專利名稱：共表達兩種亞型豬流感病毒ha基因重組腺病毒的制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種共表達兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，特別是涉及ー種共表達HlNl與H3N2亞型豬流感病毒血凝素蛋白重組腺病毒的構建；兩種血凝素之間的linker FMDV 2A為重組腺病毒中不同血凝素蛋白的単獨表達提供了新的手段，為H3、Hl亞型豬流感病毒雙價核酸疫苗的研制提供病毒模型，也為進一歩研究開發基因工程疫苗奠定了基礎。
背景技術：
豬流感(swine influenza, SI)是由豬流感病毒(SIV)引起的ー種急性高度接觸性傳染病，単獨感染發病率高、死亡率低，臨床上常與豬繁殖與呼吸綜合征、豬傳染性胸膜肺炎等并發或繼發感染，導致患病動物生產性能下降或死亡，給養豬業造成較大經濟損失。除此之外，豬作為人流感和禽流感病毒的“混合器”，在流感病毒種間傳播及流行病學研究中占據重要地位。近來，HlNU H1N2和H3N2亞型流感病毒一直在世界豬群中共同流行，豬流感的病原學和血清學調查顯示，HlNl和H3N2亞型已成為在我國豬群中廣泛流行的優勢毒株。目前，主要是通過接種疫苗來預防該病的發生。常規滅活疫苗對該病的免疫防制存在不足之處，而弱毒疫苗則存在潛在的生物安全問題。因此，開發新型、高效、廉價、安全的疫苗勢在必行。隨著分子生物學技術的飛速發展，學者們不斷進行著新型基因工程流感疫苗的研究。HA蛋白為SIV的表面糖蛋白，病毒感染后能夠誘導機體產生特異性抗HA蛋白的抗體，該抗體具有病毒中和作用，因此，HA基因在流感病毒基因工程疫苗中被作為重要的革巴抗原。腺病毒表達系統具有穩定且易調控、表達外源抗原活性高、免疫途徑廣泛、安全高效等優點。多種人類和動物病原基因的重組腺病毒的成功構建與應用結果表明重組腺病毒能夠誘導機體產生強烈的體液免疫和細胞免疫反應，能夠抵御相應病原的致死性侵襲，在動物疫苗方面顯示出良好的應用前景。FMDV 2A具有自剪切功能，2個外源基因之間以2A序列連接形成一個完整的0RF。翻譯時融合蛋白可在編碼2A區域的C端被2A切開，將融合蛋白切割分離為兩個獨立的蛋白(Mattion et al.，1996)。FMDV 2A基因其短小的基因序列和2A高效的自剪切效率為ニ價基因疫苗的研制提供了新的手段。

發明內容
本發明的目的在于提供一種共表達兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，其構建ー株以FMD 2A為linker共表達HlNl與H3N2亞型豬流感病毒血凝素蛋白重組腺病毒，為H3、H1亞型豬流感病毒雙價核酸疫苗的研制提供病毒模型，也為SIV腺病毒活載體疫苗的研制奠定基礎，采用第三代腺病毒載體，它突出的優點是缺失全部的腺病毒蛋白編碼序列，感染后沒有病毒蛋白表達，降低了機體的免疫反應和細胞毒性，提高了安全性。
本發明的技術方案是這樣實現的共表達兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，其特征在于首先分別設計針對HlNl與H3N2亞型豬流感病毒HA蛋白及FMD 2A的基因序列，然后將其與酶切后的腺病毒穿梭載體連接，經PCR和測序鑒定；將鑒定正確的重組穿梭質粒轉化入含有腺病毒骨架質粒的大腸桿菌BJ5183感受態進行同源重組，獲得重組腺病毒質粒；然后用Pac I線性化后轉染293細胞，在293細胞內包裝出重組腺病毒；通過熒光顯微鏡觀察、PCR檢測，證明血凝素基因已成功克隆入腺病毒載體。并通過小鼠免疫試驗驗證獲得的重組腺病毒可以同時對此兩種亞 型豬流感的攻擊提供一定的保護。具體步驟如下
