專利名稱：A型豬流感病毒nasba-elisa檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于動物衛生檢驗技術領域，涉及一種核苷酸及其應用，更具體的說是一種A型豬流感病毒NASBA-ELISA檢測試劑盒。
背景技術：
豬流感(SwineInfluenza , SI)是由豬流感病毒(Swine Influenza Virus , SIV) 引起的一種急性、高度接觸傳染性的群發性呼吸道疾病，臨床上以突發、高熱、咳嗽、呼吸困難為特征。該病傳播速度快，在各年齡和各品系的豬中，發病率高達100%，對于免疫系統不完善的仔豬致死率較高。此外豬流感還可引起母豬繁殖障礙、育肥豬增重減慢等，對養豬業所造成的危害和經濟損失巨大。豬流感自1918年美國首次報道以來，已造成世界范圍內的多次大流行，迄今已遍及歐、美、亞、非、澳洲等世界各地。豬流感病毒具有同時感染人和禽的能力，而且豬是對禽流感病毒和哺乳動物流感病毒均敏感的唯一動物，在流感病毒“禽-豬-人”的種間傳播鏈中，充當了病毒重組及復制的“混合器”。2009年3月在墨西哥、美國等地暴發的A型流感病毒便是一種新型的變異病毒株，這種新型流感病毒包含人流感病毒、禽流感病毒和豬流感病毒的基因片段，同時擁有亞洲豬流感和非洲豬流感病毒特征。豬流感不僅給畜禽養殖造成重大經濟損失，而且還對人類健康造成威脅，因此快速、敏感、準確診斷豬流感，具有重要的經濟價值和公共衛生意義。核酸序列依賴性擴增(nucleicacid sequence-based amplification,NASBA)是由一對引物介導的、連續均一的、體外特異核苷酸序列等溫擴增的酶促反應過程。NASBA的簡要過程如下=(I)RNA模板鏈進入反應混合物后，第一個引物首先與模板鏈的3’端結束。 (2 )反轉錄酶(AMV)，合成反義的補償的DNA鏈。(3 ) RNaseH,分解破壞RNA模板鏈。(4 )第二個引物與DNA的5’端結合。(5) T7 RNA polymerase合成RNA補償鏈，并加入到步驟I 中，使反應可以循環進行。NASBA-ELISA方法是將NASBA技術和ELISA (酶聯免疫吸附劑測定)方法相結合， 其原理是將地高辛標記到檢測探針上，通過探針捕獲探針將地高辛標記的探針和NASBA產物的復合物吸附到微量反應板上，作用于底物硝基苯基磷酸鹽顯色，然后通過分析吸光度來檢測RNA產物。由于捕獲探針和檢測探針的應用，使檢測結果更為特異，而酶標儀的高通量性能使一次能夠檢測多個樣品。豬流感病毒是負鏈RNA病毒，病毒基因組由8個分節段的RNA組成，其中核蛋白 (NP)基因相對保守，且該基因具有種群和型的特異性，因此核蛋白經常作為流感病毒型的分類和診斷的候選基因。本發明以豬流感病毒NP基因作為目的基因，建立NASBA快速檢測方法，用于豬流感病毒的診斷，提高我國豬流感診斷、疫情監測和檢驗檢疫技術水平，保障養豬業的健康、快速發展。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種用于檢測A型豬流感病毒的特異性探針。本發明的另一個目的是提供一種檢測A型豬流感病毒NASBA-ELISA的試劑盒。 本發明的另一個目的是提供一種檢測A型豬流感病毒NASBA-ELISA試劑盒的制備
方法。 為實現上述目的，本發明提供如下的技術方案
一對針對A型豬流感病毒NP基因的特異性捕獲探針和檢測探針，其特征在于，所述的捕獲探針序列如SEQ NO: I所示；具有如SEQ NO: 2所示的檢測探針序列。本發明進一步公開了針對A型豬流感病毒的NASBA-ELISA試劑盒，它是由下述成分組成
