專利名稱：用于棉花種子鑒定的引物和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種鑒定棉花品種的方法，屬于分子生物學技術領域。
背景技術：
棉花是紡織工業的主要原料。我國棉花年產量在500萬噸左右，價值量在750億元左右，是僅次于糧食的第二大農作物，全國有2億多農民直接參與棉花的生產。紡織業產業鏈長，目前我國纖維加工量已占世界的48%。近年來，石油價格上漲推高了化纖成本，促使紡織企業提高用棉比例，棉花和化纖的比例已達到1:1。隨著全球經濟的復蘇，紡織品需求上升，國內棉花需求還將保持增長態勢。
新疆棉花基地的戰略地位十分重要，其作用不可替代。新疆是我國最大的優質棉、 商品棉生產基地和出口基地，棉花總產、單產、種植面積已連續18年穩居全國首位，棉花產量占全國總產量的40%。棉花是新疆經濟支柱產業，原棉產值達到300億元，占全疆種植業產值的65%和農林牧漁業總產值的1/3 ;棉花收入占全區農民收入的35%，占南疆主產區農民收入的60% ;棉花加工產值占全疆工業產值的60-80% ;全疆15%的財政收入、產棉縣 50%的財政收入來自棉花及其相關產業。“十一五”期間，新疆棉 花種植面積穩定在2100萬畝以上，棉花產量保持在250-300萬噸。2003年以來新疆累計調出棉花1800多萬噸，超出同期全國棉花進口量200多萬噸；2004至2006年，我國棉花年進口增至364萬噸，進口依存度由28%上升至38% ;2006-2008年新疆年均調出棉花300萬噸，有力地支持了我國棉紡工業的高速發展，也為保持國內棉花70%的自給率奠定了基礎。假如沒有新疆棉花的支撐，我國對國際棉花市場的依存度將超過50%以上，棉花產業將重蹈大豆、油脂產業的覆轍。
新疆棉花發展潛力大，今后在全國棉花產業中的地位更加重要。通過優化生態布局，棉花生產形成了北疆早熟棉區和南疆早中熟棉區等主產區。新品種應用，在提高單產、 改善品質方面起到了決定性作用。在栽培上，新疆棉花單產提高主要依靠增加密度，靠大群體提高總鈴數，實現產量突破。技術上，推廣矮密早栽培技術、膜下滴灌技術、平衡施肥技術。全區棉花單產2009年已達到119公斤，比1995年增長33%，高于全國其它地區平均單產35公斤。其中，兵團平均單產達到155公斤。新疆棉花品質好、品級高，平均紗支達到 36支，比全國平均紗支水平高4支。
近年來，隨著新疆棉花生產的快速發展，病蟲害日危害加重。新疆棉花生產要求選育適合當地棉花生產發展，適應市場需求的豐產潛力大、穩產性好、適應性強的新品種。品種研發滯后，影響棉花核心競爭力提高。進一步拓寬遺傳基礎，加強產量和抗性育種，選育不同纖維類型的高品質棉花新品種、實現纖維類型生產多元化有重要意義。
目前新疆棉花每年的用種需求量巨大，每年達10萬噸以上。在如此巨大的用種量需求下，生產中假劣偽冒、套牌貼牌種子時有發生，常給育種家、種子企業和棉農帶來巨大損失，同時這種混亂的局面也不利于種子管理部門的監管，為保證新疆棉花生產的正常發展和種子市場的規范管理，建立一套行之有效、簡單快速檢測技術顯得尤為必要。
DNA指紋圖譜技術快速發展，為品種鑒定、純度檢測、品種親緣關系與分類研究及品種專利權的正當維護等提供了很好的解決途徑。DNA指紋圖譜是指能夠鑒別生物個體之間差異的DNA電泳圖譜，它是建立在DNA分子標記的基礎之上的。這種電泳圖譜多態性豐富，具有高度的個體特異性和環境穩定性，就象人的指紋一樣，因而被稱為“指紋圖譜”。指紋圖譜是鑒別品種、品系(含雜交親本、自交系)的有力工具，具有快速、準確等優點。因此指紋圖譜技術非常適合于品種資源的鑒定工作。該技術已在各種作物品種資源和純度鑒定研究中得到應用，并發揮著越來越重要的作用。正是在這樣的市場環境大背景下，開展新疆棉花品種指紋圖譜技術的建立與應用對解決上述問題具有重要作用。
DNA指紋圖譜技術現狀
