專利名稱：結核分枝桿菌Rv3117重組蛋白的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，特別是一種結核分枝桿菌Rv3117重組蛋白的制備方法及其應用。
背景技術：
快速、準確的診斷結核分枝桿菌(MTB)感染，對于結核病的控制具有重要意義。 MTB感染的診斷方法有很多，臨床最為常用的方法仍然依靠傳統的痰涂片細菌學檢查，但檢出率低；MTB培養可做為結核病確診的“金標準”，但其培養時間太長，一般4-6周，難以滿足臨床需要；分枝桿菌全自動培養系統(Bactec MGIT 960)雖縮短了培養時間，但費用較高， 短時間內難以推廣普及；X線和CT檢查僅提供影像學可能性診斷；聚合酶鏈反應(PCR)技術及其它基因診斷方法作為臨床診斷尚存在操作復雜，對技術和人員專業素質要求較高， 且仍不能用于菌陰結核病的快速診斷。目前，結核病診斷廣泛應用皮試檢測試劑一結核分枝桿菌純蛋白衍生物(pro)，然而pro存在與環境分枝桿菌以及BCG疫苗株的交叉反應， 所以診斷價值偏低，故改進和創新勢在必行。

發明內容
針對上述情況，為克服現有技術缺陷，本發明之目的就是提供一種結核分枝桿菌 Rv3117重組蛋白的制備方法及其應用，可有效解決結核病的診斷檢出率低，費用高，操作復雜及診斷試劑效果差的問題。本發明解決的技術方案，該結核分枝桿菌Rv3117重組蛋白的制備方法，由以下步驟實現(I)、根據Rv3117基因序列(Rv3117基因序列NCBI登陸號為BX842582. I ;蛋白號為CAB08374. 1，)來設計靶基因引物；(2)、以結核分枝桿菌菌株基因組DNA為模板，PCR擴增，得PCR產物，PCR產物經純化后得Rv3117基因純化序列，雙酶切，得酶切產物；(3)將酶切產物插入至表達質粒(表達質粒又稱載體)中和酶切Rv3117基因純化序列所用的限制內切酶相對應的酶切位點處，采用常規方法克隆構建重組質粒，測序表明重組質粒的基因序列與GenBank(基因組庫)中H37Rv結核全基因組中對應基因序列 (Rv3117基因NCBI登陸號為BX842582. I ;蛋白號為CAB08374. I)完全一致；(4)將構建的重組質粒轉化入和表達質粒相匹配的宿主細胞中進行蛋白表達，得表達蛋白Rv3117 ；(5)誘導表達蛋白Rv3117，得誘導表達產物；(6)分離純化誘導表達產物，得到Rv3117重組蛋白(SEQ ID NO :1)，Rv3117重組蛋白的基因序列與美國國家生物技術信息中心(NCBI)上的CAE55554. I蛋白序列相比，加入了表達質粒相關序列和純化標簽，如，使用pET32a表達質粒時,重組蛋白后面加了 pET32a 上的相關序列和一段His Tag純化標簽；
本發明的Rv3117重組蛋白可以單獨作為檢測結核病的診斷試劑；本發明提供了一種含有Rv3117重組蛋白的檢測結核病的試劑盒，該試劑盒是基于抗原抗體反應原理制備的試劑盒，如抗原抗體反應結果呈陽性，則認為該檢測者患有結核病，抗原抗體反應包括且不僅限于凝集反應，或沉淀反應，或免疫突光技術，或E花環反應，或ELISA反應等；本發明還提供了一種通過包含有Rv3117重組蛋白以檢測特異性抗體的結核病診斷試劑盒；本發明上述含有Rv3117重組蛋白或含有Rv3117重組蛋白的特異性抗體的檢測結核病的試劑盒中，還包括(I)包被稀釋液ρΗ9· 6濃度O. 05Μ的碳酸鹽緩沖液(常用市售分子生物學試劑)；(2) PBST洗滌緩沖液(常用市售分子生物學試劑);(3)樣本稀釋液含1% BSA的PBST (常用市售分子生物學試劑)；(4)經標記的二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG或辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgM ；(5)陽性對照品和陰性對照品；(6)底物溶液底物緩沖液A :乙酸鈉2. 4g，檸檬酸O. 28g依次加入，溶于88ml超純水(皿1111 01^，”，以下同)，在磁力攪拌器中攪拌溶解，加入53111 30%H202 (過氧化氫溶液)，磁力攪拌器攪拌溶解；底物緩沖液B :80ml超純水中加入O. 