1.針對HlNl和H3N2亞型SIVHA基因及FMD 2A基因的設計
從GenBank上下載HlNl和H3N2亞型SIV毒株HAl基因及FMD 2A的序列，擴增基因的特異性引物由上海生エ生物工程技術服務有限公司合成設計。見表I針對HlNl和H3N2亞型SIV毒株HAl基因及FMD 2A基因的引物序列。
2.重組穿梭載體的構建
將擴增得到的H1HA1-2A與酶切線性化的pAdTrack載體16°C連接過夜，將連接產物轉化入DH5a感受態細胞中，通過PCR、酶切篩選正確克隆，將得到的重組穿梭載體質粒線性化后與H3HA1連接并轉化入DH5a感受態細胞，經鑒定得到重組腺病毒穿梭質粒。如圖I所示。3.重組腺病毒質粒的構建及重組腺病毒的獲得
將線性化的重組穿梭質粒轉化進攜帶腺病毒骨架質粒的大腸桿菌BJ5183感受態細胞，進行同源重組，得到重組腺病毒質粒。將重組腺病毒質粒線性化后轉染293T細胞進行病毒包裝，包裝后，收獲細胞培養物進行純化和鑒定。如圖2所示。4.重組腺病毒的鑒定
使用重組腺病毒原液感染293T細胞，在熒光顯微鏡下觀察重組毒所攜帯的GFP蛋白的表達情況，待出現明顯細胞病變時收集細胞，反復凍融后，離心后取上清進行PCR鑒定。如圖3，4所示。5.重組腺病毒的小鼠免疫試驗
用重組病毒免疫6周齡的雌性昆明鼠,兩周后再次免疫,ニ免后兩周用HlNl和H3N2SIV進行攻毒，測攻毒后免疫保護率。通過檢測小鼠對病毒攻擊的保護情況評價該重組病毒的免疫原性。本發明的積極效果是將不同亞型SIV HA基因以串聯方式插入到同一株腺病毒載體上，即用質粒pUM-T、腺病毒穿梭質粒pAdTrack、腺病毒骨架質粒pAdEasy-Ι等，經一系列中間過程，得到基因表達質粒等中間產物，將最后得到的重組腺病毒質粒轉染293細胞；根據腺病毒感染形成的細胞病變及GFP基因表達可見緑色熒光兩方面來篩選重組病毒，用PCR鑒定該重組腺病毒。該重組腺病毒為H3、H1亞型豬流感病毒雙價核酸疫苗的研制提供病毒模型，也為進一歩研究開發基因工程疫苗奠定了基礎。2009年3月至今，流行于全球許多國家人群中的HlNl亞型流感進ー步突出了 SI在人類公共衛生方面具有的潛在危害性，研制高效、安全的疫苗為SI的防制提供物質儲備，已經不單單具有獸醫學的研究意義，同時對保障人類的生命安全也具有重要意義。


圖I為重組腺病毒穿梭載體PCR和酶切鑒定結果，M:DL2000。圖2為重組腺病毒質粒PCR和酶切鑒定結果，M:DL15000。圖3為重組腺病毒PCR鑒定結果，M:DL15000。圖4為重組腺病毒二次接種293T細胞結果。
具體實施例方式下面結合具體實例對本發明做詳細說明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例I目的基因引物設計及重組穿梭載體構建
根據GenBank數據庫提供的HlNl和H3N2亞型SIV HAl及FMD 2A的核酸序列設計引物，并在HA及2A基因上、下游分別引入限制性酶切位點。將H1-2A與經內切酶Sal I和Xho I雙酶切后線性化的pAdTrack載體連接，轉化感受態大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆進行PCR及測序鑒定(上海生エ公司進行測序分析)。鑒定陽性克隆的引物序列
F :5’-ACGCGTCGACAAAATGAAGGCAATACTAGTGTT-3，
R :5’-CGCTCGAGGGGCCCTGGGTTGGACTCGACGTCGCCGGCCAACTTGAG-3，
