進行病毒靶基因沉默的組織中所得到的可生存病毒數目的降低。細胞所產生的病毒數量的降低將優選導致由進行治療的受試體的組織所產生的可測量病毒數的降低，或導致病毒感染癥狀的嚴重程度的降低。本發明的iRNA試劑也被稱為"抗病毒iRNA試劑"。本文所用"RSV基因"指的是從RSV病毒基因組中所鑒別出的任意一個基因(See Falsey,A. R. , and E. E. Walsh,2000,Clinical Microbiological Reviews 13:371-84)。這些基因對本領域技術人員來說是易于得知的，其中包括本文所示例的N、P和L基因。本文所述術語"互補的"用于表示在本發明化合物和諸如RSV病毒mRNA分子的靶RNA分子之間所發生的可產生穩定特異結合程度的互補的充分程度。特異結合需要足夠程度的互補性以避免寡聚化合物與非靶序列在特異結合所需條件下(即，在體內檢測或治療處理時的生理條件下，或在進行體外檢測時，在進行所述檢測的條件下)所發生的非特異結合。所述非靶序列通常具有至少4個核苷酸的區別。如本文所述，若iRNA試劑在細胞中降低由細胞中靶RNA所編碼的蛋白的生成， 則iRNA試劑與諸如靶mRNA(例如靶RSV mRNA)等靶RNA"充分互補"。iRNA試劑也可以與靶RNA “完全互補”，例如，靶RNA與iRNA試劑退火，優選在完全互補的區域形成完全由 Watson-Crick堿基對所形成的雜交體。“充分互補”的iRNA試劑可包括與靶病毒RNA完全互補的內部區域(例如，至少10個核苷酸的內部區域)。而且，在一些實施方式中，iRNA試劑特異性區分單個核苷酸的區別。在這種情況下，如果在單個核苷酸有區別的區域(例如在7個核苷酸的區域內)發現有完全互補性，則iRNA試劑僅介導RNAi。優選的iRNA試劑將基于實施例中所提供的正義和反義序列，或由實施例中所提供的正義和反義序列構成， 或含有實施例中所提供的正義和反義序列。在本文中，當以“基本上相同”來表示第一核苷酸序列與第二核苷酸序列的比較時，意指除了二者之間僅有至多一個、兩個或三個核苷酸發生了取代而不相同(例如，腺苷被脲嘧啶所取代)以外，第一核苷酸序列與第二核苷酸序列是相同的。在本文中，“受試體”指的是下述的哺乳動物生物體，所述哺乳動物生物體正經受對例如RSV感染等由病毒表達所介導的疾病進行治療的過程，或者正經受用于預防病毒感染的預防處理過程。所述受試體可以為任意的哺乳動物，例如為靈長類、牛、馬、小鼠、大鼠、 狗、豬、山羊等。在優選的實施方式中，所述受試體為人。在本文中，治療RSV感染指的是對任何生物學或病理學終點(endpoint)的改善， 所述終點I)由受試體中所存在的病毒所部分介導；以及2)其結果可通過降低所存在的病毒基因產物的水平而受到影響。iRNA試劑的設計和選擇本發明以對下述內容的證實為基礎即，在體內通過鼻內施用/吸入或以注射進行全身/腸胃外施用的方式向肺和鼻通道局部施用iRNA試劑使呼吸病毒基因所發生的靶基因沉默以及對病毒感染的治療結果。本發明進一步擴展至將iRNA試劑用于一種以上的呼吸病毒以及共施用兩種或多種iRNA試劑對兩種病毒感染進行治療。基于這些結果，本發明特別提供了可用于治療病毒感染的iRNA試劑，所述病毒感染特別為呼吸病毒感染，尤其為RSV感染，所述iRNA試劑為單獨形式，并作為下述的藥物組合物。該試劑可包含具有至少15個或更多個連續核苷酸的與病毒基因互補的正義鏈以及具有至少15個或更多個連續核苷酸的與正義鏈序列互補的反義鏈。特別可應用由選自表I (a-c)所提供的P、N和L基因的核苷酸序列所組成的iRNA試劑、或基本上由選自表I (a_c) 所提供的P、N和L基因的核苷酸序列所組成的iRNA試劑、或包含選自表I (a-c)所提供的由P、N和L基因的核苷酸序列的iRNA試劑。本發明的iRNA試劑基于選自表I (a-c)的有活性的iRNA試劑中的一種中的至少 15個或更多個連續核苷酸，或含有選自表I (a-c)的有活性的iRNA試劑中的一種中的至少 15個或更多個連續核苷酸。在該類試劑中，所述試劑可由表中所提供的完整序列所構成、基本上由表中所提供的完整序列構成、或含有表中所提供的完整序列，或者所述試劑可含有 15個或更多的由表la-c所提供的連續殘基并含有來自靶基因的連續區域的其它核苷酸。iRNA試劑可以基于序列信息、所需性質以及表I (a-c)中所提供的信息而合理地進行設計。例如，可根據表中所提供的試劑的序列以及靶基因的完整編碼序列來設計iRNA 試劑。相應地，本發明提供含有正義鏈和反義鏈的iRNA試劑，如上述所定義，每一正義鏈和反義鏈含有至少15、16、17、18、19、20、21或23個與來自呼吸病毒(尤其是RSV的P、N 或L蛋白基因)基因的一部分基本上相同的核苷酸的序列。示例的iRNA試劑包括含有來自表I (a-c)所提供的試劑中的一種中的15個或更多個連續核苷酸的iRNA試劑。iRNA試劑的反義鏈在長度上應該等于或至少為15、1617、18、19、25、29、40或50個核苷酸。優選的長度范圍為15-30、17至25、19至23，以及19至21個核苷酸。示例的iRNA 試劑包括來自表I (a-c)中的試劑之一的一個反義鏈的15個或更多個核苷酸的試劑。iRNA試劑的正義鏈在長度上應該等于或至少為15、16 17、18、19、25、29、40或50 個核苷酸。iRNA試劑的正義鏈在長度上應該等于或少于50、40或30個核苷酸。優選的長度范圍為15-30、17-25、19-23以及19-21個核苷酸。示例的iRNA試劑包括來自表I (a_c) 中的試劑之一的一個正義鏈的15個或更多個核苷酸的試劑。iRNA試劑的雙鏈部分的長度應該等于或至少為15、1617、18、19、20、21、22、23、 24、25、29、40或50個核苷酸對。該長度應該等于或少于50、40、或30個核苷酸對。優選的長度范圍應該為15-30、17-25、19-23以及19-21個核苷酸對。表I (a-c)中提供的試劑每條鏈的長度為21個核苷酸。所述iRNA試劑具有19個核苷酸的雙鏈區域，并且在試劑的每個3’末端具有2個核苷酸的突出。這些試劑可采用本文所述方式進行修飾，以獲得含有至少這些序列(15個或更多個連續核苷酸)的部分和/ 或對寡核苷酸堿基和連接所進行的修飾的等價試劑。通常，本發明的iRNA試劑包括與RSV的P、N或L蛋白的基因等病毒基因具有足夠互補性的區域，并且核苷酸具有足夠的長度，由此使得iRNA試劑或其片段能夠介導特定病毒基因的下調。本發明iRNA試劑的反義鏈優選與病毒基因的mRNA序列完全互補，所述病毒基因如本文所述的RSV的P、N或L蛋白的基因。然而，iRNA試劑與靶基因之間不必完全互補，但其對應性必須足以使iRNA試劑和其斷裂產物通過例如RSV mRNA的RNAi裂解來控制序列特異性沉默。因此，本發明的iRNA試劑包括含有正義鏈和反義鏈的試劑，如下述所定義，每一正義鏈和反義鏈含有至少16、17或18個與病毒基因(尤其是RSV的P、N或L蛋白基因) 序列之一基本上相同的核苷酸的序列，例如為表l(a-c)中所提供的試劑，除了每條鏈上分別有不多于1、2或3個核苷酸被其它核苷酸取代(例如腺苷被脲嘧啶所取代)，同時如下所述，其實際上仍具有在培養的人類細胞中抑制RSV表達的能力。