03g TMB(3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺)和O. 32g EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉，常用市售分子生物學試劑)，然后再加入8ml甘油，攪拌，溶解；(7)終止液2M硫酸；(8) 96 孔酶標板(Costar, US)；所述的表達質粒為pET21a、pET32a、pET28b、pET30a或pET32a等中的一種；所述的宿主細胞為原核細胞或真核細胞等，如大腸桿菌(E. coli)的BL21(DE3)菌株或BL21(DE3) PhysS菌株；所述的結核分枝桿菌菌株基因組DNA為結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA ;所述的Rv3117基因序列包括對BX842582. I中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列，由于密碼子的簡并性，所以與BX842582. I核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼相同的氨基酸序列；所述的誘導表達蛋白Rv3117可使用異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導劑對表達蛋白Rv3117進行誘導；所述的分離純化誘導表達產物的方法為親和層析或離子交換層析等方法。本發明的Rv3117重組蛋白在制備過程中，可選用本領域已知的相關載體，然后編碼本發明所述的Rv3117核苷酸序列可操作性地連接于表達調控序列，從而形成重組質粒， 本發明Rv3117重組蛋白在檢測肺結核方面敏感性高，是一個活性強的B細胞目標抗原，用于結核病檢測試劑盒的制備，敏感性高而且安全可靠。


圖I為本發明的Rv3117重組蛋白的表達純化圖。圖2為本發明的Rv3117重組蛋白經進一步純化及濃縮后的SDS-PAGE圖。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明的具體實施方式
作詳細說明。I)、重組質粒 pET32a_Rv3117 的構建(I)靶基因引物設計Rv3117-F (上游引物)5，-CATACCATGGCACGCTGCGAT-3 ’ ；Rv3117-R (下游引物)5，-CTTCTCGAGTCAGCTTCCCAA-3 ’ ；酶切位點分別為Nco I、Xho I ;(2)靶基因的PCR擴增、克隆及序列測定以結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，Rv3117_F為上游引物和Rv3117_R為下游引物，應用Taq酶，通過PCR擴增，得PCR產物，PCR擴增的反應條件94°C預變性5min ； (94°C變性30s ;58°C退火30s ;72°C延伸40s) 35個循環；72°C延伸5min ;4°C保存，然后用I %瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，再用DNA回收試劑盒(InvitiOgen，US)回收，得 Rv3117基因純化序列，將Rv3117基因純化序列用限制內切酶Nco I和限制內切酶Xho I 酶切，插入到pET32a表達質粒的Nco I酶切位點和Xho I酶切位點中，克隆構建重組質粒 pET32a-Rv3117，測序表明重組質粒pET32a_Rv3117的基因序列和GeneBank中H37Rv結核全基因組相應基因序列完全一致；2)重組質粒pET32a_Rv3117的誘導表達及純化取IOOul BL21 (DE3)physS 感受態細胞(Tiangen, China)裝入 eppdorf 管，放入冰上，3-5分鐘管內液體融化后，將O. 5ul測序正確的重組質粒pET32a-Rv3117轉化入感受態細胞中進行蛋白表達，冰上放置45min，42°C水浴鍋中，熱擊90s，冰上靜置3min，得表達蛋白Rv3117，在表達蛋白Rv3117中加入500ul的不含抗生素的LB培養基，37°C搖床，220rmp， 培養45-60min，然后取IOOul在含卡那霉素的固體LB培養基平皿上涂布，18_25°C干燥后， 倒置于37°C溫箱中培養10-12小時，挑取克隆，放入含50ug/ml卡那霉素的抗性的LB液體培養基中，220rmp，37°C培養OD值至O. 