專利名稱：禽腦脊髓炎病毒lamp檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
禽腦脊髓炎(avian encephalomyelitis,AE)又稱流行性震顫,是由禽腦脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus, AEV)引起的青年雞、雉雞、鶴鵓和火雞的一種急性、 高度接觸性傳染病。該病通過消化道感染家禽，侵害雞的中樞神經系統和其它實質性器官， 病毒經蛋垂直傳播，導致孵化率下降，感染雛雞在1-7日齡出現震顫、運動失調等癥狀，隨著雞日齡的增長，這些臨床神經癥狀慢慢不表現。另外，病毒感染產蛋雞，可導致產蛋雞產蛋量輕微下降，對養禽業尤其是種禽飼養業危害極大。目前，實驗室檢測腦脊髓炎病毒的方法有病毒分離、PCR方法和熒光PCR檢測方法等，但是病毒分離鑒定存在耗時長、敏感性較低、不易標準化等缺點，在實際應用中具有一定的局限性。目前已建立的禽腦脊髓炎病毒PCR方法和熒光PCR檢測方法，雖然檢測的敏感性也比較高，但是常規PCR需要使用PCR儀和進行凝膠電泳等，而熒光PCR檢測方法需要昂貴的熒光PCR儀和昂貴的試劑，不利于在臨床中推廣。LAMP具有特異性強、敏感性高、快速且成本低、操作方法更簡單，適于現場快速檢測

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測禽腦脊髓炎病毒的環介導等溫擴增引物組。本發明提供的引物組，包括引物I、引物2、引物3和引物4 ；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。上述引物組中，還包括引物5和引物6，所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列5和序列6 ；上述引物組由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6組成；所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比具體為 7. 5-8. 5 7. 5-8. 5 15-17 15-17 7. 5-8. 5 7. 5-8. 5 ;所述引物 I、 所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比進一步具體為 8 : 8 : 16 : 16 : 8 : 8。本發明的第二個目的是提供一種檢測禽腦脊髓炎病毒的環介導等溫擴增試劑。本發明提供的環介導等溫擴增試劑，由上述的引物組、環介導等溫擴增緩沖液、反轉錄酶(AMV)、抑制劑(inhibitor)、DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)、dNTPs、硫酸鎂、甜菜堿、 鈣黃綠素、氯化錳和水組成。上述環介導等溫擴增試劑中，所述引物組中的引物I在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度為 7. 5u mol/ μ L_8. 5u mol/ μ L ；所述引物組中的引物2在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度為7.5u mo μ L~8. 5u mol/μ L ；所述引物組中的引物3在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度為15u mo μ L-17u mol/μ L ；所述引物組中的引物4在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度為15u mo μ L-17u mol/μ L ；所述引物組中的引物5在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度為7.5u mo μ L~8. 5u mol/μ L ；所述引物組中的引物6在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度為7.5u mo] μ L~8. 5u mol/μ L ；所述引物組中的引物I在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度進一步具體為 8umol/μ L ；所述引物組中的引物2在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度進一步具體為 8umol/μ L ；所述引物組中的引物3在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度進一步具體為 16umol/μ L ；所述引物組中的引物4在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度進一步具體為 16umol/μ L ；所述引物組中的引物5在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度進一步具體為 8umol/μ L ；所述引物組中的引物6在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度進一步具體為 8umol/μ L0本發明的第三個目的是提供一種檢測禽腦脊髓炎病毒的環介導等溫擴增試劑盒。