專利名稱：人精氨酸酶和定點聚乙二醇化人精氨酸酶及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種精氨酸酶，以及其制備方法和在治療與精氨酸酶相關的疾病中的應用。具體的，本發明提供了一種點突變的精氨酸酶及其制備方法和在治療與精氨酸酶相關的疾病中的應用。本發明還提供了一種位點特異性聚乙二醇化的精氨酸酶及其制備方法和應用。
背景技術：
精氨酸是一種哺乳動物包括人的重要氨基酸，參與各種生理過程，包括細胞增殖和生長。例如，精氨酸可作為潛在信號分子氧化氮(NO)合成的直接前體。NO作為一種精神遞質，平滑肌松弛劑和血管擴張劑而起作用。NO的生物合成涉及由氧化氮合酶催化的Ca++及NADPH-依賴性反應。精氨酸的另一個作用是作為多胺、亞精胺或精胺的前體，參與不同的生理過程。有研究發現，精氨酸低于8μ M水平時，癌細胞發生不可回復的細胞死亡(Srorr&Burton,1974, The effects of arginine deficiency on lymphoma cells.Br.J.Cancer 30，50)。通過研究對細胞生長的影響發現，將精氨酸移除后正常細胞系會由細胞周期的GO期進入靜止狀態，且能在這種環境下存活幾周而無明顯損傷；當精氨酸濃度恢復正常時，細胞又能開始恢復正常的生理周期；而對于腫瘤細胞來說，精氨酸的匱乏會導致其經過細胞周期Gl期的‘R’點進入S期，并很快凋亡。這種由于精氨酸匱乏而導致腫瘤細胞的凋亡是不可逆的。因此，科學家們開始考慮通過控制機體中精氨酸的水平來對腫瘤，尤其是營養缺陷型腫瘤如肝癌和黑素瘤進行治療。現今這種方式已被用來研究各種腫瘤細胞的抑制。精氨酸酶是催化水解L-精氨酸生成鳥氨酸與尿素的反應的酶，一般含于產生尿素的動物(哺乳類、板鰓魚類、兩棲類、海龜類)的肝臟、腎臟、精巢中，作為尿素循環的一個環節而起作用。精氨酸酶是 催化哺乳動物尿素循環途徑中尿素形成最終步驟的酶，將精氨酸轉化為鳥氨酸和尿素。在大多數哺乳動物中，人精氨酸酶家族包括精氨酸酶I和精氨酸酶II。精氨酸酶I主要在肝臟細胞表達，精胺酸酶II在腎臟和紅細胞表達為主。通過兩種方法可以得到精氨酸酶，一是從產生它的生物體中分離出來，另一種是通過基因工程技術重組得到。通過基因工程技術重組生產精氨酸酶存在其優越性。例如，實驗證明，大腸桿菌可以生產大量的精氨酸酶。然而，通過基因工程技術重組生產精氨酸酶有時會存在技術難題，例如，酶活性較低，或在體內的穩定性差及半衰期短，無法應用于實際臨床。US7951366B2公開了一種利用精氨酸剝奪來治療人惡性腫瘤的藥物組合物及方法。其中使用了帶有his-tag的重組人精氨酸酶I，通過分子量為5，000 (MW5，000)的聚乙二醇對精氨酸酶N-端或表面氨基酸中帶有氨基的基團共價偶聯聚乙二醇修飾，修飾后的人精氨酸酶的穩定性增加，在人血清中的半衰期為3天。US20100247508A1中對帶有his_tag的人精氨酸酶進行了改造，將168和303位半胱氨酸替換為絲氨酸，并利用分子量為20KDa的聚乙二醇對人精氨酸酶進行修飾。但是，與US7951366B2公開的重組人精氨酸酶I相同，該精氨酸酶帶有額外的多肽片段如His_tag。而大部分國家的藥物管理機構不建議使用這些多肽片段，例如中國國家食品藥品監督管理局在“人用重組DNA制品質量控制技術指導原則”中提出以簡化生產工藝為目的在產品中引入額外的多肽片段如His-tag，在最終產品中應盡可能去除。WO 2011/008495A2公開了在保留人精氨酸酶本身所帶有的三個半胱氨酸的基礎上，在N端第三個氨基酸的位置加入了一個半胱氨酸殘基，然后利用分子量為20KDa的甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺對加入一個半胱氨酸殘基的人精氨酸酶進行修飾。但該人精氨酸酶本身所帶有的三個半胱氨酸仍然存在，形成的PEG化人精氨酸酶的產物不均一且產率低，難于分離純化。因此，本領域需要一種更好的精氨酸酶或其衍生物，用于治療與精氨酸相關的疾病或異常。

發明內容