4-0. 7，加入終濃度為IOmM的IPTG誘導劑，37°C誘導3h，收集誘導后的菌體，按IOml洗滌緩沖液I (KCl 300mM ；KH2P04 50mM ;咪唑5mM，以下同)每克菌體的比例重懸后超聲破碎，得混合液，取混合液IOOOOg離心30min，收集含目的蛋白(目的蛋白即指Rv3117重組蛋白)的上清液，用IMAC親和色譜柱(Bio-Rad)進行親和純化，即先用2CV去離子水沖洗2ml/min，3min, 5CV的洗滌緩沖液I平衡親和柱，再取 6CV包含目的蛋白的上清液上樣，依次用6CV洗滌緩沖液I沖洗，2ml/min，3min，6CV洗滌緩沖液 II (KCl 300mM ；KH2P04 50mM ;咪唑10mM)沖洗，2ml/min，3min，IOCV 的洗滌緩沖液 III (KCl 300mM ；KH2P04 50mM ;咪唑250mM)洗脫 2ml/min，5min，收集洗脫液，得純化的目的蛋白(如圖I所示，I是蛋白分子量標準，2是未誘導的BL21-pET32a :Rv3117菌株，3是誘導后的BL21-PET32a Rv3117菌株，4是破碎上清，5是破碎沉淀，6是親和純化前上樣樣品， 7是洗滌緩沖液I洗滌樣品，8是洗滌緩沖液2洗滌樣品，9是洗脫液洗脫樣品)，再用pH 8. O 的20mM Tris-HCl緩沖液透析，得目的蛋白液，用IOkDa超濾管對透析后的目的蛋白液進行濃縮，得濃縮的目的蛋白，用BCA法測定濃縮的目的蛋白的濃度，結果顯示，SDS-PAGE電泳分析目的蛋白純度為95% (如圖2所示，I是蛋白分子量標準，2是純化濃縮后的目的蛋白 (5 μ g)，3是純化濃縮后的目的蛋白(2. 5yg))，即得Rv3117重組蛋白(SEQ ID NO:”。含有Rv3117重組蛋白做為抗原的檢測結核病的試劑盒的應用評估Rv3117重組蛋白作為檢測抗原對PPD-健康對照、PPD+健康對照血清和結核病人血清中IgG的反應效果，利用間接酶聯免疫吸附試驗檢測不同血清標本中抗Rv3117的IgG反應具體步驟如下 含有Rv3117重組蛋白的檢測結核病的試劑盒中，還包括(I)包被稀釋液ρΗ9· 6濃度O. 05Μ的碳酸鹽緩沖液(常用市售分子生物學試劑)；(2) PBST洗滌緩沖液(常用市售分子生物學試劑);(3)樣本稀釋液含I % BSA的PBST (常用市售分子生物學試劑)；(4)經標記的二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG或辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgM ；(5)陽性對照品和陰性對照品；(6)底物溶液底物緩沖液A :乙酸鈉2. 4g，檸檬酸O. 28g依次加入，溶于88ml超純水(皿1111 01^，”，以下同)，在磁力攪拌器中攪拌溶解，加入53111 30%H202 (過氧化氫溶液)，磁力攪拌器攪拌溶解；底物緩沖液B :80ml超純水中加入O. 03g TMB(3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺)和O. 32g EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉，常用市售分子生物學試劑)，然后再加入8ml甘油，攪拌，溶解；(7)終止液2M硫酸；⑶96 孔酶標板(Costar，US)；96孔酶標反應板用2μ g/ml的抗原Rv3117(又稱Rv3117重組蛋白)包被16小時，棄去包被液，PBST洗滌緩沖液洗滌5次，每次洗2分鐘，甩干，每孔加入300 μ I含I % BSA的PBST樣本稀釋液，37°C溫育2h，甩干，每孔加入100 μ I用含I % BSA的PBST樣本稀釋液稀釋的待檢血清，1% BSA的PBST樣本稀釋液和待檢血清的體積比為I : 50，37°C溫育O. 5h，棄去血清，PBST洗滌緩沖液洗滌5次，甩干，每孔加入100 μ I用含1% BSA的PBST 樣本稀釋液稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG抗體(Jackson，USA)，37°C溫育O. 5h， 棄去液體，PBST洗滌緩沖液洗滌5次，甩干，每孔加入100 μ I底物液混合物，底物液混合物是用底物緩沖液A與底物緩沖液B以體積比I : I配制成，37°C避光溫育lOmin，每孔加入 50 μ I 2Μ硫酸終止液終止反應，450nm后檢測OD值，以健康對照者血清(包括PPD-健康對照、PPD+健康對照血清)標本的平均OD值加3倍標準方差作為Cutoff的判斷標準，當待檢血清標本的OD值大于或等于判斷標準時，即判斷為陽性，反之為陰性。