本發明提供的試劑盒，包括上述的引物組或上述環介導等溫擴增試劑。上述的引物組或上述環介導等溫擴增試劑或上述試劑盒在制備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有禽腦脊髓炎病毒產品中的應用也是本發明保護的范圍。上述應用中，所述檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有禽腦脊髓炎病毒為用上述的引物組或上述環介導等溫擴增試劑或上述試劑盒對所述待測樣品進行環介導等溫擴增反應；上述應用中，所述反應的模板為待測樣品的RNA。本發明的實驗證明，與現有技術相比，其優點和積極效果表現在本發明建立了禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測試劑盒及其檢測方法，本試劑盒根據禽腦脊髓炎病毒的VP2基因保守區設計了兩個特異性內引物、兩個特異性外引物和兩個特異性環引物，該保守基因序列為禽腦脊髓炎病毒所共有。常規的LAMP方法,需要在反應結束后開蓋加入SYBR Green I或 Gene Finder染料來顯色，反應產物易形成氣溶膠而污染周圍環境，容易污染環境而造成假陽性，同時SYBR Green I或Gene Finder染料還會因為引物二聚體而引起假陽性。因此本發明使用鈣黃綠素+氯化錳替代了 SYBR Green I和Gene Finder這些染料，在配置LAMP反應液時就可以加入反應液中，無需LAMP反應后開蓋，并且鈣黃綠素+氯化錳僅在發生LAMP反應時才出現翠綠色,避免了 SYBR Green I和Gene Finder染料造成的假陽性問題,具有更好的特異性。總之，本發明采用LAMP技術，特異性強，且比PCR檢測方法有更高的靈敏度，但不需要昂貴的PCR儀，只需要普通的水浴鍋即可，且結果不必用凝膠電泳來觀察，簡單而快速，特別適用于基層現場檢測禽腦脊髓炎病毒。


圖I為LAMP方法檢測禽腦脊髓炎病毒的特異性2為LAMP方法檢測禽腦脊髓炎病毒的敏感性試驗3為PCR方法檢測禽腦脊髓炎病毒敏感性試驗4為禽腦脊髓炎病毒LAMP反應對臨床樣品檢測
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、引物的設計及其試劑盒的制備根據禽腦脊髓炎(avian encephalomyelitis, AE)的VP2基因保守區域(序列號 BU327593)，設計如下引物內引物I 為CAATCGATTCAATGTCAACCTGATC-AACATCTTTTCAAGCTGGAG(序列 I)；內引物2 為CCGCTATGACCACATATTGCC-TGTATATGTAAGGAACTTTCATCC(序列 2)；外引物I 為GGACTAGACGTTATTGTTCAGAT(序列 3)；外引物2 為GGTTGTAGCAACCCCTAC(序列 4)；環引物I 為GCACAAGGGCTGCTATGAGAC(序列 5)；環引物2 為ACGGTAAGCTGAATTGCAACA(序列 6)。2、LAMP鑒別試劑及試劑盒24ul反應液體系如下2. 5ul IOX等溫反應緩沖液(中國大連寶生物工程公司 Takara產品，產品目錄號DR100A)、lul 5U/ul AMV(中國大連寶生物工程公司Takara產品，產品目錄號D2620，反應體系中的終濃度為O. 2U/ul)、lul 40U/ul inhibitor(抑制劑，中國大連寶生物工程公司Takara產品，產品目錄號D2313A，反應體系中的終濃度為
1.6U/ul)、lul 8U/ul Bst DNA 聚合酶(反應體系中的終濃度為 O. 35U/ul)、3. 5ul IOmM dNTPs (中國大連寶生物工程公司Takara產品，產品目錄號D4030RA，反應體系中的終濃度為I. 4mM)、5ul 25mM硫酸鎂(反應體系中的終濃度為5mM)、lul 200uM/uL的外引物I (反應體系中的終濃度8uM/uL)、lul 200uM/uL的外引物2 (反應體系中的終濃度8uM/uL)、2ul 200uM/uL的內引物I (反應體系中的終濃度16uM/uL)、2ul 200uM/uL的內引物2(反應體系中的終濃度16uM/uL)、lul 200uM/uL的環引物I (反應體系中的終濃度8uM/uL)、Iul 200uM/uL的環引物2 (反應體系中的終濃度8uM/uL)，O. 5ul 5M甜菜堿、Iul 625 μ M鈣黃綠素、Iul 12. 5mM氯化猛和3ul雙蒸水。鑒別檢測試劑盒包括上述反應液，也可以包括是各獨立包裝的引物。實施例2、禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測方法的特異性和敏感性試驗