PCR反應循環條件95°C預變性Imin ;95°C變性30s，60°C退火40s，72°C延伸50s (30個cycles);最后 72°C延伸 IOmin0將鑒定正確的重組載體經Xho I和Xba I線性化后與H3連接，轉化DH5 α感受態，挑取陽性克隆進行PCR及測序鑒定(上海生エ公司進行測序分析)。鑒定陽性克隆的引物序列
F :5’-ACGCGTCGACAAAATGAAGGCAATACTAGTGTT-3’，
R :5’-GCTCTAGAGCTCAGCCTCTAGTTTGTTTCT-3’
PCR反應循環條件95°C預變性Imin ;95°C變性30s，59°C退火40s，72°C延伸90s (30個cycles);最后 72°C延伸 IOmin0實施例2重組腺病毒質粒的構建及重組腺病毒的獲得
如圖1-3所示，將重組腺病毒穿梭質粒用限制性內切酶Pme I線性化、純化回收后，轉化含有腺病毒骨架質粒pAdeasy-Ι的BJ5183感受態細胞進行同源重組。Kan抗性篩選后提取質粒，對提取后的質粒用Pac I進行酶切鑒定和PCR鑒定。為了獲得大量高質量的重組質粒，將篩選的陽性重組腺病毒質粒轉化于宿主菌DH5ci擴增。用核酸內切酶Pac I將從宿主菌DH5 α量擴增的重組腺病毒質粒線性化后，純化回收。以含10%胎牛血清的DMEM培養基培養293Τ細胞，4Χ IO5/孔接種到六板中，每孔含3mL培養基，在37°C的CO2培養箱中培養16h。將5μ FuGENG HD轉染試劑與2Pg純化回收得到的重組腺病毒質粒DNA溶液加入到500μ1無血清，無雙抗的DMEM培養液，混合均勻，室溫溫育20min。將DNA與混合液轉移至293T細胞的培養液中混勻，于37°C、5% CO2細胞培養箱中培養，37°C孵育6h后加入含10%血清的DMEM 3mL,繼續培養7 10d，并在熒光顯微鏡下觀察GFP表達狀況，了解腺病毒包裝過程，待有較明顯的熒光或明顯的細胞病變后，于-80°C /37°C反復凍融3次，收集于IOmL離心管中，以10000r/min離心IOmin,收集上清即為收獲的病毒原液，按I : 10的比例感染新的293T細胞，如此反復制備出3代重組
腺病毒。實施例3重組腺病毒的鑒定
如圖4所示，重組腺病毒再次感染293細胞48h后，倒置熒光顯微鏡下可見GFP表達，證明重組腺病毒基因組中有GFP基因，符合預期結果。按照Wizard SV GenomicDNA Purification System試劑盒操作步驟提取重組腺病毒的基因組DNA,以I μ L (50 IOOng)基因組 DNA 為模板，Mgcl2 I μ L，dNTP I. 5 μ L，DEPC 水 20 μ L，上下游引物各 O. 5 μ L(IOpmoI / μ L), Taq 酶 O. 5 μ L,總體系 25 μ しF:5’-ACGCGTCGACAAAATGAAGGCAATACTAGTGTT-3’
R:5’-GCTCTAGAGCTCAGCCTCTAGTTTGTTTCT-3’PCR反應循環條件95°C預變性Imin ;95°C變性30s，59°C退火40s，72°C延伸90s (30個cycles);最后 72°C延伸 IOmin0
實施例4重組腺病毒的小鼠免疫試驗
把7周齡的昆明鼠隨機分成3組，每組10只。第一組用rAd-Hl-2A-H3免疫，第二組用rAd-GFP免疫，第三組用PBS免疫。在初免后2周加強免疫一次，采用皮下注射的方式，免疫劑量為IX 108TCID50。在加強免疫后2周，用106EID50的HlNl和H3N2通過滴鼻法對三組攻毒,姆只小鼠50 μ I0
權利要求