因而這些試劑具有至少15 個或更多個與病毒基因(尤其是RSV的P、N或L蛋白基因)序列之一相同的核苷酸，但是其與靶病毒mRNA序列之間或者其正義和反義鏈之間引入了 1、2和3個堿基錯配。與靶病毒mRNA序列(尤其在反義鏈上的)錯配若在末端區域則具有最大容忍性，若存在錯配，則優選在一個末端區域或多個末端區域，例如在5’和/或3’末端的6、5、4或3個核苷酸之內的區域的末端區域存在錯配、最優選在正義鏈5’末端的6、5、4或3個核苷酸之內的區域的末端區域或在反義鏈的3’末端的6、5、4或3個核苷酸之內的區域存在錯配。正義鏈僅需要與反義鏈足夠互補以保持分子的總體雙鏈特征即可。優選對正義鏈和反義鏈進行選擇以使iRNA試劑如表I (a-c)中所示例在分子的一端或兩端包括單鏈或不成對區域。因此，iRNA試劑含有正義鏈和反義鏈，優選正義鏈和反義鏈配合成對并含有突出，例如含有一個和兩個5'或3'突出，但優選具有2 3個核苷酸的3’突出。多數實施方式具有3’突出。優選的siRNA試劑在iRNA試劑的一個或兩個末端具有長度為1-4個核苷酸、優選2-3個核苷酸的單鏈突出，該單鏈突出優選為3’突出。 所述突出可以由一條鏈長于另一條鏈所致，也可以由于相同長度的兩條鏈交錯排列所致。 優選5’端進行了磷酸化。雙鏈區域的優選長度為15-30之間，更優選的長度為18、19、20、21、22和23個核苷酸，例如在上述的siRNA試劑的范圍內。還包括siRNA試劑的兩條鏈例如通過共價連接等進行連接的實施方式。用于提供所需的雙鏈區域以及優選的3’突出的發夾或其它單鏈結構也包含在本發明中。iRNA試劑候選物的評價iRNA試劑的候選物可通過其下調靶基因表達的能力來進行評價。例如，可提供 iRNA試劑候選物使之與已經被、或將要被目的病毒(例如含有靶基因的病毒)感染的細胞 (例如人類細胞)相接觸。或者，可用表達靶病毒基因的構建體來轉染所述細胞，若如此則就不需要病毒感染模型。可對與iRNA試劑相接觸之前和之后的靶基因表達水平進行比較 (例如，對RNA、蛋白質水平或病毒效價進行比較)。如果確認靶基因表達的RNA、蛋白質或病毒的量在與iRNA試劑相接觸后較低，則可確定iRNA試劑下調靶基因表達。細胞中靶病毒RNA或病毒蛋白的水平或者細胞或組織中病毒效價的水平可通過任意希望的方法來確定。例如，靶RNA的水平可通過Northern印跡法、逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、bDNA 分析、或RNAse保護法來確定。蛋白水平例如可通過Western印跡法或免疫熒光法來確定。 病毒效價可通過空斑形成試驗來確定。穩定件評價、修飾、以及iRNA試劑再檢測iRNA試劑候選物可通過穩定性進行評價，例如可通過當將iRNA試劑引入受試體的體內時其對核酸內切酶或核酸外切酶裂解的敏感性進行評價。可采用例如通過在受試體的體內發現的成分進行裂解來鑒別對修飾、尤其是裂解敏感位點的方法。當鑒別出對裂解敏感的位點后，可進一步設計和/或合成其潛在裂解位點對裂解有抗性的iRNA試劑，例如可在裂解位點引入2’ -修飾(例如2’ -O-甲基基團)。可再檢測進一步設計和/或合成的試劑的穩定性，并且可重復該過程直至發現具有所需穩定性的 iRNA試劑。體內檢測
如實施例所述，可在動物模型(例如小鼠、大鼠或靈長類等哺乳動物的模型)體內檢測經鑒別能夠抑制病毒基因表達的iRNA試劑的功能。例如，可將iRNA試劑施用至動物中，評價iRNA試劑的生物分布、穩定性、及其抑制病毒(例如RSV)基因表達的能力或降低病毒效價的能力。可通過例如注射將iRNA試劑直接施用至靶組織中，或采用與施用至人體相同的方式將iRNA試劑施用至動物模型體內。如本文所述，所述試劑可優選通過用于治療病毒感染的方式，即吸入方式進行施用。還可對iRNA試劑的胞內分布進行評價。該評價可包括對iRNA試劑是否被吸收至細胞內進行確定的內容。該評價也可包括對iRNA試劑的穩定性(例如半衰期)進行確定的內容。iRNA試劑的體內評價可通過使用與可示蹤的標記物(例如熒光素等熒光標記物； 35S、32p、33P或3H等放射標記物；金顆粒；或用于免疫組織化學的抗原顆粒)相結合的iRNA 試劑來進行，或可通過其它適宜的檢測方法來進行。可對iRNA試劑下調病毒基因表達的能力進行評價。可通過例如原位雜交、或通過從組織中分離與iRNA試劑相接觸前與接觸后的RNA來對病毒基因在體內表達的水平進行測定。當需要處死所述動物以獲取組織時，與未經處理的對照動物進行比較。可利用任意所希望的方法來檢測靶病毒mRNA，所述方法包括但不限于RT-PCR、Northern印跡法、分支 DNA測定、RNA酶保護測定。另外地、或者附加地，可通過利用以iRNA試劑進行處理的組織提取物進行Western印跡分析或通過ELISA來對病毒基因表達進行監測。可利用pfu檢測來確定病毒效價。iRNA 化學本文對介導RNAi抑制病毒基因(例如RSV P蛋白基因)表達的分離的iRNA試劑 (例如ds RNA試劑)進行描述。 本處所討論的RNA試劑包括未另外進行修飾的RNA和經修飾以改善其效力的RNA， 還包括核苷代用物的聚合體。未進行修飾的RNA指的是核酸的成分即糖、堿基以及磷酸部分與天然存在的、優選與人體中自然存在的成分相同或基本上相同的分子。現有技術中將稀有的或不平常的、但為天然存在的RNA作為經修飾的RNA，該內容例如參見Limbach et al.，(1994)Nucleic Acids Res. 22 :2183_2196。通常被稱作經修飾的RNA的這種稀有的或不平常的RNA(顯然是由于這些通常為轉錄后修飾的產物)是屬于本文術語“未經修飾的 RNA”的范疇之內。本文所述的經修飾的RNA指的是核酸的成分即糖、堿基以及磷酸部分與天然存在的、優選與人體中自然存在的成分不同的分子。盡管它們被稱作經修飾的“RNA”， 但是由于所進行的修飾的不同它們也當然可以包括不是RNA的分子。核苷代用物為核糖磷酸骨架被非核糖磷酸構件物所取代的分子，該構建物可使堿基存在于正確的空間關系中， 由此使得雜交與同核糖磷酸骨架(例如，不帶電荷的核糖磷酸骨架模擬物)的雜交基本上是相似的。本文對上述每一個的示例進行討論。可將本文所述的修飾摻入至本文所述的任意的雙鏈RNA以及RNA樣分子(例如 iRNA試劑)中。可優選對iRNA試劑的反義鏈和正義鏈均進行修飾。由于核酸為亞基或單體的聚合體，因而下面所述的修飾出現在核酸內重復出現的位置，所述修飾例如為對堿基、 或磷酸部位、或磷酸部位的非連接性O的修飾。在一些情況下，所述修飾可在核酸的所有主體位置出現，但在許多(實際上為大部分)情況下卻并非如此。例如，修飾可僅存在于3’或5’末端區域、可以僅存在于例如末端核苷酸的末端區域或僅存在于鏈的最后2、3、4、5或 10個核苷酸的末端區域。修飾可在雙鏈區域發生、在單鏈區域發生、或在兩種區域同時發生。例如，非連接性O位置的硫代磷酸酯修飾可以僅發生于一個末端或兩個末端、可以僅發生于例如末端核苷酸的末端區域或僅發生于鏈的最后2、3、4、5或10個核苷酸的末端區域, 或者可以僅發生于單鏈和雙鏈區域、尤其是其末端。類似地，修飾可發生于正義鏈、反義鏈、 或者在正義鏈和反義鏈上同時發生。