I、禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測方法的特異性試驗禽腦脊髓炎病毒Van株(AE Van株)、禽腦脊髓炎病19株(AE 19株)、禽腦脊髓炎病毒Wl株(AE Wl株)、禽腦脊髓炎病毒W2株(AE W2株)、禽腦脊髓炎病毒1163株(AEl 163 株)(上述 5 株病毒均詳見 Zhiqin Xie (謝志勤)等，Reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect avian Encephalomyelitis virus, Avian Disease (美國禽病雜志)，2005，49 :227-230,公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得。)、雞馬立克氏病毒(MDV)株(購自南京梅里亞動物保健品公司)、雞傳染性支氣管炎病毒株(Mass 41)、 雞傳染性喉氣管炎病毒株(北京株)、禽呼腸孤病毒株(S1133)、禽巴氏桿菌(C48-1)、雞毒霉形體(MG)、雞新城疫病毒(Lasota)(記載上述6株病毒的文獻詳見Zhiqin Xie (謝志勤)等，Reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect avian Encephalomyelitis virus, Avian Disease (美國禽病雜志)，2005,49 :227-230 ;謝志勤等，應用二溫式多重PCR技術鑒別雞傳染性支氣管炎病毒和雞傳染性喉氣管炎病毒，廣西科學，2001，8(2) :152-153，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得。)。分別提取禽腦脊髓炎病毒Van株(AE Van株)、禽腦脊髓炎病19株(AE 19株)、 禽腦脊髓炎病毒Wl株(AE Wl株)、禽腦脊髓炎病毒W2株(AE W2株)、禽腦脊髓炎病毒 1163株(AE 1163株)、雞馬立克氏病毒(MDV)株、雞傳染性支氣管炎病毒株(Mass41)、雞傳染性喉氣管炎病毒株(北京株)、禽呼腸孤病毒株(S1133)、禽巴氏桿菌(C48-1)、雞毒霉形體(MG)、雞新城疫病毒(Lasota)的RNA為模板，在上述24ul由實施例I得到的反應體系中分別加入上述Iul模板。LAMP反應程序如下62°C 90min，然后80°C 5min。以正常雞腦組織(表型正常，且經過PCR驗證為陰性，用的引物為Pl CTTATGCTGGCCCTGATCGT, P2 TCCCAAATCCACAAACCTAGCC,詳見 Zhiqin Xie (謝志勤)等，Reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect avian Encephalomyelitis virus, Avian Disease (美國禽病雜志)，2005，49 :227-230)提取的RNA為陰性對照。LAMP反應結果可以通過以下兩個方法判斷在可見光下直接用肉眼觀察顏色變化，陽性結果顯示翠綠色，陰性結果顯示淡桔紅色；在紫外線下觀察陽性結果顯示明亮的綠色熒光，陰性結果顯示無顏色。可見光下觀察結果如圖I所示，I為AE Van株；2為AE 19株；3為AE Wl株；4為 AE W2株；5為AE 1163株；6為雞馬立克氏病(MDV)株；7為雞傳染性支氣管炎病毒(Mass 41) ;8為雞傳染性喉氣管炎病毒(北京株)；9為禽呼腸孤病毒(S1133) ;10為禽巴氏桿菌 (C48-1) ;11為雞毒霉形體(MG) ;12為雞新城疫病毒(Lasota) ;13為陰性對照，可以看出， AE Van株、AE 19株、AE Wl株、AE W2株、AE 1163株檢測為陽性結果(可見光下顯示翠綠色)，而對雞馬立克氏病(MDV)株、雞傳染性支氣管炎病毒(Mass 41)、雞傳染性喉氣管炎病毒(北京株)、禽呼腸孤病毒(S1133)、禽巴氏桿菌(C48-1)、雞毒霉形體(MG)、雞新城疫病毒(Lasota)的檢測均為陰性(可見光下顯示淡桔紅色)。在紫外光下判斷，結果與上述可見光判斷結果一致。說明引物及檢測方法用于檢測禽腦脊髓炎病毒的特異性高。因此，上述引物及判斷標準可用來判斷未知樣本是否含有禽腦脊髓炎病毒。2、禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測方法的敏感性試驗將禽腦脊髓炎病毒AE Van株的RNA按10倍遞增稀釋成10ng/ul、lng/ul、100p g/ul、10pg/ul、lpg/ul、100fg/ul、10fg/ul、lfg/ul,然后按照上述I的體系和反應程序進行實驗，肉眼觀察結果如圖 2 所示，I lng/ul ；2 100pg/ul ；3 10pg/ul ；4 lpg/ul ；5 100fg/ ul ；6 10fg/ul ；7 :lfg/ul，可以看出，1-5為翠綠色，6-7為桔紅色，禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測方法的檢測限為lOOfg/ul。