本發明提供一種分離和基本純化的精氨酸酶。精氨酸酶是催化哺乳動物尿素循環途徑中尿素形成最終步驟的酶，將精氨酸轉化為鳥氨酸和尿素。在大多數哺乳動物中，精氨酸酶家族包括精氨酸酶I和精氨酸酶II。對各種來源的精氨酸酶I進行了測序和活性研究發現，不同來源的精氨酸酶I的序列可能有所區別，但也具有很多保守的區域和活性位點。如 Haraguchi, Y.等，1987,Proc.Natl.Acad.Sc1.84,412-415 中報道的，野生型人精氨酸酶I具有SEQ ID N0.1的氨基酸序列，其中具有三個半胱氨酸，分別位于SEQ ID N0.1氨基酸序列的第45，168和303位，其基因具有如SEQ ID N0.2的核酸序列。本發明中，術語“分離”是指非天然的形式。術語“基本上純化”是指可能存在用于生產和/或修飾蛋白質的其它成分，但所述其它成分占整個產物基本不存在或比例較小。本發明中對氨基酸序列位點的描述是本領域技術人員常用的。例如，“在序列為SEQ ID SEQ X上的第45位”或“在序列為SEQ ID SEQ x上的第45位Cys (即半胱氨酸)”或表述“ Cys45”具有相同或相近的含義，都是表示在氨基酸序列上第45位氨基酸，或第45位的半胱氨酸。在本發明的一個方面，本發明提供了一種突變的精氨酸酶，其特征在于，所述精氨酸酶為人精氨酸酶I，其具有(I)對應于SEQ ID NO I的氨基酸序列，并且其中第45，168和303位的半胱氨酸中的一個、兩個或三個發生突變，或(2)在上述氨基酸序列中還引入了一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有精氨酸酶的活性。在本發明的一個方面，本發明的精氨酸酶中所述半胱氨酸突變為非極性氨基酸。氨基酸根據側鏈基團的性質可分為極性氨基酸和非極性氨基酸。氨基酸的側鏈基團不帶電荷或極性極微弱的屬于非極性氨基酸，如:甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸。在本發明的其中一個方面，本發明的精氨酸酶中所述半胱氨酸突變為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸。優選的，本發明的精氨酸酶中所述半胱氨酸突變為丙氨酸。在本發明中，出乎意料地發現，人精氨酸酶I序列中屬于非電離極性氨基酸的半胱氨酸突變成屬于非極性氨基酸性質的氨基酸(例如丙氨酸)后，酶活性明顯增加。其中一種可能是突變的精氨酸酶與底物之間的結合能力增強。在本發明的一個方面，本發明的精氨酸酶在SEQ ID N0.1的氨基酸序列上的第45，168和303位的半胱氨酸中的一個發生突變。在本發明的其中一個方面，本發明的精氨酸酶在SEQ ID N0.1的氨基酸序列上的第303位半胱氨酸突變，所述半胱氨酸優選突變為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸，更優選的，突變為丙氨酸。在本發明的一個方面，本發明的精氨酸酶在所述精氨酸酶的第45，168和303位的半胱氨酸中的任意兩個發生突變。在本發明的其中一個方面，本發明的精氨酸酶在SEQ IDN0.1的氨基酸序列上的第45位和第303位半胱氨酸突變，所述半胱氨酸優選突變為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸，更優選的，突變為丙氨酸。在本發明的其 中一個方面，本發明的精氨酸酶在SEQ ID N0.1的氨基酸序列上的第168位和第303位半胱氨酸突變，所述半胱氨酸優選突變為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸，更優選的，突變為丙氨酸。在本發明的其中一個方面，本發明的精氨酸酶在SEQ ID N0.1的氨基酸序列上的第45位和第168位半胱氨酸突變，所述半胱氨酸優選突變為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸，更優選的，突變為丙氨酸。在本發明的其中一個方面，本發明的精氨酸酶在SEQ ID N0.1的氨基酸序列上的第45位、第168位和第303位半胱氨酸突變，所述半胱氨酸優選突變為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸，更優選的，突變為丙氨酸。 本發明的精氨酸酶具有比野生型精氨酸酶更強的活性。本發明的精氨酸酶的特異性活性一般為至少大約500U/mg,優選至少大約700U/mg,最優選至少大約800U/mg。本發明的精氨酸酶一般具有比野生型精氨酸酶更強的活性。在本發明的一個方面，本發明的精氨酸酶具有SEQ ID N0.2的堿基序列的多核苷酸，并且其中至少一個編碼對應于SEQ ID N0.1氨基酸序列第45，168和303位的半胱氨酸的堿基序列發生替換。優選的，其中的一個、兩個或三個編碼半胱氨酸的堿基序列發生替換。