在一些情況下，正義鏈和反義鏈具有相同的修飾或具有相同類型的修飾，但在另一些情況下，正義鏈和反義鏈會具有不同的修飾，例如，在一些情況下需要僅對一條鏈進行修飾，例如僅對正義鏈進行修飾。向iRNA試劑中引入修飾的兩個主要目的在于在生物學環境下具有對降解的穩定性以及對諸如藥效學特性等藥理學特性的改善，這些將在下文進一步討論。對iRNA試劑中的糖、堿基或骨架所進行的其它適宜的修飾在2004年I月16日所提交的共有PCT申請 No. PCT/US2004/01193中有所描述。iRNA試劑中可以包括非天然存在的堿基，例如在2004 年4月16日提交的共有PCT申請NO.PCT/US2004/011822所描述的堿基。iRNA試劑中可以包括非天然存在的糖，例如可以包括非碳水化合物環狀載體分子。用于iRNA試劑中的非天然存在的糖的示例特性在2003年4月16日提交的共有PCT申請No. PCT/US2004/U829中有所描述。iRNA試劑可以包含用于增加核酸酶抗性的核苷酸間連接(例如手性核糖磷酸連接)。此外，或者可選擇地，iRNA試劑可以包含核糖模擬物以增加核酸酶抗性。用于增加核酸酶抗性的示例性的核苷酸間連接以及核糖模擬物在2004年3月8日提交的共有PCT申請 No. PCT/US2004/07070 中有所描述。iRNA試劑可以包括連接配體的單體亞基和用于寡核苷酸合成的單體。示例性的單體在2004年8月10日提交的共有美國申請No. 10/916, 185中有所描述。iRNA試劑可以具有ZXY結構，所述結構例如在2004年3月8日提交的共有PCT申請 No. PCT/US2004/07070 有所描述。iRNA試劑可以與兩性結構域進行結合。iRNA試劑中所用的示例性的兩性結構域在2004年3月8日提交的共有PCT申請No. PCT/US2004/07070中有所描述。在另一實施方式中，iRNA試劑可與具有組件聯合體性質的遞送試劑進行組合。所述聯合體可以包括與一個或多個(優選兩個或多個，更優選都為3個)下述(a)、(b)和(C) 相連的載體試劑(a)濃縮試劑(例如，能夠通過例如離子相互作用或靜電相互作用來吸引 (如結合)核酸的試劑；(b)融合試劑(例如，能夠融合和/或被通過細胞膜運輸的試劑；以及(C)靶基團，例如為細胞或組織靶試劑，該靶基團例如為植物凝集素、糖蛋白、脂或蛋白質，例如為與特定的細胞類型結合的抗體。與遞送試劑相復合的iRNA試劑在2004年3月 8日所提交的共有PCT申請No. PCT/US2004/07070中有所描述。iRNA試劑可以具有非規范性的配對，例如在iRNA雙鏈體(duplex)的正義序列和反義序列之間的配對。非規范性iRNA試劑的示例性特征在2004年3月8日提交的共有 PCT 申請 No. PCT/US2004/07070 中有所描述。
_0] 增強的核酸酶抗性諸如靶向作用于RSV的iRNA試劑等iRNA試劑可以具有增強的核酸酶抗性。對于增強的核酸酶抗性和/或對目標的結合親和力，iRNA試劑(例如iRNA試劑的正義和/或反義鏈)例如可以包括2’-修飾的核糖單元和/或硫代磷酸酯鍵。例如，2’-羥基基團(OH)可被多種不同的“氧”或“脫氧”取代基所替換或修飾。“氧”_2’羥基基團修飾的示例包括烷氧基或芳氧基(0R，例如R = H、烷基、環烷基、 芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG) ；O (CH2CH2O)nCH2CH2OR ;鎖核酸(LNA)，該鎖核酸中，2'羥基例如通過亞甲基橋與同一核糖的4'碳相連接；O-胺和氨基烷氧基、O(CH2)n胺， (例如，胺=NH2、烷氨基、二烷基氨基、雜環基氨基、芳氨基、二芳基氨基、雜芳基氨基、或二雜芳基氨基、已二胺、多胺)。值得注意的是，與采用強的硫代磷酸酯進行修飾的寡核苷酸相比，僅含有甲氧乙基基團(MOE)、(OCH2CH2OCH3, PEG衍生物)的寡核苷酸表現出核酸酶穩定性。"脫氧"修飾包括氫(即，脫氧核糖，其與部分dsRNA的突出部分具有特別相關性)；鹵(例如氟)；氨(例如NH2、烷基氨基、二烷基氨基、雜環基、芳氨基、二芳基氨基、雜芳基氨基、二雜芳基氨基、或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-胺(胺=NH2、烷基氨基、二烷基氨基、雜環基氨基、芳氨基、二芳基氨基、雜芳基氨基或二雜芳基氨基)，_NHC(0)R(R =烷基、環燒基、芳基、芳燒基、雜芳基或糖)，氛基、疏基；燒基-硫_燒基；硫代燒氧基；和燒基、 環燒基、芳基、稀基和塊基，其可任意被例如氣基官能團所任意取代。優選的取代基為2'-甲氧基乙基、2' -0CH3>2/ _0_烯丙基、2' -C-烯丙基以及2'-氟。增加抗性的一個方法如2004年5月4日提交的共有美國申請No. 60/559, 917中所描述，鑒別出裂解位點并對該位點進行修飾以抑制裂解。例如，二核苷酸5' -UA-3'， 5 ’ -UG-3 '，5 ' -CA-3 '，5 ' -UU-3 '或5 ' -CC-3 ’可作為裂解位點。因此可通過對5’核苷酸進行修飾來增強核酸酶抗性，從而使例如至少一個5’ -脲苷-腺嘌呤-3’ (5, -UA-3' ) 二核苷酸中的脲苷為2’ -修飾核苷酸；至少一個5'-脲苷-鳥嘌呤-3' (5, -UG-3' ) 二核苷酸中的5'-脲苷為2'-修飾核苷酸；至少一個5'-胞苷-腺嘌呤-3' (5, -CA-3' ) 二核苷酸中的5'-胞苷為2'修飾核苷酸；至少一個 5'-脲苷-脲苷-3' (5, -UU-3' ) 二核苷酸中的5'-脲苷為2'-修飾核苷酸；或至少一個5'-胞苷-胞苷-3' (5, -CC-3' ) 二核苷酸中的5'-胞苷為2'-修飾核苷酸。iRNA試劑可以包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個這樣的二核苷酸。在某些實施方式中，iRNA試劑中的所有嘧啶具有2'-修飾因此iRNA試劑對核酸內切酶具有增強的抗性。為使核酸酶抗性最大化，可將2’-修飾與一個或多個磷酸連接子(例如硫代磷酸酯)修飾共同使用。所謂“嵌合”寡核苷酸是指包含兩個或多個不同的修飾的寡核苷酸。寡核苷酸骨架中若包含呋喃糖則也能降低核酸內切酶性的裂解。iRNA試劑可通過引入3’陽離子基團而被進一步修飾、或通過利用3' -3'連接來在3'-末端對核苷進行轉化而被進一步修飾。在另外的替代方式中，3'-末端可被諸如3, C5-氨基烷基dT等氨基烷基來封閉。其它3'結合可抑制3' -5'核酸外切酶性的裂解。盡管不希望囿于任何理論，但是諸如萘普生或布洛芬等3'結合物可通過空間上阻礙核酸外切酶與寡核苷酸的 3'-末端相結合來抑制核酸外切酶性的裂解。甚至小的烷基鏈、芳基基團、或雜環結合物或修飾的糖(D-核糖，脫氧核糖，葡萄糖等)也能阻礙3' -5'-核酸外切酶。類似地，5'結合物能抑制5' -3'核酸外切酶性的裂解。盡管不希望囿于任何理論，但是諸如萘普生或布洛芬等5'結合物可通過空間上阻礙核酸外切酶與寡核苷酸的 5'-末端相結合來抑制核酸外切酶性的裂解。