結果表明，做為單一檢測的蛋白抗原，本發明制備的Rv3117重組蛋白在診斷結核病方面具有更高的敏感性和特異性，經反復試驗，取得了良好的效果，如表I所示表1RV3117重組蛋白分別對健康對照血清和結核病人血清IgG反應結果
權利要求
1.一種結核分枝桿菌Rv3117重組蛋白，其特征在于，Rv3117重組蛋白的序列為SEQ ID NO: I。
2.一種結核分枝桿菌Rv3117重組蛋白的制備方法，其特征在于，由以下步驟實現(1)、根據Rv3117基因序列來設計靶基因引物；(2)、以結核分枝桿菌菌株基因組DNA為模板，PCR擴增，得PCR產物，PCR產物經純化后得Rv3117基因純化序列，雙酶切，得酶切產物；(3)將酶切產物插入至表達質粒中和酶切Rv3117基因純化序列所用的限制內切酶相對應的酶切位點處，采用常規方法克隆構建重組質粒，測序表明重組質粒的基因序列與 GenBank中H37Rv結核全基因組中對應基因序列Rv3117基因完全一致；(4)將構建的重組質粒轉化入和表達質粒相匹配的宿主細胞中進行蛋白表達，得表達蛋白 Rv3117 ；(5)誘導表達蛋白Rv3117，得誘導表達產物；(6)分離純化誘導表達產物，得到Rv3117重組蛋白SEQID NO: 1，Rv3117重組蛋白的基因序列與NCBI上的CAE55554. I蛋白序列相比，加入了表達質粒相關序列和純化標簽，即使用pET32a表達質粒時，重組蛋白后面加了 pET32a上的相關序列和一段His Tag純化標簽;所述的表達質粒為pET21a、pET32a、pET28b、pET30a或pET32a中的一種；所述的宿主細胞為大腸桿菌的BL21 DE3菌株或BL21 DE3 physS菌株；所述的結核分枝桿菌菌株基因組DNA為結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA ;所述的Rv3117基因序列包括對BX842582. I中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列，由于密碼子的簡并性，所以與BX842582. I核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼相同的氨基酸序列。
3.根據權利要求I或2所述的結核分枝桿菌Rv3117重組蛋白的制備方法，其特征在于，由以下步驟實現1)、重組質粒pET32a-Rv3117的構建(1)靶基因引物設計Rv3117-F:5’ -CATACCATGGCACGCTGCGAT -3，;Rv3117-R:5’ - CTTCTCGAGTCAGCTTCCCAA -3，;酶切位點分別為Afco UXho I'(2)靶基因的PCR擴增、克隆及序列測定以結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，Rv3117-F為上游引物和Rv3117_R為下游引物，應用Taq酶，通過PCR擴增，得PCR產物，PCR擴增的反應條件94°C預變性5min，94°C 變性30s ;58°C退火30s ;72°C延伸40s，35個循環;72°C延伸5min ;4°C保存，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，再用DNA回收試劑盒回收，得Rv3117基因純化序列，將Rv3117 基因純化序列用限制內切酶Afco I和限制內切酶通ο I酶切，插入到pET32a表達質粒的 AfcoI酶切位點和通ol酶切位點中，克隆構建重組質粒pET32a-Rv3117，測序表明重組質粒 