眾所周知，作物品種資源作為 國家的重要戰略資源之一，它是作物高產穩產的重要基礎，在未來的生命科學和農業科學研究領域中將占據越來越重要的地位(Tanksley and McCouch，1997)。目前，我國種子生產和經營單位管理還不太規范，不合格種子，甚至假種屢屢混入市場并用于生產，造成糧食減產，同時也極大地損害了品種專利擁有者的利益和農民的經濟利益，因此進行品種資源鑒定顯得尤為重要。早期，人們多采用形態學方法對品種進行識別，即植物的外部特征特性，如株高、穗長、粒色、干粒重等。該方法簡便、經濟，但是由于許多形態學性狀鑒定周期長、受環境影響大(劉勛甲等，1998，湖北農業科學，(I):33-35 ； (3) 27-32 ;梁明山等，2001)，并且隨著育種親本的利用集中化，品種鑒定愈來愈困難，傳統的形態學方法已越來越不適應品種鑒定和純度分析的需要。
近年來，隨著生物技術的不斷發展，誕生了一系列DNA分子標記技術，如限制性片段長度多態性(restfiction fragment length polymorphism,簡稱 RFLP)、隨機擴增多態性DNA (random amplified polymorphic DNA,簡稱RAPD)、擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism,簡稱 AFLP)、簡單序列長度多態性 (simple sequence length polymorphism,簡稱 SSLP)、隨機擴增微衛星多態性(random amplified micro-satellite polymorphism,簡稱RAMP)、序列標簽位點(sequence-tagged sites,簡稱 STS)、DNA 擴增指紋(DNA amplified fingerprinting, DAF)、擴增子長度多態性(amplicon length polymorphism,簡稱 ALP)、特異擴增子多態性(specific ampiliconpolymorphism,簡稱 SAP)、單鏈構象多態性(singlestrand conformation polymorphi sm,簡稱 SSCP)和單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,簡稱 SNPs)等(李梅芳和周開達，2001 ;鄒喻蘋和葛頌，2003 ;王忠華，2005)。
與上述形態標記相比，DNA分子標記具有以下多種優點(I)直接以遺傳物質DNA 的形式表現，在生物體的不同組織和發育時期均可檢測到，受季節和環境的影響較少；(2) 數量多、分布廣，遍及整個基因組；(3)多態性高，自然存在著許多等位變異，不需專門創造特殊的遺傳材料；(4)表現為“中性”，即不影響目標性狀的表達，與不良性狀無必然的連鎖；(5)有許多分子標記表現為共顯性(codominance)，能夠鑒別出作物品種或品系的純合基因型與雜合基因型，為育種利用提供極大的便利(賈繼增，1996)。遺傳標記主要分為形態標記、細胞學標記、生化標記、分子標記等四品種型。
形態標記形態標記是一種外部形態特征，如矮桿、變態葉、雄性不育等。從形態學或表型性狀來檢測遺傳變異是最直接也最簡便易行的方法。廣義形態標記包括色素、生理特性、生殖特性抗病蟲性等有關的標記。由于表型和基因型之間存在著基因表達、調控、個體發育等復雜的中間環節，如何根據表型上的差異來反映基因型上的差異就成為形態學方法檢測遺傳變異的關鍵所在。棉花中通常所用的表型性狀包括株高、子葉節高、主莖茸毛、 果枝數、株型、鈴形、葉形、鈴的大小、葉片裂缺等。形態標記缺點是數量較少，遺傳表達有時不太穩定，易受環境條件及基因顯隱性的影響。
細胞學標記細胞遺傳學研究發現，染色體核型(染色體數目、大小、隨體有無、著絲粒位置等)和帶型(C帶、N帶、G帶等)分析可測定基因所在的染色體及相對位置，也可通過染色體置換等進行基因的定位。染色體數目的變化(如單體、缺體、三體、四體)和染色體結構的變異(如缺失、易位、倒位、重復等)也都各有其特定的細胞學特征，也可作為一種細胞標記。顯然，細胞學標記的數目也很有限。對于染色體數目相同的物種，用細胞學標記很難區別。
生化標記生化標記也叫蛋白質標記，主要包括等位酶和同工酶標記。這品種型標記不易受環境影響，能很好的反映遺傳多樣性。但其檢測手段復雜，數量有限，不能滿足標記輔助選擇的需要。
分子標記20世紀80年代以后發展起來的分子標記技術是以DNA多態性為基礎的遺傳標記。分子標記具有遺傳多態性高、共顯性，信息完整、在基因組中大量存在且均勻分布、選擇中性、穩定性、重現性好、信息量大，分析效率高、檢測手段簡單快捷、開發和使用成本低等特點。因此，分子標記技術自出現以來被廣泛應用在作物遺傳育種、植物親緣關系鑒別、物種起源演化、遺傳多樣性分析、基因組作圖、基因定位、基因庫構建等方面。現在DNA 標記技術已有數十種，而且技術本身也被不斷的改進和發展。