甚至小的烷基鏈、芳基基團、或雜環結合物或修飾的糖(D-核糖，脫氧核糖，葡萄糖等)也能阻礙3' -5'-核酸外切酶。當雙鏈化的iRNA試劑包含在至少一個末端具有突出的單鏈核苷酸突出時，iRNA 試劑可以對核酸酶具有增強的抗性。在優選的實施方式中，核苷酸突出包括1-4個、優選 2-3個未成對的核苷酸。在一個優選的實施方式中，直接與末端核苷酸對相連接的單鏈突出的未成對核苷酸具有嘌呤堿基，并且末端核苷酸對為G-C對,或最末的4對互補核苷酸對中有至少兩對為G-C對。在進一步的實施方式中，核苷酸突出可以具有I或2個未成對核苷酸，在一個不例性的實施方式中，所述核苷酸突出為5' -GC-31。在優選的實施方式中，核苷酸突出在反義鏈的3'-末端。在一個實施方式中，iRNA試劑在反義鏈的3'-末端包括5' -CGC-3'基序，從而形成2-nt突出5' -GC-3'。由此，iRNA試劑可以包含用以抑制諸如在受試體的體內發現的核酸內切酶或核酸外切酶等核酸酶的降解的修飾物。本文將這些單體稱作NRM或核酸酶抗性促進單體，并將相應的修飾稱為NRM修飾。在許多情況下，這些修飾也可調節iRNA試劑的其它特性，所述特性例如為與轉運蛋白(例如血清白蛋白)等蛋白或與RISC的成員相互作用的能力，或者第一和第二序列形成雙鏈體的能力或與諸如靶分子等另一序列形成雙鏈體的能力。可向iRNA試劑中、或向iRNA試劑的一個序列中引入一個或多個不同的NRM修飾。 NRM修飾可在一個序列中或在一個iRNA試劑中使用I次以上。NRM修飾中包括一些僅可存在于末端的修飾以及另一些可存在于任何位置的修飾。一些可抑制雜交的NRM修飾優選僅用于末端區域，更優選不用于靶向主體序列或基因的序列中(特別是反義鏈中)的裂解位點或裂解區域。它們可用于正義鏈的任意位置，只要ds iRNA試劑的兩條鏈間的雜交可得到足夠維持即可。在一些實施方式中，優選將NRM 置于正義鏈的裂解位點或裂解區域，由此能使脫靶效應最小化。在多數情況下，NRM修飾可進行不同的分配，該分配取決于它們是包含在正義鏈中還是包含在反義鏈中。如果包含在反義鏈中，則不應將干擾或抑制核酸內切酶裂解的修飾插入到經受RISC介導的裂解的區域(例如裂解位點或裂解區域)中(如Elbashir et al.， 2001，Genes and Dev. 15 :188中所述，將其以參考的方式插入本文)。目標的裂解發生在 20或21nt的反義鏈的大致中間位置，或發生在靶mRNA (其與反義鏈互補)的第一核苷酸的上游的約10或11核苷酸處。本文所述裂解位點指的是在裂解位點的任意一邊的核苷酸， 該核苷酸在靶mRNA上、或在與之雜交的iRNA試劑鏈上。裂解區域指的是在裂解位點的任意方向內的I個、2個或3個核苷酸。該修飾可被引入至末端區域中，例如引入至靶向作用于受試體的序列或未靶向作用于受試體的序列的末端位置或引入至末端的2、3、4或5位置內。束縛配體(Tethered LiRands)iRNA試劑的性質(包括其藥理學性質)例如可通過引入諸如束縛配體等配體來進行影響和定制。可將配體等多種構成要素束縛至iRNA試劑中，例如，束縛至配體結合單體亞基的載體中。在下文中描述了配體結合單體亞基的示例，但其僅為優選例，構成要素也可在其它位置連接到iRNA試劑上。
優選的組成成分為配體，其可通過一個插入束縛物而直接或間接地連接(優選共價連接)至載體。在優選的實施方式中，配體通過插入束縛物連接至載體。當將結合配體的單體被引入至生長鏈中時，配體或束縛配體可以存在于結合配體的單體上。在一些實施方式中，當已將“前體”性配體結合單體亞基引入至生長鏈后，可將配體引入至“前體”性配體結合單體亞基中。例如，可將具有例如氨基末端束縛的單體(例如TAP-(CH2)nNH2)插入至生長的正義或反義鏈中。在隨后的操作中，即，在將前體性單體亞基插入至鏈中以后，可隨后使具有親電基團(例如五氟苯酯或醛基)的配體通過將配體的親電基團與前體性配體結合單體亞單元束縛物的末端親核基團相連接的方式連接至前體性配體結合單體。在優選的實施方式中，配體改變其所引入的iRNA試劑的分布、靶向作用或半衰期。在優選的實施方式中，與例如與不存在該配體的種類相比，配體提供針對選定的目標物的增強的親和性，所述選定的目標物例如為分子、細胞或細胞型、細胞腔室或器官腔室等腔室(compartment)、組織、器官或部位。優選的配體可改善所得天然或修飾寡核糖核酸、或含有本文所述單體和/或天然或經修飾的寡核糖核苷酸的任意組合的多聚分子的轉運、雜交和特異性的性質并可改善其核酸酶抗性。配體通常包括例如用于促進吸收的治療調節物；例如用于監測分布的診斷化合物或報道基團；交聯劑；賦予核酸酶抗性的結構部分；以及天然或不常見的核酸堿基。通常的示例包括親脂性分子、脂質、植物性凝集素、類固醇(例如熊果醇、hecigenin、薯蕷皂苷元)、萜烯(例如三萜烯，如菝葜皂苷元、木栓酮、表木栓醇衍生的石膽酸)、維生素、碳水化合物(例如右旋糖苷、普魯蘭多糖、甲殼質、殼聚糖、菊糖、環糊精或透明質酸)、蛋白質、蛋白結合試劑、整合素靶向性分子、聚陽離子、肽、多胺以及肽類似物。所述配體可以為天然存在的、重組的或合成的分子，例如可為合成多聚氨基酸等合成聚合物。多聚氨基酸的示例包括多氨基酸為多聚賴氨酸(PLL)、多聚L-天冬氨酸、多聚 L-谷氨酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、多聚(L-丙內酯-共-乙二醇化)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯酰胺聚合物、或聚膦嗪。多胺的示例包括聚乙烯亞胺、多聚賴氨酸(PLL)、精胺、亞精胺、多胺、假肽多胺、擬肽類多胺、樹枝狀高分子多胺、精氨酸、脒、魚精蛋白；陽離子結構部分，例如陽離子化脂質、陽離子化卟啉、 多胺的季胺鹽；或為α螺旋肽。配體還可包括靶基團，例如促甲狀腺素、促黑細胞激素、表面活性蛋白Α、黏蛋白糖、糖基化多氨基酸、轉鐵蛋白、雙膦酸酯、多聚谷氨酸鹽、多聚精氨酸鹽、或為RGD肽或RGD 肽類似物等細胞或組織靶向性試劑。配體可以為蛋白，例如可以為糖蛋白、低密度脂蛋白(LDL)等脂蛋白、人血清白蛋白(HSA)等白蛋白、例如作為對共配體具有特異性親和力分子等的肽、例如與癌細胞等特異的細胞類型相結合的抗體等抗體、內皮細胞或骨細胞。配體還可包括激素或激素受體。 它們也可包括非肽類，例如輔助因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡萄糖胺、多價甘露糖或多價海藻糖。配體例如可以為脂多糖、Ρ38 MAP激酶的活化齊U、或NF-K B的活化劑。所述配體例如可為藥物等物質，其可通過例如干擾細胞的細胞骨架(例如，通過干擾細胞的微管蛋白、微絲和/或中間纖絲)而增加iRNA試劑被吸收至細胞中的量。所述藥物例如可為紫杉醇(taxon)、長春新堿、長春堿、細胞分裂抑素、諾考達唑、 iaplakinolide、latrunculin A、鬼筆毒環月太、swinholide A、indanocine 或 myoservin。在一方面來說，所述配體為脂質或基于脂質的分子。該脂質或基于脂質的分子優選與例如人血清白蛋白(HSA)等血清蛋白相結合。其它能與HAS結合的分子可被用作配體。 