I)引物和探針引物 NP-DET 2μ1 引物 ΝΡ-Τ7 2μ1 捕獲探針NP-CP μ1 檢測探針NP-DP μ1
所述捕獲探針NP-CP，具有如SEQ NO: I所示的引物序列；所述檢測探針NP-DP具有如 SEQ NO:2所示的引物序列。2) NASBA 擴增試劑
BA (緩沖液)40mM/L PH8. 5 Tris-HCL, 70mM /L KCl, 12mM/L MgCl2,5mM/L DTT
4μ1
DA 10mM/L dNTP2μ1
NA 20mM/L NTP2μ1
MA (酶混合液):1 2UAMV,0. 2 O. 5URNaseH, 30 50U T7 RNA 聚合酶，2 6Pllmg/m IBSA4μ1
SA DMS0 μ
3) NASBA產物檢測試劑 96孔酶標板鏈酶親和素包被的酶標板
雜交緩沖液20XSSPE ( pH7. 4),50mM/L Tris-HCl ( ρΗ8· 8)，I % BSA 43μ1 酶標抗體:堿性磷酸酶抗地高辛抗體ΙΟΟμΙ
顯色液3mg pNPP溶于ImLddH2O中，避光_20°C保存。ΙΟΟμΙ
終止液:0. 5Μ Na2CO3 溶液。ΙΟΟμΙ
洗液PBST 溶液(含 0. 05%Tween-20，ρΗ7· 2，PBS )450μ1。本發明進一步公開了針對豬流感病毒NASBA-ELISA檢測試劑盒的使用方法，其特征是包括下述步驟
1)擴增反應體系3μ1待檢樣品 RNA、4P1 BA、2μ1 Α、2μ1 ΝΑ、 μ1 SA、2Pl 引物 ΝΡ-Τ7、2μ1 引物 NP-DET ；
2)NASBA擴增過程65°C加熱5min，41°C冷卻5min，迅速加入4μ1MA，41°C反應90min ； 4°C終止反應；
3)NASBA產物檢測過程①在酶標孔中加入雜交緩沖液43μ1、捕獲探針 μ 、檢測探針 μ 和NASBA產物5μ1，震蕩混勻，放入41 °C溫箱中反應l 2h ；
②用每孔加入150μ1洗液，室溫放置3 5min，棄去溶液，反復洗板3次；
③每孔加入酶標抗體ΙΟΟμΙ，室溫孵育30min，洗板3次；
④顯色每孔加入ΙΟΟμΙ顯色液,室溫避光顯色IOmin；
⑤終止反應每孔加入100終止液，在酶標議上測定405nm的OD值。本發明更加詳細的制備方法如下
I試劑組成
I. I引物
針對A型豬流感病毒的NP基因設計合成引物和探針，由寶生物工程(大連)有限公司合成，序列如下
NP-DET :5’ -GATGCTAGGTCGCATATGAGTC-3’2μ1
ΝΡ-Τ7 :5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGGATGCCTTCTGTT-3’2μ1
捕獲探針 NP-CP:BIO- TAA GGA CCA GAA GG G μ
檢測探針 NP-DP:DIG- GATGCTAGGTCGCATATGAG μ
I.2 NASBA擴增試劑
BA (緩沖液):40mM/L PH8. 5 Tris-HCL, 70mM /L KCl, 12mM/L MgCl2,5mM/L DTT 購自 Promega 公司4μ1
DA 10mM/L dNTP，購自上海生物工程有限公司2μ1
NA :20mM/L ΝΤΡ，購自上海生物工程有限公司2μ1
MA (酶混 合液)1 2 U A M V , O . 2 O. 5URNaseH, 30 50U T 7 RNA 聚合 酶，2 6Pllmg/mlBSA 4μ1
SA DMS0,購自天津博美科生物工程有限公司 μ
1.3 NASBA產物檢測試劑