氨基酸是由多核苷酸編碼的。多核苷酸中的信使RNA鏈上決定一個氨基酸的相鄰的三個堿基叫做一個“密碼子”，亦稱三聯體密碼。在本發明的一個方面，所述堿基的替換是由TGT替換為編碼甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸的堿基序列，優選的，替換為編碼丙氨酸的堿基序列。在本發明的其中一個方面，編碼丙氨酸的堿基序列為GCT，GCC, GCA, GCG，優選為GCT。在本發明的一個方面，本發明提供了制備上述精氨酸酶的方法，其包括將精氨酸酶基因或突變后的精氨酸酶基因在可表達蛋白的宿主中進行表達。本發明的制備精氨酸酶的方法通常包括以下主要步驟。通過PCR或合成的方法獲得目的基因或目的核苷酸片段。將帶有目的基因的DNA片段連接到能夠獨立復制并具有選擇標記的載體上，如質粒、噬菌體和病毒等，以形成重組DNA分子。DNA片斷與載體的連接方式主要有同聚末端連接、粘性末端連接、平齊末端連接及人工接頭分子連接。重組DNA必須進入宿主細胞中，才能得到擴增和表達。根據載體的性質不同，可采用轉染、轉化、轉導等方式，將重組DNA分子導入宿主細胞內，并使其大量繁殖。合適的基因工程宿主是本領域公知的，可以是大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞等。本發明還提供一種分離和基本純化的聚乙二醇化(Pegylation)的精氨酸酶,其特征在于，所述聚乙二醇化是位點特異性的。本發明聚乙二醇化的精氨酸酶中聚乙二醇分子與精氨酸酶分子上的特定氨基酸殘基發生共價結合，達到位點特異性聚乙二醇化的目的。在本發明的聚乙二醇化的精氨酸酶中，每個精氨酸酶分子與至少一個聚乙二醇分子結合，形成聚乙二醇化的精氨酸酶。在本發明的一個方面，本發明聚乙二醇化的精氨酸酶中的精氨酸酶是前文描述的突變的精氨酸酶。在本發明的一個方面，本發明提供了一種聚乙二醇化的精氨酸酶，其特征在于，所述精氨酸酶為人精氨酸酶I，其具有(I)對應于SEQ ID NO I的氨基酸序列，并且其中第45，168和303位的一個或兩個半胱氨酸發生突變，或(2)在上述氨基酸序列中還引入了一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有精氨酸酶的活性。在本發明的一個方面，本發明的聚乙二醇化的精氨酸酶中所述半胱氨酸點突變為非極性氨基酸。20種蛋白質氨基酸在結構上的差別取決于側鏈基團的不同。氨基酸的側鏈基團不帶電荷或極性極微弱的屬于非極性氨基酸，如:甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸。在本發明的其中一個方面，所述聚乙二醇化的人精氨酸酶I的序列不具有用于純化此蛋白的標簽序列， 例如在其C末端或N末端加入His-tag序列。HiS-Tag融合蛋白是目前最常見的表達方式，它的優點是純化方便而且基本不影響蛋白的活性，無論是表達的蛋白是可溶性的或者包涵體都可以用固定金屬離子親和色譜純化。但是由于其潛在的免疫原性，中國國家食品藥品監督管理局在“人用重組DNA制品質量控制技術指導原則”中提出以簡化生產工藝為目的在產品中引入額外的多肽片段如His-tag，在最終產品中應盡可能去除。在本發明中，對精氨酸酶的聚乙二醇化可以通過化學修飾的方法實現，所述化學修飾可以通過帶有偶聯劑的聚乙二醇衍生物(也稱為聚乙二醇修飾劑)，將聚乙二醇分子與精氨酸酶上的基團共價結合。所述化學修飾可以是特異性的，即通過使用與特定基團結合的偶聯劑，令PEG只能與精氨酸酶上的特定氨基酸結合。定點PEG化修飾需遵循以下原則:(1)盡量避免蛋白質活性部位的修飾，以防對蛋白質活性發生影響；(2)盡量簡化整個過程，是其具有可控性。普通的聚乙二醇分子兩端各有一個羥基，若一端以甲基封閉則得到甲氧基的聚乙二醇(mPEG)。在多肽和蛋白質的聚乙二醇修飾中研究最多的聚乙二醇修飾劑是mPEG的衍生物。其中一種常見的聚乙二醇修飾方式是將聚乙二醇分子/聚乙二醇修飾劑與蛋白表面賴氨酸或蛋白N-端的ε -ΝΗ2或α -ΝΗ2結合，例如mPEG-琥珀酰亞胺丁酸酯(mPEG-SBA)，mPEG_丙酸琥珀酰亞胺酯(mPEG_SPA)，mPEG_琥珀酰亞胺琥珀酸酯(mPEG_SS)，mPEG-琥珀酰亞胺碳酸酯(mPEG-SC)，mPEG-戊二酸單酯-羥基琥珀酰亞胺酯(mPEG_SG)，mPEG-酰胺-琥珀酸亞胺酯(mPEG-NHS)，mPEG-三氟乙基磺酸酯(mPEG tresylate)和mPEG-醛(mPEG aldehyde)。