例如，可使用neproxin或阿司匹林。脂質或基于脂質的分子可以(a)增加結合物對降解的抗性；(b)增加對靶細胞或細胞膜的靶向性或增加向靶細胞或細胞膜的運輸；和/或(C) 能用于調節與諸如HAS等血清蛋白的結合。基于脂質的配體可被用于調節(例如控制)結合物與靶組織的結合。例如，與HSA 的結合能力更強的脂質或基于脂質的配體不容易對腎具有靶向性，因此不易從機體中被清除出去。與HSA的結合能力弱一些的脂質或基于脂質的配體可用于靶向作用于腎的結合物。在一個優選的實施方式中，基于脂質的配體與HAS結合。優選地，其以足夠的親和性與HAS結合從而使結合物會更優選分布至非腎組織中。然而，優選所述親和性并未強到 HAS-配體的結合不能被逆轉的程度。在另一方面，所述配體為一結構部分，該部分例如為可通過靶細胞(例如增殖細胞)進行吸收的維生素或營養物。這些對以不需要的例如惡性或非惡性型的細胞增殖為特性的疾病(例如癌癥)的治療是非常有用的。示例的維生素包括維生素A、E和K。其它示例性的維生素包括B族維生素，例如葉酸、B12、核黃素、生物素、吡哆醛或其它被癌癥細胞所吸收的維生素或營養物。在另一方面，所述配體為細胞滲透劑，優選為螺旋狀細胞滲透劑。優選所述試劑為兩性的。示例性的試劑為Tat肽或觸角足肽(antennapedia)。如果所述試劑為肽,則其可被修飾，包括肽基模擬物、反演體(invertomer)、非肽或假肽連接物、以及使用D-氨基酸。 螺旋狀試劑優選為α螺旋試劑，其優選具有親脂相和疏脂相。5'-磷酸酯修飾在優選的實施方式中，iRNA試劑被Y磷酸化或在Y起始端包括磷酰基類似物。 對反義鏈的5'-磷酸酯修飾包括與RISC介導的基因沉默相一致的修飾。適宜的修飾包括5'-單磷酸酯((HO) 2 (0) P-0-5' ) ; 5'-雙磷酸酯((HO) 2 (0) P-O-P (HO) (0) -0-5')； 5'-三磷酸酯((HO) 2 (O)P-O-(HO) (O)P-O-P(HO) (0)-0-5' );5'-鳥苷加帽(7-甲基化或非甲基化)(7m-G-0-5 ' - (HO) (0) P-O- (HO) (0) P-O-P (HO) (0) -0-5 ' ) ; 5 '-腺苷加帽 (Appp)、以及任意的修飾或未修飾的核苷酸加帽結構。其它適宜的Y -磷酸酯修飾對本領域技術人員來說是已知的。可對正義鏈進行修飾以使正義鏈失活從而抑制活性RISC的形成，由此來潛在地降低脫靶效應。這可通過抑制正義鏈的5'-磷酸化(例如，通過以5' -O-甲基核糖核苷酸)來完成(參見Nykanen et al, (2001)ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107, 309-321.)。也可使用抑制憐酸化的其它修飾，例如，僅以H而不是O-Me來取代5' -0H。或者，可向5'-磷酸酯加入一大體積基團從而將其轉化為磷酸二酯連接物。iRNA試劑向組織和細胞的遞送
逝型本文所述iRNA試劑可配制為用于施用至受試體的劑型，優選配制為通過吸入施用/鼻內施用的方式而局部施用至肺和鼻通道(呼吸組織)的劑型或配制為例如注射等腸胃外施用的劑型。為了便于說明，在本部分大都采用未經修飾的iRNA試劑來對劑型、組合物和方法進行討論。然而應當理解，這些劑型、組合物和方法可用于其它iRNA試劑，例如可用于修飾的iRNA試劑，這些應用也在本發明的范圍內。經配制的iRNA試劑組合物可以采用多種狀態。在一些示例中，所述組合物至少部分為結晶狀、全部為結晶狀和/或無水的(例如，少于80、50、30、20或10%的水)。在另一示例中，所述iRNA試劑處于水相中，例如處于包含水的溶液中，這種劑型為通過吸入進行施用的優選劑型。可將水相或結晶狀組合物引入至遞送載體中，所述遞送載體例如為脂質體(尤其對于水相)、或為顆粒(例如，微粒對結晶組合物是適宜的)。通常，iRNA試劑組合物按照與所需的施用方式相一致的方法進行配制。iRNA試劑的制備可與另一試劑組合來進行配制，所述另一試劑例如為另一治療劑，或為穩定iRNA試劑的試劑(例如為與iRNA試劑相結合以生成iRNP的蛋白)。其它試劑還包括諸如EDTA(例如用于除去Mg2+等二價陽離子)等螯合物、鹽、RNA酶抑制劑(例如 RNAsin等廣義特異性的RNA酶抑制劑)等等。在一個實施方式中，iRNA試劑的制備物包括另一種iRNA試劑，例如包括能夠介導針對第二基因的RNAi的第二 iRNA試劑。另一種制備物還包括至少三種、五種、十種、二十種、五十種、一百種或更多種不同的iRNA種類。在一些實施方式種，這些試劑針對同一病毒的不同的祀序列。在另一實施方式種，每一 iRNA試劑針對不同的病毒。如實施例中所證明，通過同時、或以很近的時間間隔共施用兩種iRNA試劑(每種針對所要處理的病毒中的一種)，可抑制一種以上的病毒。處理方法和遞送涂徑可通過多種途徑將包含本發明iRNA試劑(例如靶向作用于RSV的iRNA試劑)的組合物遞送至受試體中。示例性的途徑包括吸入、靜脈、鼻腔或口腔施用。用于施用本發明的iRNA試劑的優選方式是通過直接施用至肺和鼻通道的方式或通過腸胃外施用的全身施用方式。可將iRNA試劑摻入至適于施用的藥物組合物中。例如，組合物可包含一種或多種 iRNA試劑和藥學可接受載體。本文所述“藥學可接受載體”用以任意包括所有可用于藥物施用的溶劑、分散介質、涂覆物、抗菌及抗真菌試劑、等滲劑及吸收延遲試劑等。該類用于藥學活性成分的介質和試劑對本領域技術人員來說是公知的。除了任意常規的介質或試劑可用于活性化合物以外，還考慮其在組合物中的應用。輔助性活性化合物也可摻入至所述組合物中。本發明的藥物組合物可以以多種途徑進行施用，這取決于是要進行局部治療還是全身治療，并取決于所要治療的部位。所述施用可為局部施用(包括鼻內施用或肺內施用)、口服或腸胃外施用。腸胃外施用包括靜脈滴注、皮下注射、腹腔內注射或肌內注射。通常，本發明的iRNA試劑的遞送是使iRNA試劑完成遞送至受試體內的感染部位的過程。完成該遞送的優選方式可通過局部施用至肺或鼻通道，例如通過吸入、噴霧或鼻內施用遞送至呼吸組織，或通過例如腸胃外施用進行全身施用。用于吸入或腸胃外施用的劑型對本領域技術人員來說是已知的。所述劑型可以包含無菌水溶液，該溶液中也可含有緩沖液、稀釋液以及其它適宜的添加劑，其示例例如為溶于水中的5 %的PBS或葡萄糖。為進行靜脈內使用，應對溶質的濃度進行控制以使其保有制劑的等滲性。本文所公開的活性化合物優選通過任意適宜的方式施用至受試體的肺或鼻通道。 可通過施用含有一種或多種活性化合物的可呼吸性顆粒(其被受試體吸入)的氣溶膠混懸劑來完成對活性化合物的施用。活性化合物可被氣溶膠化為多種形式，例如干粉吸入劑、 既定劑量的吸入劑(metered dose inhalant)、或液體/液體混懸液,但不限于此。可呼吸性顆粒可以為液體或固體。如U. S. Pat. No. 4，501，729中所述，所述顆粒可與選定的化合物一起任選包含的諸如阿米洛利、benzamil或phenamil等可有效抑制從通道粘液分泌物中再吸收水的量的其它治療成分。顆粒狀的藥物組合物可任選與載體結合以協助分散或轉運。