96孔酶標板鏈酶親和素包被的酶標板，購自上海生物工程有限公司雜交緩沖液20XSSPE ( ρΗ7· 4)，50mM Tris-HCl ( ρΗ8· 8)，I % BSA ；
購自上海生物工程有限公司43μ1
酶標抗體堿性磷酸酶抗地高辛抗體，購自天津博美科生物工程有限公司 ΙΟΟμΙ 顯色液3mg pNPP溶于ImLddH2O中，避光_20°C保存，購自天津博美科生物工程有限公司ΙΟΟμΙ
終止液0. 5M/L Na2CO3溶液，購自天津博美科生物工程有限公司ΙΟΟμΙ
洗液=PBST溶液(含0. 05%Tween-20,pH7. 2，PBS)450μ1，購自天津博美科生物工程有限公司。2 NASBA檢測過程
2.I擴增體系
取 3μ1 模板 Ι ΝΑ、4μ1 BA、2μ1 Α、2μ1 ΝΑ、 μ1 SA、2Pl 引物 ΝΡ_Τ7、2μ1 引物 NP-DET 加入擴增管。2. 2 NASBA 擴增程序在DNA擴增儀上65°C加熱5min，41°C冷卻5min，迅速加入4μ1 MA，41°C反應90min ；4°C
終止反應。2.3 NASBA擴增產物的檢測
2.3. I在酶標孔中加入雜交緩沖液43μ1、捕獲探針 μ 、檢測探針 μ 和NASBA產物 5μ1，震蕩混勻，放入41°C溫箱中反應I 2h。2. 3. 2用每孔加入150μ1洗液，室溫放置3 5min，棄去溶液，反復洗板3次。2. 3. 3結合酶標抗體每孔加入酶標抗體ΙΟΟμΙ，室溫孵育30min，洗板3次。2. 3. 4顯色每孔加入ΙΟΟμΙ顯色液，室溫避光顯色lOmin。2. 3. 5終止反應每孔加入ΙΟΟμΙ終止液，在酶標議上測定405nm的OD值。通過檢測已知的16個豬流感陰性樣品的OD值，根據公式陰陽性標準臨界值= 陰性樣品的平均OD值+3SD(標準差)
表I 16個陰性樣品的OD值
16 yI、樣品的OD值0.171 I 0.219O. 256 0.175O. 301 0.187O. 203 0.213O. 228 O. 2300.138 0.1890.176 & 0.192·...,
根據結果計算平均值為0. 20557，標準差為0. 040540,根據公式計算陰陽臨界值為 0. 20557+3X0. 040540=0. 326。根據統計學原則，樣本的OD4tl5值> 陰性樣本OD4tl5均值(X) +3XSD時，可以在99. 9%的水平上判定為陽性。因此，當樣品OD4tl5值大于0. 326時，結果判定為豬流感陽性；當樣品OD4tl5值小于
0.326時，判定為豬流感陰性；當樣品OD4tl5nm值等于0. 326時，判定為可疑，需重新檢測。由上述的技術方案可見，本發明建立的檢測A型豬流感病毒NASBA-ELISA的試劑盒所具有的優點如下
(I)操作簡便本試劑盒已將NASBA擴增和NASBA產物檢測試劑進行了優化處理，普通實驗人員即可掌握操作方法，易于推廣。(2)檢測靈敏度高該試劑盒的靈敏度比RT-PCR高10倍。(3)高通量由于使用了ELISA方法檢測NASBA擴增產物，因此可以同時檢測90份樣品。(4)準確性高試劑盒NASBA擴增反應中使用了兩條特異性引物，在NASBA產物檢測時使用了一條捕獲探針和一條檢測探針，這些環節均確保了檢測結果的準確性。
具體實施例方式
為了更充分地解釋本發明的實施方法，提供了用于檢測豬流感病毒NASBA-ELISA試劑盒的實施實例。這些實施實例僅僅是解釋、而不是限制本發明的范圍。其中RNA提取試劑Trizol購自invitrogen公司；T7 RNA聚合酶、核糖核酸酶H、AMV逆轉錄酶、BSA購自 Promega公司；dNTP、NTP購自上海生物工程有限公司；鏈霉親和素、pNPP購自天津博美科生物工程有限公司；堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體購自Roche公司。實施例I 試劑組成