另外常見的PEG修飾方式是利用巰基的高親核性，選取能夠特異性與蛋白質的巰基偶聯的聚乙二醇分子/聚乙二醇修飾劑，如mPEG-馬來酰亞胺，mPEG-鄰-卩比唳-二硫醚，mPEG-乙烯基砜，mPEG-碘乙酰胺等來修飾蛋白質或多肽的巰基基團。由于蛋白質或多肽的巰基比較少，較易形成均一性產物。人精氨酸酶I單體有三個半胱氨酸殘基，分別位于氨基酸序列當中的45，168和303位。在本發明的一個方面，所述聚乙二醇化的精氨酸酶在其第45，168和303位的一個或兩個半胱氨酸位點發生定點聚乙二醇化。在本發明的一個方面，所述定點聚乙二醇化通過對精氨酸酶的半胱氨酸進行基因工程定點突變，然后進行半胱氨酸特異性聚乙二醇化修飾實現。在本發明的又一個方面，所述半胱氨酸特異性聚乙二醇化修飾是通過使用甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺偶聯劑將PEG與精氨酸酶上的半胱氨酸的巰基基團共價結合。在本發明的一個方面，把本發明的精氨酸酶中不需要PEG化的一個或兩個半胱氨酸點突變，優選突變為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，更優選突變為丙氨酸。PEG分子量的選擇要綜合考慮生物活性和藥代動力學兩方面的因素。已有的研究發現，修飾的蛋白藥物在體內的作用時間與偶聯的PEG數量和分子量有一定關系。用于本發明的PEG，其分子量范圍可以在5K-40K道爾頓之間，可能是線性的或者含支鏈的分子，以及可能是本領域述及的PEG衍生物。本發明中共價結合至精氨酸酶分子的PEG分子并非限定于特定類型。在本發明的一個方面，對精氨酸酶進行PEG化的PEG分子的平均分子量為20K、30K或40K。PEG化蛋白通過靜脈注射的方式進入體內，聚乙二醇的平均分子量大小會影響其在血清的半衰期。研究發現，腎臟對PEG分子的清除取決于腎小球的濾過速率。對于蛋白質，腎小球可以濾過分子量小于70KDa的蛋白質分子；對于PEG來說，腎小球可以濾過分子量小于30KDa的PEG分子。PEG的分子量其對要結合的蛋白的半衰期和活性的影響通常是不可預測的，與蛋白的分子量、作用方式、活性部位、PEG結合位點等密切相關。在本發明的其中一 個方面，所述聚乙二醇化的精氨酸酶在SEQ ID N0.1定義的氨基酸序列第45位和第168位兩個位點發生定點聚乙二醇化，優選的，其中所述定點聚乙二醇化通過將所述精氨酸酶的第303位半胱氨酸突變實現，其中所述PEG的平均分子量為20K或30K。其中，所述半胱氨酸優選突變為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，更優選突變為丙氨酸。在本發明的一個方面，所述的聚乙二醇化的精氨酸酶在SEQ ID N0.1定義的氨基酸序列第168位發生定點聚乙二醇化，其中所述定點聚乙二醇化通過將所述精氨酸酶的第45位和第303位半胱氨酸突變實現，其中所述PEG的平均分子量為40K。其中，所述半胱氨酸優選突變為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，更優選突變為丙氨酸。在本發明的一個方面，所述聚乙二醇化的精氨酸酶在SEQ ID N0.1定義的氨基酸序列第45位發生定點聚乙二醇化，其中所述定點聚乙二醇化是通過將精氨酸酶的第168位和第303位半胱氨酸突變實現，其中所述PEG的平均分子量為40K。其中，所述半胱氨酸優選突變為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，更優選突變為丙氨酸。
本發明提供的聚乙二醇化的精氨酸酶的純度通常超過超過70%，優選超過80%，最優選為90%。本發明中所述“聚乙二醇化的精氨酸酶的純度”是指在對精氨酸酶進行聚乙二醇化的化學修飾生產中，產物里PEG化精氨酸酶(即共價結合PEG的精氨酸酶)占總的精氨酸酶(共價結合PEG的精氨酸酶，未共價結合PEG的精氨酸酶和多聚的PEG化精氨酸酶)的比例。通常，由于PEG化反應后產物中還含有未共價結合PEG的精氨酸酶和多聚的PEG化精氨酸酶，因此需要對產物進行純化。常用的純化手段是本領域公知的技術，包括陽離子交換柱等。本發明提供的聚乙二醇化的精氨酸酶在血液或血清中的半衰期為至少0.5天，優選至少2.5天，最優選至少3.5天。精氨酸酶的半衰期可以通過本領域公知和常用的方法進行測量。