可以以任意適宜的比例(例如I : I的重量比)將諸如糖等(例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇等)適宜的載體與一種或多種活性化合物相混合。含有用于實施本發明的活性成分的顆粒應包括可呼吸尺寸的顆粒，也即，顆粒的尺寸足夠小從而可通過嘴或鼻以及喉進行吸入并能進入支氣管及肺的肺泡。通常優選顆粒的尺寸為約I至10微米(更特別地，尺寸小于5微米)。氣溶膠中所含有的具有不可呼吸的尺寸的顆粒易于陳跡于喉嚨并被吞咽下去，因此優選使氣溶膠中的不可呼吸性顆粒的數量最小化。對于鼻施用來說，為保證其存在于鼻腔中，優選使顆粒尺寸處于100-500微米的范圍。用于生產氣溶膠的活性化合物的液態藥物組合物可通過將活性化合物與諸如無菌無熱源水等適宜的賦形劑進行組合來制備。用于實施本發明的高滲鹽水溶液優選為無菌無熱源的溶液，含有I 15重量％生理學可接受的鹽，并優選含有3 7重量％生理學可接受的鹽。可通過任意適宜的方式來制備含有活性化合物的液體顆粒的氣溶膠，例如可使用壓力驅動的噴射式噴霧器或超聲波噴霧器。該內容例如可參見U. S. Pat. No. 4，501，729。噴霧器為可商購獲得的裝置，其通過對壓縮氣體(通常為空氣或氧)進行加速的形式或通過超聲攪拌的形式將活性成分的溶液或混懸液轉化為藥學氣溶膠噴霧。用于噴霧器的適宜的劑型配方由液態載體和活性成分所組成，活性成分的含量最高為劑型配方的40% w/w,但優選低于20% w/w。載體通常為水(最優選為無菌無熱源水) 或稀釋的水性醇溶液，優選為等滲載體，但可以通過加入例如氯化鈉使其成為相對體液為高滲的載體。任選的添加劑包括諸如羥苯甲酯防腐劑(所述劑型配方不是無菌制作時使用)、抗氧化劑、矯味劑、揮發油、緩沖劑及表面活性劑。含有活性成分的固體顆粒的氣溶膠可以采用任意的固體顆粒治療劑氣溶膠發生器類似地進行制造。用于向受試體施用固體顆粒治療劑的氣溶膠發生器以適于人施用的速度產生可呼吸性的顆粒并生成含有預定劑量的治療劑的一定體積的氣溶膠。固體顆粒氣溶膠發生器的一個示例性的類型是吹入器。用于通過吹入法進行施用的適宜的劑型配方包括精細粉碎的粉末，其可通過吹入器進行遞送，或可通過鼻吸藥的方式被吸收至鼻腔。在吹入器中，使粉末(例如，有效進行本文所述治療的技術劑量的粉末)包含在通常由明膠或塑料所制成的膠囊或小盒(cartridge)中，所述膠囊或小盒在原位被刺穿或打開,進行吸入以使粉末受空氣吸引而通過裝置，并進行遞送，或者通過手工操縱的泵進行遞送。裝入吸藥器中的粉末可單獨由活性成分組成，或者由含有活性成分、諸如乳糖等適宜的粉末稀釋劑、以及任選的表面活性劑的粉末混合物組成。劑型配方中通常含有O. I至lOOw/w的活性成分。第二種類型的示例性氣溶膠發生器包含既定劑量的吸入器。既定劑量的吸入器為加壓的氣溶膠分配器，通常在液化推進物中含有活性成分的混懸液或溶液劑型。使用這些裝置時，可通過閥門來釋放制劑以使得制劑的遞送為既定體積(通常為10至200ul)從而制備含有所述活性成分的顆粒噴霧。適宜的推進器包括例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物等的一些含氯氟烴化合物。所述制劑還可進一步含有一種或多種共溶劑(例如乙醇)、表面活性劑(例如油酸或脫水山梨醇三油酸酯)、抗氧化劑和適宜的矯味劑。施用可由受試體或諸如護理者等其它人來進行。護理者可為對人提供看護或照顧的任何主體。例如，醫院、收容所、醫生診所、門診病人的門診部；諸如醫生、護士或其它的開業醫生等醫療工作者；或為配偶或父母等監護人。可以定量的劑量來提供藥物治療，或采用遞送計數劑量的分配器來提供藥物治療。術語“治療有效量”指的是組合物所存在的下述量該量用以在待治療的受試體中提供所需水平的藥物的組合物從而獲得預期的生理學反應。在一個實施方式中，將治療有效量的兩種或多種iRNA試劑(每種分別作用于例如RSV等不同的呼吸性病毒)共同施用至受試體。術語“生理有效量”指的是遞送至受試體中從而產生所需的緩解或治療效果的量。術語“藥學可接受載體”指的是所述載體可被吸收至肺中而不會對肺造成顯著的毒副作用。術語“共施用”指的是將兩種或多種試劑、尤其是兩種或多種iRNA試劑施用至受試體中。所述試劑可以包含在單一的藥物組合物中并可以同時進行施用，或者所述試劑可以包含在分離的劑型配方中并可以順序施用至受試體中。只要兩種試劑可同時在受試體體內被檢測到，就可以說這兩種試劑是同時施用的。可用作載體的藥物賦形劑的種類包括諸如人血清白蛋白(HSA)等穩定劑；諸如碳水化合物、氨基酸和多肽等填充劑；PH調整劑或緩沖劑；諸如氯化鈉等鹽類；等等。這些載體可以為結晶型或為無定形，或為這兩種的混合物。特別有價值的填充劑包括相容性的碳水化合物、多肽、氨基酸或上述物質的組合。 適宜的碳水化合物包括半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等單糖；乳糖、海藻糖等二糖；2_羥基丙基-β-環糊精等環糊精；棉子糖、麥芽糊精、右旋糖苷等多糖；甘露醇、木糖醇等醛醇；等等。碳水化合物的優選的組中包括乳糖、海藻糖、棉子糖、麥芽糊精以及甘露醇。適宜的多肽包括天門冬酰苯丙氨酸甲酯。氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸，優選甘氨酸。適宜的pH調節劑和緩沖劑包括例如檸檬酸鈉、抗壞血酸鈉等利用有機酸和堿制備的有機鹽，優選檸檬酸鈉。劑量。iRNA試劑可以小于約75mg/千克體重的單位劑量進行施用，或以小于約70，60，50，40，30，20，10,5,2,1,0. 5,0. 1,0. 05，O. 01，O. 005，O. 001 或 O. 0005mg/ 千克體重的劑量進行施用，以及以小于200nmol的iRNA試劑(例如約4. 4x1016拷貝(copies))/千克體重的劑量進行施用或以小于 1500，750，300，150，75，15，7. 5,1. 5,0. 75,0. 15,0. 075,0. 015， O. 0075，O. 0015，O. 00075，O. 00015nmol的iRNA試劑/千克體重的劑量進行施用。所述單位