權利要求
1.一對針對A型豬流感病毒NP基因的特異性捕獲探針和檢測探針，其特征在于，所述的捕獲探針序列如SEQ NO: I所示；具有如SEQ NO: 2所示的檢測探針序列。
2.一種針對A型豬流感病毒NP基因的NASBA-ELISA試劑盒，它是由下述成分組成1)引物和探針引物 NP-DET 2μ1 引物 ΝΡ-Τ7: 2μ1捕獲探針NP-CP μ1 檢測探針NP-DP μ1所述捕獲探針NP-CP，具有如SEQ NO: I所示的引物序列；所述檢測探針NP-DP具有如 SEQ NO:2所示的引物序列；2)NASBA擴增試劑BA (緩沖液)40mM/L PH8. 5 Tris-HCL, 70mM /L KCl, 12mM/L MgCl2,5mM/L DTT4μ1DA 10mM/L dNTP2μ1NA 20mM/L NTP2μ1MA (酶混合液)1 2UAMV，0.2 0.5U RNaseH，30 50U T7 RNA 聚合酶，2 6μ1 lmg/ml B SA4μ1SA DMS0 μ 3)NASBA產物檢測試劑96孔酶標板鏈酶親和素包被的酶標板雜交緩沖液20XSSPE ( pH7. 4),50mM/L Tris-HCl ( ρΗ8· 8)，I % BSA 43μ1 酶標抗體堿性磷酸酶抗地高辛抗體ΙΟΟμΙ顯色液3mg pNPP溶于ImLddH2O中，避光_20°C保存ΙΟΟμΙ終止液0. 5M Na2CO3 溶液ΙΟΟμΙ洗液PBST 溶液(含 O. 05%Tween-20，ρΗ7· 2，PBS )450μ1。
3.權利要求2所述針對豬流感病毒NASBA-ELISA檢測試劑盒的使用方法，其特征是包括下述步驟1)擴增反應體系3μ1待檢樣品 RNA、4P1 BA、2μ1 Α、2μ1 ΝΑ、 μ1 SA、2Pl 引物 ΝΡ-Τ7、2μ1 引物 NP-DET ；2)NASBA擴增過程65°C加熱5min，41°C冷卻5min，迅速加入4μ1MA，41°C反應90min ； 4°C終止反應；3)NASBA產物檢測過程①在酶標孔中加入雜交緩沖液43μ1、捕獲探針 μ 、檢測探針 μ 和NASBA產物5μ1，震蕩混勻，放入41 °C溫箱中反應l 2h ；②用每孔加入150μ1洗液，室溫放置3 5min，棄去溶液，反復洗板3次；③每孔加入酶標抗體ΙΟΟμΙ，室溫孵育30min，洗板3次；④顯色每孔加入ΙΟΟμΙ顯色液,室溫避光顯色IOmin；⑤終止反應每孔加入ΙΟΟμΙ終止液，在酶標議上測定405nm的OD值。
4.權利要求2所述試劑盒在制備A型豬流感病毒臨床樣品檢測方面的應用。
全文摘要
本發明涉及一種針對A型豬流感病毒NP基因的試劑盒，其組成包括一對擴增引物、捕獲探針、檢測探針、NASBA擴增試劑、NASBA產物檢測試劑。本發明以A型豬流感病毒NP基因作為目的基因，建立NASBA快速檢測方法，用于A型豬流感病毒的診斷，提高我國豬流感診斷、疫情監測和檢驗檢疫技術水平，保障養豬業的健康、快速發展。
文檔編號C12N15/11GK102586488SQ201210069268
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月16日 優先權日2012年3月16日
發明者孫英峰, 張健, 張國偉, 張莉, 李秀麗, 池晶晶, 王東, 王榮升, 路超, 鄢明華, 韓偉 申請人:天津市畜牧獸醫研究所