精氨酸酶在血液或血清中的半衰期的測量數據與采用的動物模型有一定關系。在代謝速率較快的動物模型(例如大鼠)中獲得的半衰期數據通常比在代謝速率較快的動物模型(例如人體)中獲得的數據短。本發明還提供了制備聚乙二醇化(Pegylation)的精氨酸酶的方法。所述聚乙二醇化是位點特異性的。本發明聚乙二醇化的精氨酸酶中聚乙二醇分子與精氨酸酶分子上的特定氨基酸殘基結合，達到位點特異性聚乙二醇化的目的。在本發明的聚乙二醇化的精氨酸酶中，每個精氨酸酶分子與至少一個聚乙二醇分子結合，形成聚乙二醇化的精氨酸酶。在本發明中，對精氨酸酶的定點聚乙二醇化可以通過化學修飾的方法實現，所述化學修飾是通過使用偶聯劑將PEG與精氨酸酶上的基團共價結合。所述化學修飾可以是特異性的，即通過使用與特定基團結合的偶聯劑，令PEG只能與精氨酸酶上的特定氨基酸結
八
口 ο本發明還提供了 利用上述本發明的任意一種精氨酸酶或聚乙二醇化的精氨酸酶或其藥物組合物在治療與精氨酸酶有關的疾病的藥物中的應用/用途。本領域已知所述與精氨酸酶有關的疾病包括，例如哺乳動物中與體內精氨酸相關的病癥/疾病/紊亂。此類病癥/疾病/紊亂包括:高精氨酸血癥。由于精氨酸酶活性的缺乏，患者體內的精氨酸不能裂解為尿素并加入鳥氨酸代謝循環，血中精氨酸含量可高出正常7 10倍，同時腦脊液和尿中精氨酸也增多，尿中肌酐排出量增高。另外，此類病癥/疾病/紊亂還包括精氨酸依賴性的細胞增生或腫瘤，例如肝癌，黑色素細胞瘤，乳腺癌，小細胞肺癌，前列腺癌，淋巴癌和白血病。。通過研究對細胞生長的影響發現，將精氨酸移除后正常細胞系會由細胞周期的GO期進入靜止狀態，且能在這種環境下存活幾周而無明顯損傷，當精氨酸濃度恢復正常時，細胞又能開始恢復正常的生理周期；而對于增生的細胞或腫瘤來說，精氨酸的匱乏會導致其經過細胞周期Gl期的‘R’點進入S期，并很快凋亡。這種由于精氨酸匱乏而導致增生的細胞或腫瘤是不可逆的。因此，科學家們開始考慮通過控制機體中精氨酸的水平來治療細胞增生或腫瘤。本發明還提供了一種藥物組合物，此藥物組合物的活性成分是上述本發明的精氨酸酶或聚乙二醇化的精氨酸酶。所述藥物組合物的配方可以以固體、溶液、乳劑、分散體、膠束、脂質體等形式應用，其中所得配方含有一或多種本發明的人精氨酸酶或聚乙二醇化的精氨酸酶作為活性成分，并與適于腸道或胃腸外應用的有機或無機物載體或賦形劑混合。另外，可以使用佐劑、穩定劑、增稠劑、著色劑及香料。一或多種分離的并基本上純化的人精氨酸酶或聚乙二醇化的精氨酸酶的活性成分也包括在足夠量的藥物配方中以對目的過程、條件或疾病產生所希望的作用。上述藥物組合物可以制成適于口服的藥劑形式，例如，片齊IJ、藥片、止咳糖、水化或油化懸液、分散的粉末或顆粒、乳劑、硬或軟的膠囊、或糖漿。口服的配方可以按照本領域已知技術進行包囊化以減緩分解以及在胃腸道的吸收，因而提供了較長時間的持續作用。所述配方還可以是無菌的可注射溶液或懸液的形式。所述懸液可以是按照已知方法使用分散或潤濕劑及懸浮劑進行配制。本發明的藥物組合物可進一步被制備成固體、液體、懸浮液、微膠粒、或微脂體的形式。在本發明的一個方面，所述藥物組合物的配方是適用于口服或注射的形式。


圖1示出野生型人精氨酸酶I的核酸序列。圖2示出人精氨酸酶表達的還原性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果。圖3示出人精氨 酸酶表達的液相色譜圖。圖4示出野生型精氨酸酶I經還原及非還原處理后凝膠電泳檢測結果。圖5示出純化后的精氨酸酶I突變體(rhArg1-A303, rhArgI_A168/303,及rhArg1-A45/303)經還原及非還原處理后凝膠電泳檢測結果。圖6示出純化后的精氨酸酶I突變體(rhArg1-A45/168，及rhArg1-A45/168/303)經還原及非還原處理后凝膠電泳檢測結果。其中6a為rhArgI_A45/303,及rhArgI_A45/168/303經非還原處理后凝膠電泳檢
測結果。其中6b為rhArgI_A45/168,及rhArgI_A45/168/303經還原處理后凝膠電泳檢測
結果圖7示出聚乙二醇化人精氨酸酶的非還原性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果。