用常規的RT-PCR進行對照實驗，具體如下在50ul 的反應體系中含 25mM MgCl2 2. 5ul, 10XPCR buffer 5ul, IOmM dNTPs 2ul，Taq 聚合酶(5U)0. 5ul，AMV(5U) I μ L，RI (40U) I μ L，上游弓丨物 5-CTTATGCTGGCCCTGATCGT-3 和下游引物 5-TCCCAAATCCACAAACCTAGCC-3 各 lul，禽腦脊髓炎病毒AE Van株的RNA按10倍遞增作為模板lul，35ul雙蒸水。擴增程序為42V 45分鐘， 94°C變性2分鐘，然后進入94°C變性I分鐘，62°C退火I分鐘，共進行35個循環，最后再經 62°C延伸10分鐘。結果如圖3 所示，I 100ng/ul ；2 10ng/ul ；3 lng/ul ；4 100pg/ul ；5 10pg/ul ； 6 lpg/ul ；7 100fg/ul, 1-5得到619bp的PCR產物(經過測序，為禽腦脊髓炎病毒Van株 VP2基因genbank號為AY517471的第570-1187位核苷酸)，檢測限為10pg/ul。可以看出，禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測方法的檢測限為IOOfg/ul，而常規RT-PCR的檢測限為10pg/ul，RT-LAMP方法敏感性比常規RT-PCR高100倍。實施例3、禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測方法對臨床樣品的檢測I、臨床組織樣品中RNA的提取A.分別取臨床編號為17、23、45、116的雞(7日齡的麻雞，出現頭部震顫，四肢運動失調等癥狀)腦組織5g，用碾磨磨碎后加入，反復凍融3次，10000轉離心5分鐘，收集 IOOul上清液，加入900ul Trizol液后，劇烈混勻，室溫(25°C )放置IOmin ；B.加入200ul氯仿，劇烈混勻，室溫放置5min ；C. 12000 Xg 離心 15min ；D.收集500ul上清，加入500ul異丙醇，混勻，室溫放置IOmin ；E. 12000X g 離心 15min,去上清,加入 IOOOul 75% 乙醇，12000X g 離心 15min,去
上清；F.在超凈臺內用自然干燥IOmin后加入20ul DEPC H2O溶解，即為待檢RAN，_20°C 保持備用，得到編號為17、23、45、116的待檢RNA。2、禽腦脊髓炎病毒LAMP反應對臨床樣品檢測分別以上述I編號為17、23、45、116的待檢RNA為模板，按照實施例2的I中的 LAMP反應體系和LAMP反應程序進行反應。以AE Van株的RNA為陽性對照，以正常雞腦組織的RNA為陰性對照。結果如圖4所示，I AE Van株陽性對照；2 :編號為17雞腦樣品；3 :編號為23雞腦樣品；4 :編號為45雞腦樣品45 ；5 :編號為116雞腦樣品；6 :陰性對照，通過肉眼直接觀察結果，1-3為翠綠色,4-6為淡桔紅色,因此說明雞腦樣品17和23含有禽腦脊髓炎病毒。采用實施例2的2中的常規的RT-PCR進行驗證，模板分別為編號為17雞腦樣品的RNA、編號為23雞腦樣品的RNA、編號為45雞腦樣品的RNA、編號為116雞腦樣品的RNA， 結果為編號為17雞腦樣品和編號為23雞腦樣品的RNA、均得到619bp的PCR產物(經過測序，為禽腦脊髓炎病毒Van株VP2基因genbank號為AY517471的第570-1187，而編號為45雞腦樣品的RNA、編號為116雞腦樣品的RNA沒有該大小的目的片段。因此，說明本方法正確。
權利要求
1.檢測禽腦脊髓炎病毒的環介導等溫擴增引物組，包括引物I、引物2、引物3和引物4 ；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.根據權利要求I所述的引物組，其特征在于所述引物組還包括引物5和引物6，所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列5和序列6 ；所述弓I物組由所述弓I物I、所述弓I物2、所述弓I物3、所述弓I物4、所述弓I物5和所述弓I物 6組成。
3.根據權利要求I或2所述的引物組，其特征在于所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比為7 5-8.5 7. 5-8. 5 15-17 15-17 7. 5-8. 5 7. 5-8. 5 ;所述引物 I、所述引物2、所述引物 3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比進一步具體為8 : 8 : 16 : 16 : 8 : 8。