pET32a-Rv3117的基因序列和GeneBank中H37Rv結核全基因組相應基因序列完全一致；2)重組質粒pET32a-Rv3117的誘導表達及純化取IOOul BL21 DE3 physS感受態細胞裝入印pdorf管，放入冰上，3-5分鐘管內液體融化后，將O. 5ul測序正確的重組質粒pET32a-Rv3117轉化入感受態細胞中進行蛋白表達，冰上放置45min，42°C水浴鍋中，熱擊90s，冰上靜置3min，得表達蛋白Rv3117，在表達蛋白Rv3117中加入500ul的不含抗生素的LB培養基，37°C搖床，220rmp，培養45_60min， 然后取IOOul在含卡那霉素的固體LB培養基平皿上涂布，18-25°C干燥后，倒置于37°C溫箱中培養10 - 12小時，挑取克隆，放入含50ug/ml卡那霉素的抗性的LB液體培養基中， 220rmp, 37°C培養OD值至O. 4-0. 7，加入終濃度為IOmM的IPTG誘導劑，37°C誘導3h，收集誘導后的菌體，按IOml洗滌緩沖液I每克菌體的比例重懸后超聲破碎，得混合液，取混合液IOOOOg離心30min，收集含目的蛋白的上清液，用IMAC親和色譜柱Bio-Rad進行親和純化，即先用2CV去離子水沖洗2ml/min，3min，5CV的洗滌緩沖液I平衡親和柱，再取6CV包含目的蛋白的上清液上樣，依次用6CV洗滌緩沖液I沖洗，2ml/min, 3min, 6CV洗滌緩沖液 II沖洗，2ml/min , 3min, IOCV的洗漆緩沖液III洗脫2ml/min , 5min,收集洗脫液,得純化的目的蛋白，再用PH 8.0的20禮Tris-HCl緩沖液透析，得目的蛋白液，用10 kDa超濾管對透析后的目的蛋白液進行濃縮，得濃縮的目的蛋白，用BCA法測定濃縮的目的蛋白的濃度，SDS-PAGE電泳分析目的蛋白純度為95%，即得Rv3117重組蛋白SEQ ID NO: I;所述的洗滌緩沖液I是由KCl :300mM、KH2P04 :50mM、咪唑5mM混合組成；所述的洗滌緩沖液II是由KCl :300mM、KH2P04 :50mM、咪唑10mM混合組成；所述的洗滌緩沖液III是由KCl :300mM、 KH2P04 :50mM、咪唑250mM 混合組成。
4.權利要求I或2或3所述的結核分枝桿菌Rv3117重組蛋白在檢測結核病的診斷試劑中的應用。
5.權利要求I或2或3所述的結核分枝桿菌Rv3117重組蛋白或含有Rv3117重組蛋白的特異性抗體在檢測結核病的試劑盒中的應用，所述的試劑盒還包含有(1)包被稀釋液pH9.6濃度O. 05M的碳酸鹽緩沖液；(2)PBST洗滌緩沖液；(3)樣本稀釋液含1%BSA的PBST；(4)經標記的二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG或辣根過氧化物酶標記的羊抗人 IgM；(5)陽性對照品和陰性對照品；(6)底物溶液底物緩沖液A:乙酸鈉2. 4g，檸檬酸O. 28g依次加入，溶于88ml超純水， 在磁力攪拌器中攪拌溶解，加入53 μ I 30%Η202，磁力攪拌器攪拌溶解；底物緩沖液B 80ml 超純水中加入O. 03g TMB和O. 32g EDTA_Na2，然后再加入8ml甘油，攪拌，溶解；(7)終止液2M硫酸；(8)96孔酶標板。
全文摘要
本發明涉及結核分枝桿菌Rv3117重組蛋白的制備方法及其應用，有效解決結核病的診斷檢出率低，費用高，操作復雜及診斷試劑效果差的問題，根據Rv3117基因序列來設計靶基因引物，以結核分枝桿菌菌株基因組DNA為模板，PCR擴增，純化后得Rv3117基因純化序列，雙酶切，得酶切產物，將酶切產物插入至表達質粒中，克隆構建重組質粒，將構建的重組質粒轉化入和表達質粒相匹配的宿主細胞中進行蛋白表達，誘導表達蛋白Rv3117，分離純化誘導表達產物，得到Rv3117重組蛋白，本發明Rv3117重組蛋白在檢測肺結核方面敏感性高，是一個活性強的B細胞目標抗原，用于結核病檢測試劑盒的制備，敏感性高而且安全可靠。
文檔編號C12N15/31GK102584962SQ20121007059
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月16日 優先權日2012年3月16日
發明者劉文第, 孫戰強, 宋言崢, 張舒林, 張苗苗, 趙俊偉 申請人:河南中醫學院