根據分子標記產生的特點，通常可以將之分為五類。
第一類以Southern雜交技術為基礎，如限制性片段長度多態性(RFLP)。
第二類以PCR技術為基礎，如隨機擴增多態性DNA(RAPD)、序列標簽位點(STS)、 表達序列標簽(EST)、序列特征擴增片段(SCAR)、酶切擴增多態性(CAP)、擴增片段長度多態性(AFLP)。
第三類以重復序列為基礎，如簡單序列重復(SSR)、簡單序列間重復(ISSR)、單核苷酸多態性(SNP)。
第四類以單鏈構象多態性為基礎，如單鏈物質多態性(SSCP)。
第五類原位雜交技術(ISH)，包括熒光原位雜交(FISH)、原位雜交(GISH)等。
本發明技術應用情況
SSR(simple sequence r印eat),簡單序列重復，又稱微衛星DNA (microsatellite DNA)，是近幾年在PCR基礎上發展起來的第二代分 子標記。SSR是一種真核生物基因組中普遍存在的重復序列，重復序列一般由1-6個堿基組成，重復次數在不同物種或同一物種不同基因型之間是高度可變的。這些重復序列兩端大多是保守的單拷貝序列，因此可以根據保守序列設計特異引物，通過PCR技術將中間的核心重復序列擴增出來，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析技術可獲得其長度多態性(張立榮等，2002)。SSR具有RFLP的所有遺傳學優點，且避免了 RFLP技術中的使用放射性同位素的缺點，又比RAPD的重復性和穩定性高，因而目前已成為遺傳標記中的研究熱點。
但是，如何獲得合適的引物組，既能提到種子鑒定的能力，又不過多的增加工作量是本領域亟待解決的技術問題。發明內容
本發明針對現有鑒定方法周期長，為棉花品種的生產鑒別提供了有力工具，本發明采用如下的技術方案
本發明一方面涉及一種鑒定棉花品種的方法，其特征在于包括如下步驟
待測樣品棉花總DNA提取與純化；
測定棉花總DNA純度和濃度的；
采用引物組中的引物分別對棉花總DNA進行PCR擴增反應；
對擴增產物同時進行凝膠電泳，并獲取凝膠電泳圖像；
將凝膠電泳圖像與標準譜圖進行比對以確定棉花類型。
所述的引物組包括以下60對引物
權利要求
1.一種鑒定棉花品種的方法，其特征在于包括如下步驟待測樣品棉花總DNA提取與純化；測定棉花總DNA純度和濃度的；采用引物組中的引物分別對棉花總DNA進行PCR擴增反應； 對擴增產物同時進行凝膠電泳，并獲取凝膠電泳圖像； 將凝膠電泳圖像與標準譜圖進行比對以確定棉花類型。所述的引物組包括以下6 O對引物
2.根據權利要求1所述的鑒定棉花品種的方法，所述的引物組所包括的其它引物不超過15對，優選的不超過10對，進一步優選的不超過5對，更進一步優選不含有其它引物對。
3.權利要求1或2所述的鑒定棉花品種的方法，其特征在于所述的棉花種子優選是新疆棉花種子，進一步優選是新疆陸地棉種子。
4.根據權利要求3所述的鑒定棉花品種的方法，其特征在于還包括構建新疆棉花種子標準譜圖的步驟。
5.根據權利要求1-4任意一項所述的鑒定棉花品種的方法，所述的鑒定是指鑒定棉花品種的純度和/或真偽。
全文摘要
本發明公開了一種用于棉花種子鑒定的引物組及其試劑盒，其包括60對核心引物，本發明的核心引物組為棉花品種的生產鑒別提供了有力工具，具有快速、準確等優點，也為今后生產中發生的假冒偽劣、套牌冒牌等坑農害農事件的發生提供了強有力的鑒別工具，為當地種子管理部門處理問題種子糾紛提供了可靠方法和技術保證，極大地保護了棉花育種者、種子生產經營單位和廣大棉農的生產利益。通過本套核心標記進行品種的指紋圖譜進行鑒定，無需再進行分子標記的大量篩選，節約成本和時間，達到事半功倍的效果。
文檔編號C12Q1/68GK103060430SQ20121007696
公開日2013年4月24日 申請日期2012年3月22日 優先權日2012年3月22日
發明者艾先濤, 李雪源, 華金平, 王俊鐸, 鄭巨云, 吐爾遜江, 梁亞軍, 孫杰, 多力坤, 沙紅, 莫明, 孫國清, 劉建喜, 馬玄, 郭江平, 龔照龍 申請人:艾先濤