劑量例如可通過吸入劑量或噴霧或注射進行施用。在一個實施例中，使用.02-25mg/kg的劑量。將iRNA試劑直接遞送至肺或鼻通道的劑量可以為約Img 約150mg/鼻通道。所述劑量可以為對疾病或紊亂狀態有效進行治療或預防的量。在一個實施方式中，單位劑量每天施用一次。在另外的用法中，單位劑量在第一天施用兩次，然后每天施用一次。或者，單位劑量可以少于每天一次，例如少于每2、4、8或30 天一次。在另外的實施方式中，單位劑量并不按頻率(例如，定期頻率)施用。例如，單位劑量可以單次施用。由于iRNA試劑介導的沉默可以在iRNA試劑組合物施用后持續幾天的時間，因而在許多情況下，可以以少于每天一次的頻率來施用所述組合物，或者，在一些情況下，可在整個治療方案中僅施用一次。在一個實施方式中,對受試體施用一次起始劑量以及一次或多次維持劑量的iRNA 試劑，所述iRNA試劑例如為雙鏈iRNA試劑或siRNA試劑(例如，諸如能夠被加工為siRNA 試劑的較大的iRNA試劑等前體、或為能夠編碼諸如雙鏈iRNA試劑或siRNA試劑iRNA試劑的DNA、或其前體等)。維持劑量(一種或多種)通常低于起始劑量，例如為起始劑量的一半以下。維持方式可以包括以O. 01 μ g 75mg/千克體重/天的劑量范圍內的一種或多種劑量對受試體進行處理，該劑量例如可以為70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0. 5,0. 1,0. 05、 O. 01,0. 005,0. 001或O. 0005mg/千克體重/天。維持劑量優選以不高于每5 14天一次的頻率進行施用。進一步，該治療方案可以持續一段時間，該時間取決于特定的疾病、疾病的嚴重性以及患者的整體情況。在優選的實施方式中，所述劑量可以以不高于每天一次(例如不高于每24、36、48或更多小時一次，如不高于每5或8天一次)的頻率進行遞送。在治療后，可對其情況的變化進行監測并對疾病癥狀的緩解進行監測。當患者對當前劑量水平沒有明顯反應時，可增加所述化合物的劑量；或者當已經觀察到疾病癥狀的緩解、或疾病狀態已經消失、或觀察到不希望出現的副作用時，應當減少所述劑量。在以一個實施方式中，iRNA試劑的藥物組合物包含多種iRNA試劑。所述多種iRNA 試劑可以具有與天然存在的靶序列(例如RSV基因的靶序列)不重疊、不毗鄰的序列。在另一個實施方式中，多種iRNA試劑對不同天然存在的靶基因具有特異性。例如，對RSV的 P蛋白基因具有靶向性的iRNA試劑可與對另一不同基因(例如N蛋白基因)具有靶向性的iRNA試劑存在于同一藥物組合物中。在另一個實施方式中，iRNA試劑對多種病毒(例如RSV)具有特異性。iRNA試劑組合物的濃度為對治療或預防人類的病癥或調節生理狀況足夠有效的量。所施用的iRNA試劑的濃度或量取決于試劑所確定的參數以及施用方法(例如鼻施用、 口腔施用或肺施用)。例如，鼻施用趨向于需要使一些成分的濃度較低從而避免使鼻通道受到刺激或燒傷。有時需要對口服劑型稀釋10 100倍以提供適宜的鼻用劑型。某些因素可能影響對受試體進行有效治療的劑量，所述因素包括但不限于疾病或病癥的嚴重程度、先前的治療、一般健康狀況和/和受試體的年齡、以及所具有的其它疾病等。若用于治療的諸如siRNA試劑等iRNA試劑的有效劑量可以隨著特殊治療的進程而有所增加或減少，則也是優選的。劑量的變化可能是由于診斷化驗的結果所致，并且由診斷化驗的結果是明顯可判斷的。例如，在施用iRNA試劑組合物后，可對受試體進行監測。根據監測得到的信息。可施用付加量的iRNA試劑組合物。下文將利用實施例對本發明進行說明，但所述實施例不應理解為對本發明的進一步限制。實施例針對RSV mRNA的抗病毒siRNA的設計利用已知程序化學合成針對P、N和L mRNA的siRNA。表I (a_c)中列出了 siRNA 序列、一些抑制交叉亞型活性、以及IC50值。體外檢測和病毒感染在含有10%熱失活FBS的DMEM中培養Vero E6細胞直至其達到80%匯合。為引入siRNA,向50 μ I的無血清DMEM中加入4 μ I Transit-TKO,并在室溫溫育10分鐘。然后， 將指定濃度的siRNA分別加入至培養基/TKO反應試劑中并在室溫溫育10分鐘。將RNA混合物加入至200 μ I的含有10% FBS的DMEM中，然后至細胞單層。將細胞于37°C、5% CO2 的條件下培養6小時。用I XHank' s平衡鹽溶液(HBSS)溫和洗滌除去RNA混合物，然后向每孔加入300空斑形成單元(pfu)的RSV/A2(M0I = 30)并在37°C、5% CO2的條件下吸收一小時。除去病毒并用IXHBSS洗滌細胞。將細胞以I %的甲基纖維素(該纖維素溶于含有10% FBS的DMEM培養基中)覆蓋，然后在37°C、5% CO2的條件下培養6天。利用抗-F 蛋白單克隆抗體131-2A對細胞的進行免疫染色。體內的siRNA遞送及病毒感染自Harlan購買無病原菌的4周齡雌性BALB/c小鼠。在麻醉狀態下對小鼠進行感染和鼻內灌輸(i. η.)。通過以指定量的siRNA (其混和有或未混和有5ul的Transit ΤΚ0) 對小鼠進行鼻內灌輸來免疫小鼠。在進行RSV處理(IO6pFU的RSV/A2)4小時前對小鼠腹腔內(i.P.)施用150yg的Synagis (單克隆抗體克隆143-6C，抗-RSV F蛋白)和小鼠同型對照(IgGl)。每組采用10只小鼠。在感染后0，2，4和6天監測動物體重。感染后6天收取肺器官，通過免疫染色空斑試驗來檢測RSV。免疫染色空斑試驗將24孔板的Vero E6細胞在含有10%熱失活的FBS的DMEM培養至90%匯合。將小鼠肺用手持勻漿機在Iml的無菌Dulbeccc/ s PBS (D-PBS)中勻漿并以無血清DMEM稀釋10倍。將含有肺裂解物稀釋液的病毒以三管平行置于24孔板上，于37°C、5% CO2的條件下吸收一小時。將各孔以1%的甲基纖維素(溶于含有10% FBS的DMEM培養基中)覆蓋。然后，將板在37°C、5% CO2的條件下培養6天。6天后，除去覆蓋的培養基，然后以丙酮甲醇(60 40)固定細胞15分鐘。將細胞以5%干奶粉/PBS于37°C封閉I小時。將 I 500稀釋的抗-RSV F蛋白抗體(131-2A)加入至各孔中，并于37°C溫育2小時。將細胞以PBS/0. 5%TWeen20洗滌2次。向各孔中加入I : 500稀釋的羊抗鼠IgG-堿性磷酸酶并于37°C溫育I小時。將細胞以PBS/0. 5% Tween20洗滌2次。利用Vector' s堿性磷酸酶底物試劑盒II (Vector Black)來對反應進行顯影,并以蘇木素(Hematoxylin)進行復染。由此使空斑可視，并以Olympus反轉顯微鏡進行計數。
治療試驗在第O天通過鼻內灌輸對小鼠進行RSV處理(IO6pFU的RSV/A2)，并在指定的時間 (病毒處理后I 4天)以50ug指定的siRNA通過鼻內灌輸對小鼠進行治療。每組使用 3 5只小鼠，并在病毒處理5天后如前所述測定肺裂解物中的病毒效價。iRNA試劑對RSV的體外抑制采用上述的空斑形成試驗來檢測表I (a-c)所提供的iRNA試劑的抗-RSV活性(圖 I)。每一條柱(豎條)表不表I (a-c)中所提供的一種iRNA試劑,例如,柱I為表Ia中的第一試劑，柱2為表Ia中的第二試劑，等等。通過病毒殘留百分數(％)來鑒別出活性iRNA 試劑。經鑒別，幾種試劑顯示出多達90%抑制活性。將所述結果于表I (a-c)中進行概括。確定iRNA試劑在體外對RSV抑制的劑量依賴性反應。利用上述的空斑形成試驗以4個濃度來檢測表I中的示例性活性試劑的抗-RSV活性。發現所檢測的活性iRNA試劑具有劑量依賴性反應(圖2)，將其結果概括于表I (a-c)中。如上所述檢測iRNA試劑對RSV B亞型的體外抑制作用。檢測圖2中所提供的iRNA 試劑針對亞型B的抗-RSV活性(圖3)。iRNA試劑對RSV亞型B具有不同水平的抑制作用， 將其結果概括于表I (a-c)中。iRNA試劑對RSV的體內抑制作用如上所述利用AL1729和AL1730來檢測對RSV的體內抑制作用。檢測圖4所述試劑在小鼠模型中的抗-RSV活性。