具體實施例方式本發明將在下面的實施例中進一步說明。應當理解，盡管這些實施例說明了本發明的優選實施方案，但僅是以例證的方式給出的。根據上面的論述和這些實施例，本領域的技術人員可以確定本發明的基本特征，并在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，可對本發明做出多種改變和修飾，以使其適用于多種用法和條件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之外，根據前文所述，本發明的各種修改形式對本領域的技術人員來說將是顯而易見的。這些修改形式也旨在屬于所附權利要求書的范圍內。實施例一:不含His-tag的人精氨酸酶I重組質粒pET30a (+)-rharginase-V的構建及表達人精氨酸酶I的基因序列公布于1987年(Haraguchi, Y.等，1987, Proc.Natl.Acad.Sc1.84,412-415)。以人肝臟 5’stretch plus cDNA 文庫(clontech)為模板，基于上述人精氨酸酶I的基因序列設計引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)獲得人精氨酸酶I核酸片段。引物ARG-V(+)含有一個Ndel限制性內切酶位點，引物ARG-V㈠含有一個Xhol限制性內切酶位點，按照分子生物學領域普通實驗技術進行聚合酶鏈式反應(PCR)得到核酸片段，并以瓊脂糖凝膠電泳確認。將上述擴增所得片斷和市購獲得的pET30a(+)表達載體分另1J用含有限制性內切酶Ndel和Xhol (購自promega)的反應介質中于37°C處理1.5小時，已酶解的片斷與T4DNA連接酶在16°C反應過夜。然后將所述已連接的質粒轉化入感受態細胞DH5ci大腸桿菌細胞內。在含有30 μ g/ml卡那霉素的LB營養瓊脂平板上進行篩選。通過限制性內切酶分析獲得具有正確插入片斷的質粒，稱為pET30a(+) -rharginase-V,所述質粒進行測序確認其插入片段。插入片段包含969個堿基，如圖1所示，其核酸序列為SEQID N0.2。ARG-V (+):5' GGAATTCCATATGAGCGCCAAGTCCAGAACCATAG3/NdelARG-V (-):5' CCGCTCGAGTTATTACTTAGGTGGGTTAAGGTAGTCAATAGG3'Xhol實施例二:不含His-tag的人精氨酸酶I重組質粒pET30a (+)-rharginase-V的表達和目的蛋白純化將100 μ I BL21 (DE3)感受態細胞置于冰上融化，向感受態細胞懸液中加入I μ I所述已構建的pET30a(+)-rharginase-V質粒，混勻后冰浴放置30分鐘,然后將混合物于42°C水浴放置90秒，再快速轉移至冰浴中放置2分鐘。加入500 μ I LB液體培養基，于37°C，150rpm震蕩培養I小時。取200 μ I涂布含有卡那霉素的LB營養瓊脂平板，37°C倒置培養16小時。挑選所述轉化細胞培養平板單一菌落并轉移到25mL LB培養基。所述細胞在370C，150rpm震蕩培養至0D600nm達到0.6-0.8，加入終濃度為0.2mM IPTG誘導表達3小時。SDS-PAGE電泳檢測所挑選克隆是否有目的蛋白的表達。挑選表達量較高的克隆制備甘油菌保存作為工程菌。將上述大腸桿菌工程菌在15L發酵罐中以分批補料的方式培養，當0D600nm達到12-13時，加入終濃度為0.2mM IPTG誘導表達3_4小時。將所獲得的菌體進行破菌離心，取上清液進行下一步的分離純化。蛋白的純化采用CM陽離子交換層析。先用Tris-HCl平衡液平衡層析柱，然后將所述離心得到的上清液上樣，上樣完畢后繼續用3倍柱體積的平衡液沖洗弱結合的雜質。待UV280nm檢測值穩定后，用含有Tris-HCl及NaCl的洗脫液進行洗脫，收集目的峰。對收集的樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和高壓液相色譜分析純度。實驗結果如圖2，3所示。圖2是人精氨酸酶表達的凝膠電泳檢測結果。其中各泳道的樣品為:1:蛋白分子量標準；2.破菌上清液；3.純化的不含His-tag的人精氨酸酶I ;4.CM陽離子交換柱流出液。