1.共表達兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，其特征在于首先分別設計針對HlNl和H3N2亞型SIV HA及FMD 2A引物序列，然后將其與酶切后的腺病毒穿梭載體PAdTrack連接，經PCR和測序鑒定；將鑒定正確的重組腺病毒穿梭載體轉化入含有腺病毒骨架質粒pAdEasy-Ι的大腸桿菌BJ5183感受態細胞，進行同源重組，經PCR和酶切鑒定得重組腺病毒質粒；將得到的重組腺病毒質粒線性化后轉染293T細胞，進行重組腺病毒的包裝；包裝后將得到的病毒原液感染293T細胞或MDCK細胞，48h后觀察熒光蛋白表達情況，并通過PCR方法鑒定，具體步驟如下I)根據GeneBank上HlNl和H3N2亞型SIV HA及FMD2A序列設計引物；2)HA序列與pAdTrack載體連接，轉化，挑去菌落，應用OMEGA質粒提取試劑盒提取質粒，通過PCR，酶切及測序鑒定結果顯示該重組腺病毒穿梭質粒構建成功；3)重組腺病毒穿梭質粒與骨架質粒在大腸桿菌BJ5183感受態中同源重組，得到重組腺病毒質粒后轉染293T細胞進行包裝；4)將轉然后得到的病毒原液感染293T細胞，48h后觀察熒光蛋白表達情況，并提取細胞基因組DNA，通過PCR方法檢測HA基因序列；5)用重組病毒免疫6周齡的雌性昆明鼠,在ニ免后兩周用HlNl和H3N2 SIV進行攻毒,測攻毒后免疫保護率以評價該重組病毒對小鼠的免疫保護效果。
2.根據權利要求I所述的ー種共表達兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，其特征在于所述的HA基因與含有CMV啟動子的腺病毒穿梭載體pAdTrack組建成重組腺病韋穿梭質粒 pAdTrack_Hl_2A_H3。
3.根據權利要求2所述的ー種共表達兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，其特征在于所述的重組腺病毒載體的構建如下1)制備含有腺病毒骨架質粒PAdEasy-I的大腸桿菌BJ5183感受態細胞，2)將得到的重組腺病毒穿梭質粒經限制性內切酶Pme I單酶切后轉化含有腺病毒骨架質粒pAdEasy-Ι的大腸桿菌BJ5183感受態細胞，進行同源重組，挑取陽性克隆進行PCR及酶切鑒定。
4.根據權利I所述的ー種共表達兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，其特征在于兩種目的基因之間以FMDV 2A為linker，FMDV 2A具有自剪切功能，翻譯時融合蛋白可在編碼2A區域的C端被2A切開，分別表達為兩個獨立的蛋白。
全文摘要
本發明涉及一種共表達兩種亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒的制備，其特征在于首先分別設計針對H1N1和H3N2亞型SIVHA及FMD2A引物序列，然后將其與酶切后的腺病毒穿梭載體pAdTrack連接，進行同源重組，經PCR和酶切鑒定得重組腺病毒質粒；將得到的重組腺病毒質粒線性化后轉染293T細胞，包裝后將得到的病毒原液感染293T細胞或MDCK細胞。該重組腺病毒為H3、H1亞型豬流感病毒雙價核酸疫苗的研制提供病毒模型，也為進一步研究開發基因工程疫苗奠定了基礎。2009年3月至今，流行于全球許多國家人群中的H1N1亞型流感進一步突出了SI在人類公共衛生方面具有的潛在危害性，研制高效、安全的疫苗為SI的防制提供物質儲備。
文檔編號C12N15/861GK102719479SQ201210069489
公開日2012年10月10日 申請日期2012年3月16日 優先權日2012年3月16日
發明者丁壯, 叢彥龍, 劉慧 , 朱利塞, 李鑫, 楊建新, 樊嬌, 郭育培, 韓明明, 黃志強 申請人:吉林大學