所述iRNA試劑在體內可有效降低病毒效價，并且與對照抗體(Mab 143-6c，推薦用于RSV治療的小鼠IgGl Ab)相比其更為有效。利用上述方法來檢測AL1730的劑量依賴性活性。所述試劑表現出劑量依賴性反應(圖5)。如上所述，檢測在體外具有活性的iRNA試劑在體內的抗-RSV活性。當進行預防性施用時，幾種試劑顯示出對病毒效價具有> 4 logs的降低(圖6)。利用上述治療方案來檢測具有體內和/或體外活性的iRNA試劑在體內的抗-RSV 活性。當在病毒感染后施用I 2天時，幾種試劑顯示出對病毒效價具有2 31ogs的降低(圖7)。分離株靶序列間的序列分析方法分離株的生長以及RNA分離RSV感染病人的臨床分離株獲自Larry Anderson (CDC，Atlanta Georgia) (4 株)以及 John DeVincenzo (University of Term., Memphis) (15株)。當這些株在HEp_2人上皮細胞(ATCC，Cat#CCL_23)中生長時，發現來自 Georgia的4種分離株的生長要慢于來自Tennessee的15株的生長,對這些分別進行處理和分析。下文簡要描述其方法使猴腎臟上皮細胞(ATCC，Cat#CRL_1586)Vero E6生長至95%匯合并以1/10稀釋的原代分離株進行感染。將病毒于37°C吸收I小時，然后將D-MEM加入至細胞中并于37°C 對細胞進行培養。以每天一次的頻率通過光學顯微鏡對細胞的細胞病變(CPE)進行監測。 在90%細胞病變時，將細胞刮下并通過在3000rpm離心10分鐘進行沉淀。按照制造商的操作手冊通過標準方法來制備RNA提取物。RSV N基因的擴增收集感染后的病毒RNA并將其用作PCR反應的模板，使用與ALDP-2017靶點的上游和下游雜交的引物來擴增約450bp的片段。在正向和反向RSV N基因引物的存在下將全部RNA于65°C處理5分鐘進行變性，將其保存于冰上，然后用 Superscript III (Invitrogen)進行逆轉錄,該逆轉錄于55°C進行60分鐘,然后于70°C進行15分鐘。利用I %瓊脂糖凝膠的凝膠電泳來分離PCR產物并以常規方法進行精制。結果最初15種分離株的序列分析結果表明ALDP-2017的靶點在每一株中都是完全保守的。更為重要的是，這種保守性在不同種群(包括來自RSV A和B的分離株)間得到了保持。令人注意的是，當對4種生長較慢的分離株進行分析時，我們觀察到這4種中的一種(LAP6824)在ALDP-2017識別位點具有單個堿基的突變。該突變改變了該分離株編碼序列的13位，使其由A變為G。結論由19位患者的分離株的結果可知，ALDP-2017的RSV N基因靶序列已經被確定。 在19例中的18例(95% )中，ALDP-2017的識別成分具有100%保守性。在一個分離株中，有一個堿基發生了改變，將RSV N基因內13位的A變為G。該改變在ALDP-2017的反義鏈和靶序列之間制造出了單個的G :U擺動。基于對該G :U擺動的雜交潛力的認識，可預測 ALDP-2017在該分離株的RSV N基因的沉默中是有效的。分離株的沉默數據方法在含有10%熱失活FBS的DMEM中培養Vero E6細胞直至其達到80%匯合。為引入siRNA,向50 μ I的無血清DMEM中加入4 μ I Transit-TKO,并在室溫溫育10分鐘。然后， 將指定濃度的siRNA分別加入至培養基/TKO反應試劑中并在室溫溫育10分鐘。將RNA混合物加入至200 μ I的含有10% FBS的DMEM中，然后加入至細胞單層。將細胞于37°C、5% CO2的條件下培養6小時。以IXHank' sBalanced Salt Solution(HBSS)溫和洗漆除去 RNA混合物，然后向每孔加入300空斑形成單元(pfu)的RSV/A2(M0I = 30)并在37°C、5% CO2的條件下吸收一小時。除去病毒并以IXHBSS洗滌細胞。將細胞以1%的甲基纖維素 (該甲基纖維素溶于含有10% FBS的DMEM培養基中)覆蓋，然后在37°C、5% CO2的條件下培養6天。利用抗-F蛋白單克隆抗體131-2A對細胞進行免疫染色。結果在所有的分離株中觀察到沉默(表2)。表權利要求
1.一種降低受試體細胞中的病毒蛋白、病毒mRNA或病毒效價水平的方法，所述方法包括向所述受試體施用iRNA試劑的步驟，其中所述iRNA試劑包含具有至少15個或更多個連續核苷酸且與來自第一哺乳動物呼吸道病毒的基因互補的正義鏈以及具有至少15個或更多個連續核苷酸且與所述正義鏈序列互補的反義鏈，其中所述基因選自由RSV的P、N或L 基因組成的組。
2.如權利要求I所述的方法，其中所述試劑含有選自表I(a-c)的試劑的一種中的15 個或更多個核苷酸。
3.如權利要求I所述的方法，其中將所述iRNA試劑通過鼻內施用方式施用于受試體。
4.如權利要求I所述的方法，其中將所述iRNA試劑通過吸入或噴霧施用方式施用于受試體。
5.如權利要求I所述的方法，其中所述iRNA試劑降低了所述受試體中的病毒效價。
6.如權利要求I所述的方法，其進一步包括向所述受試體共施用第二iRNA試劑，其中所述第二 iRNA試劑包含具有至少15個或更多個連續核苷酸且與來自所述呼吸道病毒的第二基因互補的正義鏈以及具有至少15個或更多個連續核苷酸且與所述正義鏈序列互補的反義鏈。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述試劑含有選自表I(a-c)的試劑的一種中的15 個或更多個核苷酸。
8.如權利要求6所述的方法，其中所述受試體經診斷受到所述第一和第二哺乳動物呼吸道病毒的病毒感染。
9.一種降低受試體細胞中來自呼吸道病毒的第一和第二基因的病毒蛋白水平的方法， 所述方法包括向所述受試體共施用第一和第二 iRNA試劑的步驟，其中所述第一 iRNA試劑包含具有至少15個或更多個連續核苷酸且與來自哺乳動物呼吸道病毒的第一基因互補的正義鏈以及具有至少15個或更多個連續核苷酸且與所述正義鏈序列互補的反義鏈；所述第二 iRNA試劑包含具有至少15個或更多個連續核苷酸且與來自哺乳動物呼吸道病毒的第二基因互補的正義鏈以及具有至少15個或更多個連續核苷酸且與所述正義鏈序列互補的反義鏈。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述試劑含有選自表I(a-c)的試劑的一種中的15 個或更多個核苷酸。
全文摘要
本發明涉及一種降低受試體細胞中的病毒蛋白、病毒mRNA或病毒效價水平的方法，所述方法包括向所述受試體施用iRNA試劑的步驟，其中所述iRNA試劑包含具有至少15個或更多個連續核苷酸且與來自第一哺乳動物呼吸道病毒的基因互補的正義鏈以及具有至少15個或更多個連續核苷酸且與所述正義鏈序列互補的反義鏈，其中所述基因選自由RSV的P、N或L基因組成的組。本發明已證實，通過體內試驗已證實鼻內施用以及腸胃外施用iRNA試劑可抑制RSV。
文檔編號C12N15/113GK102600480SQ20121006879
公開日2012年7月25日 申請日期2006年1月6日 優先權日2005年1月7日
發明者雷切爾·邁耶斯 申請人:阿爾尼拉姆醫藥品有限公司