圖3是人精氨酸酶表達的液相色譜圖。根據圖2和圖3可見，經上述層析方法所獲得的精氨酸酶的純度為90%以上。實施例三:人精氨酸酶I (rhArgl)的定點突變以野生型人精氨酸酶質粒pET30a-rharginasel_V為模板,利用Stratagene公司的 QuikChange Site-directed Mutagenesis kit 對人精氨酸酶 I 序列中 45,168,和 303 位編碼半胱氨酸的密碼子分別進行單點，雙點或三點定點突變，將45，168，和303位編碼半胱氨酸的密碼子(TGT)替換成編碼丙氨酸的密碼子(GCT)。引入45，168，和303位替代酸密碼子(GCT)的引物分別為:ARG-m45 (+):5' GAGAAACTTAAAGAACAAGAGGCTGATGTGAAGGATTATGGGG3'ARG-m45 (-):5' CCCCATAATCCTTCACATCAGCCTCTTGTTCTTTAAGTTTCTC3'ARG-ml68 (+):5' GATTCTCCTGGGTGACTCCCGCTATATCTGCCAAGGATATTG3'ARG-ml68 (-):5' CAATATCCTTGGCAGATATAGCGGGAGTCACCCAGGAGAATC3'ARG-m303 (+):5' GTTGCAATAACCTTGGCTGCTTTCGGACTTGCTCGGG3'ARG-m303 (-):5' CCCGAGCAAGTCCGAAAGCAGCCAAGGTTATTGCAAC3'按照試劑盒說明書所提供的方法進行聚合酶鏈式反應(PCR)，然后以限制性內切酶Dpn I消化模板質粒，及轉化感受態細胞。將獲得的重組突變質粒測序確認。測序結果經比對后選擇半胱氨酸的密碼子(TGT)成功突變成丙氨酸的密碼子(GCT)的克隆，接種于LB液態培養基擴增。以Wizard Plus Minipreps試劑盒,抽提突變重組質粒。突變的人精氨酸酶I (rhArgl)序列中303位半胱氨酸替換為丙氨酸的重組人精氨酸酶I表示為rhArg1-A303;168位半胱氨酸替換為丙氨酸的重組人精氨酸酶I表示為rhArg1-A168 ;45位半胱氨酸替換為丙氨酸的重組人精氨酸酶I表示為rhArg1-A45 ; 168和303位半胱氨酸替換為丙氨酸的重組人精氨酸酶I表示為rhArg1-A168/303 ；45和303位半胱氨酸替換為丙氨酸的重組人精氨酸酶I表示為rhArg1-A45/303 ；45和168位半胱氨酸替換為丙氨酸的重組人精氨酸酶I表示為rhArg1-A45/168 ;45，168和303位半胱氨酸替換為丙氨酸的重組人精氨酸酶I表示為rhArg1-A45/168/303 ;含有上述突變的人精氨酸酶I (rhArgl)序列的重組突變質粒分別稱為 pET30a (+)-rhArg1-A303, pET30a(+)-rhArg1-A168, pET30a(+)-rhArg1-A45,pET30a(+)-rhArg1-A168/303, pET30a(+)-rhArg1-A45/303, pET30a(+)-rhArg1-A45/168,或pET30a(+)-rhArg1-A45/168/303。將100 U I BL21 (DE3)感受態細胞置于冰上融化，向感受態細胞懸液中加入I U I所述已構建的突變重組質粒，混勻后冰浴放置30分鐘，然后將混合物于42°C水浴放置90秒，再快速轉移至冰浴中放 置2分鐘。加入500 u I LB液體培養基，于37°C，150rpm震蕩培養I小時。取200iil涂布含有卡那霉素的LB營養瓊脂平板，37°C倒置培養16小時。挑選所述轉化細胞培養平板單一菌落并轉移到25mL LB培養基。所述細胞在370C，150rpm震蕩培養至0D600nm達到0.6-0.8，加入終濃度為0.2mM IPTG誘導表達3小時。以聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測所挑選克隆是否有目的蛋白的表達。挑選表達量較高的克隆制備甘油菌保存作為工程菌。實施例四:含定點突變精氨酸酶I (rhArgl)質粒的表達和純化將上述轉化了突變人精氨酸酶I(rhArgl)質粒的大腸桿菌工程菌(包括pET30a(+)-rhArg1-A303, pET30a(+)-rhArg1-A168/303, pET30a(+)-rhArg1-A45/303,pET30a (+) -rhArg1-A45/168,或 pET30a (+)-rhArgI_A45/168/303)在 15L 發酵罐中以分批補料的方式培養，當0D600nm達到12-13時，加入終濃度為0.2mM IPTG誘導表達3_4小時。將所獲得的菌體進行破菌離心，取上清液進行下一步的分離純化。目的蛋白的純化采用CM陽離子交換層析。先用Tris-HCl平衡液平衡層析柱，然后將所述離心得到的上清液上樣，上樣完畢后繼續用3倍柱體積的平衡液沖洗弱結合的雜質。