4.檢測禽腦脊髓炎病毒的環介導等溫擴增試劑，由權利要求1-3中任一所述的引物組、環介導等溫擴增緩沖液、反轉錄酶、抑制劑、DNA聚合酶、dNTPs、硫酸鎂、甜菜堿、鈣黃綠素、氯化錳和水組成。
5.根據權利要求4所述的環介導等溫擴增試劑，其特征在于所述弓丨物組中的弓丨物I在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度為7. 5u π /μ L-8. 5u ncl/yL； 所述弓丨物組中的弓丨物2在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度為7. 5u π /μ L-8. 5u ncl/yL； 所述引物組中的弓丨物3在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度為15u nDl/yL-17u hdI/uL；所述引物組中的弓丨物4在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度為15u nDl/yL-17u hdI/uL； 所述弓丨物組中的弓丨物5在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度為7. 5u π /μ L-8. 5u ncl/yL； 所述弓丨物組中的弓丨物6在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度為7. 5u π /μ L-8. 5u ncl/yL； 所述引物組中的引物I在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度進一步具體為8umol/y L ； 所述引物組中的引物2在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度進一步具體為Sumol/μ L ； 所述引物組中的引物3在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度進一步具體為16umol/y L ； 所述引物組中的引物4在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度進一步具體為16umol/y L ； 所述引物組中的引物5在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度進一步具體為Sumol/μ L ； 所述引物組中的引物6在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度進一步具體為Sumol/
6.檢測禽腦脊髓炎病毒的環介導等溫擴增試劑盒，包括權利要求1-3中任一所述的引物組或權利要求4或5所述環介導等溫擴增試劑。
7.權利要求1-3中任一所述的引物組或權利要求4或5所述環介導等溫擴增試劑或權利要求6所述試劑盒在制備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有禽腦脊髓炎病毒產品中的應用。
8.根據權利要求7所述應用，其特征在于所述檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有禽腦脊髓炎病毒為用權利要求1-3中任一所述的引物組或權利要求4或5所述環介導等溫擴增試劑或權利要求6所述試劑盒對所述待測樣品進行環介導等溫擴增反應；所述反應的模板具體為待測樣品的RNA。
全文摘要
本發明公開了一種禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。本發明提供的引物組，包括引物1、引物2、引物3和引物4；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。所述引物組還包括引物5和引物6，所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列5和序列6；本發明的實驗證明，本發明采用LAMP技術，特異性強，且比PCR檢測方法有更高的靈敏度，但不需要昂貴的PCR儀，只需要普通的水浴鍋即可，且結果不必用凝膠電泳來觀察，簡單而快速，特別適用于基層現場檢測禽腦脊髓炎病毒。
文檔編號C12R1/93GK102586486SQ20121006850
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月15日 優先權日2012年3月15日
發明者劉加波, 龐耀珊, 范晴, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勛, 鄧顯文 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所