待UV280nm檢測值穩定后，用含有Tris-HCl及NaCl的洗脫液進行洗脫，收集目的峰，由此獲得定點突變的精氨酸酶 I rhArgI_A303, rhArgI_A168/303, rhArgI_A45/303,rhArg1-A45/168,或 rhArgI_A45/168/303。對收集的樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和高壓液相色譜分析純度。經上述層析方法所獲得的精氨酸酶的純度為90%以上。實施例五:定點突變精氨酸酶I (rhArgl)的活性通過測定與尿素酶和谷氨酸脫氫酶相偶聯的NADPH的吸光度值測定精氨酸酶的活性，其原理如下所示，NADPH被氧化成NADP+，前者在340nm處有最大吸收峰，測定在該波長下吸光率的降低，再根據NADPH的摩爾消光系數ΛΕ340 = 622(^1^1,即可計算出精氨
酸酶的活性。
權利要求
1.一種精氨酸酶，其特征在于，所述精氨酸酶為人精氨酸酶I，其由SEQID N0.1定義的氨基酸序列中第45，168和303位的半胱氨酸中的一個、兩個或三個突變為非極性氨基酸。
2.權利要求1所述的精氨酸酶，其中所述第45，168和303位的半胱氨酸獨立優選的，突變為丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸，最優選的，突變為丙氨酸。
3.權利要求1或2所述的精氨酸酶，其特征在于所述精氨酸酶的第45，168和303位的半胱氨酸中的一個發生突變，優選的，第303位半胱氨酸突變，更優選的，突變為丙氨酸。
4.權利要求1-3中任一項所述的精氨酸酶，其特征在于所述精氨酸酶的第45，168和303位的半胱氨酸中的任意兩個發生突變，例如第45位和第303位半胱氨酸突變，第168位和第303位突變，或第168位和第45位突變，優選突變為丙氨酸。
5.權利要求1-3中任一項所述的精氨酸酶，其特征在于所述精氨酸酶的第45位、第168位和第303位半胱氨酸突變，優選突變為丙氨酸。
6.一種聚乙二醇化的精氨酸酶，其特征在于，所述精氨酸酶為人精氨酸酶I，所述聚乙二醇化是位點特異性的，在由SEQ ID N0.1定義的氨基酸序列中的第45，168和303位的一個或兩個半胱氨酸位點發生聚乙二醇化。
7.權利要求6所述的聚乙二醇化的精氨酸酶，其中所述定點聚乙二醇化是通過對精氨酸酶上不進行聚乙二醇化的一個或兩個半胱氨酸位點對半胱氨酸進行基因工程定點突變為其它氨基酸，然后對突變后的精氨酸酶進行半胱氨酸特異性聚乙二醇化修飾實現。
8.權利要求7所述的聚乙二醇化的精氨酸酶，其中所述點突變是將精氨酸酶的半胱氨酸突變為非極性 氨基酸，優選的，突變為丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，最優選的，突變為丙氨酸。
9.權利要求6-8中任一項所述的聚乙二醇化的精氨酸酶，其中所述PEG的平均分子量為 20K、30K 或 40K。
10.權利要求6-9中任一項的聚乙二醇化的精氨酸酶，其中所述精氨酸酶在血液或血清中的半衰期為至少0.5天，優選至少2.5天，最優選至少3.5天。
11.制備權利要求1-5中任一項的精氨酸酶或權利要求6-10中任一項的聚乙二醇化的精氨酸酶的方法。
12.權利要求1-5中任一項的精氨酸酶或權利要求6-10中任一項的聚乙二醇化的精氨酸酶在治療與精氨酸酶有關的疾病的藥物中的用途，優選的，所述疾病選自高精氨酸血癥和精氨酸依賴性的細胞增生或腫瘤，例如肝癌，黑色素細胞瘤，乳腺癌，小細胞肺癌，前列腺癌，淋巴癌或白血病。
13.一種治療與精氨酸酶有關的疾病的藥物組合物，其中含有權利要求1-7中任一項的精氨酸酶或權利要求6-10中任一項的聚乙二醇化的精氨酸酶，其中所述疾病選自高精氨酸血癥和精氨酸依賴性的細胞增生或腫瘤，例如肝癌，黑色素細胞瘤，乳腺癌，小細胞肺癌，前列腺癌，淋巴癌或白血病。
全文摘要
本發明提供了一種點突變的精氨酸酶及其制備方法，以及所述點突變的精氨酸酶在制備治療與精氨酸酶相關的疾病的藥物中的用途。本發明還提供了一種位點特異性聚乙二醇化的精氨酸酶及其制備方法，以及所述聚乙二醇化的精氨酸酶在制備治療與精氨酸酶相關的疾病的藥物中的用途。
文檔編號C12N11/08GK103184208SQ20121006960
公開日2013年7月3日 申請日期2012年3月16日 優先權日2011年12月27日
發明者鄭寧民, 陳麗 申請人:拜奧生物科技(上海)有限公司